Bone broth unlikely to provide reliable concentrations of collagen precursors compared to supplemental sources of collagen used in collagen research

要旨

コラーゲン源の食事摂取は、様々な組織におけるコラーゲンの合成をサポートする可能性があり、その有効性には主要なアミノ酸の利用可能性が寄与していると考えられる。本研究では、一般的に消費されている骨スープの調製品を分析し、そのアミノ酸含有量と一貫性を評価した。標準化および可変（非標準化）プロトコルで作られた市販および実験室で調製されたサンプルは、主要なアミノ酸（グリシン、リジン、プロリン、ロイシン、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジン）のために分析された。研究の主な知見は、標準化されたレシピに作られたボーンブロス中のアミノ酸濃度は、ヒドロキシプロリン、グリシン、プロリン; P = 0.003およびヒドロキシリジン、ロイシンおよびリジン; P = 0.004のために有意に低いことであった参照コラーゲンサプリメント（P > 0.05）の潜在的に治療的な用量（20 g）によって提供されるものと比較して。標準化されていないレシピで作られたボーンブロスのアミノ酸含有量には大きなばらつきがあり、すべてのアミノ酸の最高レベルはカフェで調製された品種で発見された。標準化された調理法では、市販のボーンブロスは、自己調理された品種よりもすべてのアミノ酸において低かった。標準化されたレシピに従って調製した場合のボーンブロスの異なるバッチのアミノ酸含有量に差（P > 0.05）はなかった。コラーゲン前駆体の摂取が生体内での新しいコラーゲンの合成をサポートすることが証明されている場合、ボーンブロスがキーアミノ酸の一貫した信頼性の高い供給源を提供できるとは考えにくい。食事源からのキーアミノ酸の供給に焦点を当てることは、現在研究されている標準的な供給源に焦点を当て続けるべきである。

序論

コラーゲンは最も豊富な体のタンパク質であり、総タンパク質貯蔵量の約3分の1を占めている。筋骨格系および結合組織の余分な細胞マトリックス内では、コラーゲンは、力の伝達および関節の安定性に寄与し、そうでなければ傷害に寄与する可能性のある力および急激な方向転換に対する抵抗力を提供する(Baar, 2015)。組織の全体的なコラーゲン含有量およびコラーゲン分子の架橋の両方が、より高いレベルの組織剛性および安定性に寄与する（Kadler et al 2007; Kjaer et al 2009）。より高い断面積を有する結合組織、およびおそらくより高いコラーゲン含有量および／または密度を有する結合組織は、ひずみに対する耐性がより高く、より高い負荷に耐えることができるかもしれない（Couppe er al)。
骨格筋タンパク質合成における運動と栄養の間の有益な相互作用の一貫した証拠は、このプロセスを最適化するための明確な推奨事項につながっている;これらには、タンパク質合成のための別の刺激を提供するロイシンと、新しい筋タンパク質の構築のための前駆体としてサービスを提供する他のアミノ酸（Atherton et al 2012; Phillips et al 2011）と運動を組み合わせた特定のアミノ酸の摂取タイミングと用量が含まれている。栄養戦略は、成長を強化し、および/またはコラーゲン組織の修復を支援することができるかどうかは、現在調査中であり、高齢化人口（筋肉量の年齢に関連する減少の治療/予防のために例えば）（Zdzieblik et al 2015および運動人口（結合組織の損傷の予防と管理のために例えば）（Baar、2015,2017）の両方の中で意味を持つ可能性がある。ホエイプロテインは、12週間の抵抗運動トレーニングプログラムと組み合わせた場合、若い男性の膝蓋腱肥大を強化することが示されているが（Farup et al 2014年これがコラーゲン合成の直接的なアップレギュレーションに起因するものなのか、それともアミノ酸であるロイシンの重要な量の提供に起因する大腿四頭筋の肥大への反応に起因するものなのかは、現在のところ明らかになっていない。実際、「ロイシン」トリガー仮説によると、ホエイプロテインに含まれるロイシンの標的量（～3g）の供給は、他のアミノ酸ビルディングブロックと組み合わせて、運動に反応して骨格筋タンパク質の合成を最大化する可能性がある（Atherton er al)。 Atherton et al 2017; Phillips、2014）。あるいは、プロリンなどのコラーゲンタンパク質に豊富に含まれるアミノ酸、およびグリシンは、合成機械がアップレギュレートされている運動の周りの時間にグリシンおよびプロリンの利用可能性の潜在的な利益を実証する試験管内試験および生体内試験の仕事で、新しいコラーゲンの合成に不可欠であることが示されている(Li et al 2018)。最近、我々は、プラセボ対照と比較して、15g.d-1のゼラチン（コラーゲンの食物形態）の消費とロープスキッピング運動を含む3-dプロトコルに従ったプロコラーゲンI無傷N末端（PINP）の増加を報告した。さらなる試験管内試験での研究では、グリシンおよびプロリンの血清濃度が高くなると、伸張刺激にさらされた人工靭帯のコラーゲン含有量および機械的特性が増加するという、これらの知見が支持された(Shaw et al 2017)。一方、他の研究では、様々なコラーゲン含有組織における加水分解コラーゲン補給の有益性が実証されている（Daneault et al 2017年;Oesser et al 2016年;Oesser et al 2003年;Schunck et al 2013）。これまでの研究は、コラーゲン性タンパク質のサプリメントおよび精製されたソースに焦点を当ててきたが、いくつかの文化および運動グループ（例えば、伝統的な漢方医学およびクロスフィットアスリート）は、治療目的で食品形態のコラーゲンを消費することが知られている（Nelson, 2015; Wu er al)。現在のところ、どの栄養素がコラーゲン組織の健康促進に具体的に関与しているかは不明であるが、スポーツ栄養の専門家が腱や靭帯の損傷を持つアスリートにコラーゲンタンパク質源（ゼラチンなど）の摂取を推奨しているという証拠もあり、損傷後の修復を助け、プレーへの復帰を加速させている。このような戦略を支えるメカニズムとして提案されているのは、コラーゲンに含まれるアミノ酸や関連化合物の血中濃度の上昇が、コラーゲン合成の増加をサポートするというものである(Baar, 2015)。

ボーンブロス（ボーンブロス）は、骨、結合組織、皮膚および爪の強化を含む様々な健康上の主張のための逸話的な支持を受けている食事用コラーゲン源である。それは、コラーゲンタンパク質と骨関連のミネラルが液体中に放出されることを可能にすると称して、長時間（> 24時間）のために骨と軟骨性肉源を煮ることによって作られている（McGruther、2014）。しかしながら、ボーンブロス組成物は、動物源および骨／肉の種類、調理の方法および時間、動物組織からの重要な栄養素の放出を助けるかもしれない成分の添加（例えば、酢および最終製品に関連する任意の処理（例えば、粉末形態への脱水）などの調製プロトコルの違いにより、実質的に異なるかもしれない。我々は、ボーンブロスがコラーゲン前駆体を提供するために使用することができる単一の食品と考えられているにもかかわらず、その生産技術の変動は、主要なアミノ酸の大幅な変動につながるだろうという仮説を立てた。

したがって、本研究の目的は、一般的に消費されるボーンブロス製剤の例の間および内のアミノ酸組成を評価することであった。ボーンブロスは、飽和脂肪や銅などの結合組織の健康に影響を与えることが示唆されている栄養素の源であるが（Scott et al 2016我々は、コラーゲン合成のための推定前駆体（グリシン、リジン、プロリン、およびロイシン）またはコラーゲン含有量の指標であるアミノ酸の提供に焦点を当てた;ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジン。我々は、コラーゲン前駆体の潜在的な治療用量を提供することができるいくつかのサプリメントと骨のブロス（250ミリリットルに設定）の標準的なサーブでこれらの成分の絶対量と変動の両方を比較した。アミノ酸の利用可能性が摂取量の増加に伴って改善されることが示されているので、我々は、これらの参照サプリメントの治療用量20gを選択した、我々の以前の研究（Shaw et al 2017）に関与した15gの用量よりもわずかに大きいことに留意した（Imaoka et al 1992; Iwai et al 2005）。

方法

我々は、ボーンブロスが標準化または非標準化されたプロトコルのいずれかに作られた自家製および商業的に調製されたブロスを含む、一般的な人口内で消費されるかもしれない典型的な方法を表す調製の範囲を同定した。標準化されたブロスは、非標準化されたブロスは、以下のうちの1つ以上によって変化しながら、それらが準備されたたびに、同じレシピ（すなわち、成分および調理技術）に作られた：骨のソース（すなわち、鶏肉対牛肉）、骨のタイプ（すなわち、標準的なスープ骨対骨髄骨）、調理方法（調理の持続時間、ストーブトップ対スロークッカー、酢の添加）。表１は、参考サプリメントとして作用するゼラチンおよび加水分解コラーゲン製品とともに、研究に含まれる骨スープサンプルの最終的な範囲を要約したものである。

サンプルは、要約（表１）に従って、市販の供給源から調製または購入した。各骨ブロスは、標準化されたレシピの複製または三重のサンプルを製造するために、少なくとも２回の別々の機会に調製または収集された。標準化されていない骨ブロスには、カフェのシェフによって1回の機会に調製されたものと、著者が「シェフが提供した一般的な」レシピに従って別の機会に調製したものが含まれ、その後、骨の種類を変更したり、調理後に脂肪を除去したりするために意図的に操作されたものがあった。自己調製したブロスの場合には、レシピの収量もまた、骨のkgあたりに抽出されたアミノ酸のmgの決定を可能にするために文書化された。ゼラチン（ブランドによって異なる）とコラーゲンペプチド粉末の2つの別々のサンプル（2つの異なるバッチ）、および液体コラーゲンと加水分解コラーゲン粉末の1つのサンプル（異なるバッチは入手できませんでした）を購入しました。合計で、２８個のサンプルを分析した。

準備/入手後（詳細については表1を参照）、ボーンブロスは、-20℃で凍結するために各液体の50 mLを収集ポットに転送する前に、均質なサンプルを確保するために混合された。製造者の指示に従って調製し、液体として分析した脱水骨粉を除いて、粉末状の製品は10gのサンプルとして測定した。輸送の12時間前に、サンプルを-80℃の冷凍庫に移した後、ドライアイスで分析ラボ（Australian Proteome Analysis Factory, Macquarie University, Sydney, NSW）に輸送し、分析まで-20℃の冷凍庫で保管しました。

フルアミノ酸プロファイルは、Ultra Performance Liquid Chromatography (Waters AccQTag Ultra)を使用して分析しました。必要に応じて、分析前にボーンブロスサンプルを37℃まで短時間温めて脂肪分を液化し、均質なサンプルを得るために混合しました。サンプルは、100℃の6M塩酸中で24時間液体加水分解を行い、結果を平均値（10％の変動許容値）として二重に分析しました。この研究の目的のために選択されたアミノ酸（グリシン、リジン、プロリン、ロイシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン）のみが報告されています。

すべてのデータは、1つのサンプルのみが分析された場合を除き、範囲として報告されています。データは、GraphPad Prism version 7.00 for Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA)を用いて分析した。Q-Qプロットを使用して正常性を目視で評価した後、標準化された骨ブロスと非標準化された骨ブロスの平均値を基準サプリメントと比較するために、Kruskal-Wallis検定に続いてDunnettの多重比較検定を使用しました。不対のt-検定は、標準化されたブロスのバッチを比較するために使用された。統計的有意性はP<0.05とした。

結果

表2は、製品の代表的なサーブあたりのアミノ酸含有量、および該当する場合には骨から抽出されたアミノ酸の量（mg/kg）をまとめたもの。

標準化されたボーンブロスと非標準化されたボーンブロスと参考サプリメントとの比較（図1）から、標準化された製剤は参考サプリメントよりもアミノ酸含有量が有意に低いことが明らかになった（ヒドロキシプロリン、グリシン、プロリン；P＝0.003およびヒドロキシリジン、ロイシンおよびリジン；P＝0.004）一方、非標準化された製剤は参考サプリメントと同様であった（P＞0.05）。標準化されていないボーンブロスは、標準化されたブロスや標準サプリメントよりもアミノ酸含有量に大きなばらつきがあり、すべてのサンプルでアミノ酸含有量が最も高かったのはカフェで調製されたボーンブロスであったが、この結果に寄与する正確な要因は不明である（表2）。標準化されたボーンブロスについては、市販の品種は自己調理された品種よりもすべてのアミノ酸のレベルが低かった。標準化されたレシピに従って調製した場合、同じ骨ブロスの異なるバッチのアミノ酸含有量に差はなかった（P > 0.05）。ボーンブロスまたはコラーゲンサプリメントのいずれもロイシンの治療用量を提供することができなかったが、実際には、ほとんどが500 mg未満であり、すべてが2 g未満であった（図2）。

酢の添加は、ブロスのアミノ酸含有量に影響を与えなかった。一方、骨の供給源は、実験室で調製されたブロス（牛肉＞鶏肉）ではすべてのアミノ酸の含有量が高くなるが、商業的に供給されたブロスではその違いと関連していた。骨の種類の違い（骨髄を含む長い骨と小さい骨の違い）はアミノ酸含有量を変化させ（「骨髄骨」＞「通常の骨」）、骨スープから脂肪を除去することはアミノ酸含有量を減少させた（表2）。

議論

本研究では、コラーゲン合成に必要なアミノ酸の食事源としてのボーンブロスの潜在的な役割を取り上げた。我々は、特定のアミノ酸（グリシン、リジン、ロイシン、プロリン）とコラーゲン成分（ヒドロキシプロリンとヒドロキシプロリン）の含有量を比較し、既存のコラーゲン合成の研究で使用されている参照サプリメントと比較して、自家製および市販のボーンブロス製剤の典型的なサーブ内のコラーゲン成分。

私たちの主な知見は

、1）標準化されたプロトコルに従って作られたボーンブロスの典型的なサーブは、一貫していたが、20グラムの治療用量を供給するサプリメント製品で発見されたもの以下の量で、これらの成分を提供していることであった。

2）非標準化されたボーンブロスのいくつかのバッチは、サプリメント製品に匹敵するアミノ酸プロファイルを持っていたが、その組成は（図1）が変化した。実際、標準化されていないブロスのアミノ酸含有量のばらつきは、標準化された製剤よりも大きかった（図2）。

3) コラーゲン合成をターゲットとしたボーンブロスやサプリメントは、筋肉のタンパク質合成を促進することが証明されているアミノ酸であるロイシンの含有量が少ない。

したがって、20gのコラーゲン蛋白質の治療用量がコラーゲン体組織の健康をサポートすることが証明されている場合、ボーンブロスは、標準的なサーブ中のキーアミノ酸の一般的に低いレベル、およびいくつかの、まだ特定できない要因がその調製に関与している場合に治療用量を提供する能力の不整合のために、そのような治療のための信頼性の高い供給源を提供し得ることは考えにくい。さらに、コラーゲン組織のすべての食事および／またはサプリメントの供給源は、タンパク質合成機械の活性化を促進し、骨格筋内の実際のタンパク質合成を高めることが知られているアミノ酸を提供するのに不十分である。

結合組織の健康とパフォーマンスに対する特定のアミノ酸の有効性に関する決定的な証拠はまだ出てきていないが、私たちは、骨格筋、運動、タンパク質の摂取量の話との並行性を探ることに興味を持ってた。骨格筋の成長のためのタンパク質摂取を支持するエビデンスは、精製アミノ酸（ロイシンなど）から無傷のタンパク質（ホエイなど日常的な食品源（チョコレートミルクなど）に至るまで、ソースの階層を経て進化してきた（Lunn et al 2012）。具体的には、様々な健康上の主張（McGruther, 2014）の逸話的な支持を得ている文化的に価値のある食品源（ボーンブロス）が、コラーゲンの研究から出現する可能性のある栄養素摂取推奨の実用的な形を提供できるかどうかに興味を持ってた。我々は、栄養素の食物源が最適な使用プロトコルをサポートすることができない他のシナリオがあることを認識している。これらは、肉からの典型的な供給は、急速なローディングのための目標を満たすために低すぎる（ハリス et al 1992）とカフェイン、そのコーヒー中の濃度があまりにも変数と予測不可能であるクレアチンの補充が含まれているスポーツパフォーマンス（Desbrow et al 2012）のための援助としてターゲットを絞った使用のための最適な選択肢を作るために（Desbrow et al 2012）。現在の研究で得られた知見は、ロイシン、コラーゲン性アミノ酸（グリシン、プロリン、リジン）と他の要因（水酸化プロリンとリジン）を得ることが可能であることを示しているが、コラーゲン治療のために促進された参照のサプリメントの20 gの用量によって提供されるのと同様に、それは成分や製剤のどの特性がより大きなアミノ酸含有量につながるかを決定することは困難であることを示している。

我々の結果は、使用される動物組織の量に関係なく、標準化された実験室で調製されたボーンブロスの品種（表2）では、牛肉の方が鶏肉よりも高いアミノ酸濃度を提供し、利用される動物組織の供給源が最終製品のアミノ酸濃度に影響を与えることを示している。肉の量、脂肪の量、または屠殺後に骨に残っている骨髄の量など、骨の異なる特性がこの結果を説明している可能性がある。例えば、骨髄はコラーゲンの豊富な供給源であることが提案されており、したがって、より多くの骨髄を含む骨を利用すると、理論的にはより高いアミノ酸濃度が得られることになる（McGruther, 2014）。一方、脂肪（動物の皮膚が豊富な供給源である）の存在は、アミノ酸の濃度を変化させる可能性がある。現在の研究では、ボーンブロスは骨の種類（最小限の骨髄と標準的な肉屋の骨対すなわち骨髄）のみを変更して、標準化されたレシピに調製されたとき、我々はアミノ酸の低い値ではない場合は、同様のことがわかった（表2）。しかし、ボーンブロスの準備を “そのまま”（脂肪がまだ含まれていると）残しておくと、脂肪が除去されたときよりもアミノ酸の濃度が高くなった（表2）。

最近の文献は、ボーンブロスにより酸性の環境を提供するために示唆された成分（すなわち酢）を添加すること、または調理時間を延長することが、ボーンブロスへの栄養素の抽出を助ける可能性があることを示唆している（Hsu et al 2017）。この例では、酢の添加は、ブロスのアミノ酸含有量に影響を与えていないようであった。しかしながら、アミノ酸の最大の含有量に関連するボーンブロス（カフェで調製された、非標準化された）は、24時間調理された標準化されたボーンブロスと比較して、72時間調理されたと報告された。これは、より長い調理時間がアミノ酸抽出を増加させる可能性があることを示唆している;実際に、カフェで調製されたブロスレシピを標準化された条件下で実験室で複製したとき、アミノ酸含有量は、購入された形態よりも低かったが、24時間調理された調製物よりも高かった（表2）。この知見は、レシピで使用した動物組織のkgあたりに得られたブロスのアミノ酸含量の比較によって支持され（表2何らかの未同定の因子がCafé製品の調製に関与している可能性があることを示している。

我々は、ブロスの内容を、現在最適な用量として文献では証明されていない、20gの補填コラーゲンと比較したことを認める。実際、これらの参考製品に関連するメーカーの説明書では、15～30g（加水分解コラーゲン）および10g（液体コラーゲン）を1回の摂取量として推奨しているが、ゼラチン摂取の利点を実証した我々の以前の研究では、15gの摂取量を提供している（Shaw et al 2017）。しかし、注意すべきことは、我々の以前の研究は、主要アミノ酸の最適量を提供する用量よりも、プラセボと比較して盲検化され得るゼラチンの用量を提供することに焦点を当てていたということである。とはいえ、これまでのエビデンスでは、ゼラチンの摂取量を増やすとアミノ酸の利用可能性が高まることが裏付けられている（岩井 et al 2005）ので、最適な利用可能性、実用性、口当たりの良さのバランスを考慮して、参考となるコラーゲンサプリメントの20gを選択した。ボーンブロスを多量に摂取することで同様のアミノ酸摂取量を達成することは可能かもしれないが、実用的な考慮事項は自己制限になる可能性がある。例えば、アミノ酸を含むコラーゲンの血中含有量の増加（食事摂取による）と靭帯/腱への血流の増加（運動による）の組み合わせが、これらの組織におけるコラーゲンの合成を促進することが将来の研究で示されている場合、運動前の30分間に500mlのビーフブロスを定期的に摂取するアスリートは考えにくい。

結論として、この研究は、特定のボーンブロス製剤からコラーゲンタンパク質中に見出される重要なアミノ酸を、コラーゲンサプリメントの治療用用量で提供されるものと同程度の量で摂取することが可能であることを示しているが、それは可能性が低く、再現性のない結果となる可能性があることを示している。様々な形態のボーンブロスのアミノ酸含有量には大きなばらつきがあり、成分や調製技術の違いに応じて変化する。確かに、ボーンブロスの自家製と商業形態の範囲のアミノ酸含有量は一貫して私たちの基準サプリメントよりも低かった。ローカルで準備されたボーンブロスは、選択された基準サプリメントで見つかったものよりも高い、または同等のアミノ酸の濃度を提供することが判明した一方で、我々の研究室でカフェが提供するレシピに調製したときに、我々は、これらのレベルを一致させることができないでした。このことは、コラーゲンタンパク質の補足的な供給源と比較して、ボーンブロスはコラーゲン由来のアミノ酸の一貫した信頼性の高い最適な供給源を提供できる可能性は低いことを示唆している。さらに、コラーゲン食品およびサプリメントは、ロイシンの貧弱な供給源である。

ノベルティの文言

これは、コラーゲン合成をサポートするための重要なアミノ酸を治療のために提供する可能性のある量の骨スープの能力を検討した最初の研究であり、この食品源に対する一般的な主張通りである。

実用的なアプリケーションステートメント

現在市販されている市販のビーフブロスや自分で調製したビーフブロスは、コラーゲン合成のサポートを特にターゲットにしたサプリメントをシミュレートした用量の主要なアミノ酸の信頼性の高い供給源を提供する可能性は低いと思われる。これらのアミノ酸の治療用量が定義できる場合は、これらのアミノ酸含有量を再現できる標準化された供給源を見つけるための更なる研究が必要である。現在のところ、その促進された利点にもかかわらず、骨の両方は、そのような栄養サポートの一貫性のあるまたは最適な供給源を提供するようには見えない。