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pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35804683/
Recent Advances in Nattokinase-Enriched Ferented Soybean Foods: A Review
オンライン公開 2022年6月24日doi:10.3390/foods11131867
李丹鳳、1侯麗晨、1胡苗、1高亜新、1田子良、1范北、1,2李秀英、1,*および王鳳中2,3,*（敬称略
要旨
血栓に起因する心血管疾患（心血管疾患）の死亡率が劇的に増加していることから、より効果的な血栓溶解薬や食餌性栄養素の探索に関心が集まっている。伝統的なバチルス菌発酵食品（BFF）である納豆の食事摂取は、心血管疾患のリスクを低下させることができる。
ナットウキナーゼ（NK）は天然で安全、効率的かつ費用対効果の高い血栓溶解酵素であり、納豆に含まれる最も生理活性の高い成分である。NKは心臓血管に有益な効果をもたらす可能性があると徐々に考えられてきた。
微生物合成は、NKを生産する費用効果の高い方法である。バチルス属が主な生産菌株である。NKの微生物合成は徹底的に研究されているが、NKの収量、活性、安定性が重要な制約となっている。複数の最適化戦略は、商業的需要を満たすために現在の問題に取り組む試みである。
我々は、発酵大豆食品、生産菌株、最適化戦略、抽出と精製、活性維持、生物学的機能、およびNKの安全性評価など、NKの最近の進歩に焦点を当てている。さらに、この総説では、実際の応用におけるNKの課題と展望について体系的に論じた。NKの継続的な探求と急速な進歩により、NKは将来、心血管疾患に代わる自然な代替物として期待されている。
キーワード バチルス発酵食品、バチルス属、線溶酵素、ナットウキナーゼ
1. はじめに
現在、心血管系疾患（心血管疾患）は様々な疾患の中でヒトの死因の第一位となっており、高い罹患率、障害、死亡率を特徴としている[1]。最先端の治療法を適用しても、ほとんどの患者は治療が手遅れである[2,3]。心血管疾患治療の経験が蓄積され、栄養と健康に対する人々の意識が高まるにつれて、心血管疾患の予防と治療には食事が効果的であることが徐々に認識されるようになった[4]。
大豆発酵食品の摂取は、心血管疾患リスクと有意な負の相関を示している[5,6]。納豆は、枯草菌によって発酵させた伝統的な大豆食品（バチルス発酵食品、BFF）であり、アルカリ性のセリンプロテアーゼであるナットウキナーゼ（NK）を豊富に含み、強力な血栓溶解活性と基質特異性を示す[7]。NKは多能性の血栓溶解機構を持つ（図1）[8,9,10]。例えば、NKはフィブリンを直接分解して血栓を溶解するだけでなく、t-PA（組織プラスミノーゲン活性化因子）のレベルを上昇させ、PAI-1（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター）のレベルを阻害することによって、内因性のプロウロキナーゼをウロキナーゼに、プラスミノーゲンをプラスミンに間接的に変換させる[11,12]。さらに、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ルンブロキナーゼ、ヘビ毒、ムカデ毒などの臨床薬や他の線溶成分と比較した場合、NKは高い血栓溶解活性、迅速かつ長い作用時間、無毒の副作用、簡便な投与、低い製造コストなどの利点を示す[7,13]。したがって、NKは、心血管疾患の予防および治療のための有望な栄養補助食品または栄養補助食品として期待されている[8,14]。
図1 NKの血栓溶解メカニズム。NKはフィブリンを分解し、血栓を直接溶解するだけでなく、体内の血栓溶解系を活性化し、血栓の凝固を抑制する。
本総説では、発酵大豆食品、生産菌株源、最適化戦略、抽出・精製工程、活性維持、機能性評価、NKの毒性評価など、NKの最近の進歩について体系的に論じている。一方、微生物によるNK生産における深刻な課題と、NK応用の展望についても明らかにしている。
2. NKを豊富に含む大豆発酵食品
食品としての大豆の消費は、何世紀にもわたって記録されてきた[15]。豆乳、豆腐、おから、発酵大豆製品など、さまざまな大豆製品がある。大豆発酵製品の中でも、納豆、トゥアナオ、テンペ、クネマ、豆鼓、コチュジャン、モロミ、チョングッジャン、カンジャン、ドエンジャン、セン、ペポックなどは、豊かな風味と味わい、高い栄養価から消費者に好まれている（表1）[16,17,18]。納豆は豆類BFFの代表である。納豆には糸引納豆、雪割り納豆、浜納豆の3種類があり、日本で広く消費されている[19]。バチルス属菌の発酵は、大豆成分の広範な分解と、NK、リボフラビン、ポリグルタミン酸などの新規生理活性化合物の大量生産をもたらす。[15,20].NKは血栓溶解活性を持つ重要な機能性因子である。1906年、澤村は納豆からのプロテアーゼ活性を初めて報告した[21]。さらに、その線溶活性は1925年に大島によって初めて報告された[22]。三宅らは、タンパク質の結晶を分離し、そのアミノ酸組成を決定することに成功した[23]。1987年、鷲見らは納豆からの線溶タンパク質の抽出と単離において、初めて「NK」という名称を使用した[24]。NKのタンパク質配列は、バチルス菌が産生するスブチリシンNAT（EC 3.4.21.62）と非常に相同性が高いが、強力な血栓溶解活性と基質特異性を示すのはNKだけである[7]。
表1 伝統的な大豆発酵食品
| 地理的位置 | 国名 | 伝統的な親友 | 参照 |
|---|---|---|---|
| アジア | 日本 | 納豆 | [24] |
| 味噌 | [25] | ||
| 中国 | ドウチ | [26] | |
| スフ/フル | [27] | ||
| 韓国 | チュングッチャン/崇国荘 | [18] | |
| コチュジャン | [28] | ||
| ドゥエンジャン | [29] | ||
| カンジャン | [30] | ||
| インド | キネマ | [31] | |
| タングリンバイ | [32] | ||
| ベカン | |||
| ドーサの生地 | [33] | ||
| インドネシア語 | モロミ | [34] | |
| テンペ | [35] | ||
| カンボジア | シエン | [36] | |
| ラオス | |||
| タイ | トゥア・ナオ | [37] | |
| ネパール | キネマ | [31] | |
| ブータン | |||
| ミャンマー | ペポック | [36] | |
| アフリカ | ガーナとナイジェリア | ダワダワ | [38] |
3. NKの生産株
NKの生産菌株は、発酵豆類食品、土壌、海洋水、植物、乳製品、さび、牛糞など、様々な供給源から単離されており（表2）、中でもBFFは納豆のようなNKの良好な供給源であることが長い間証明されている（図2）[39]。バチルス属はNKの潜在的な微生物源であり、B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. megaterium、B. pumilus、B.cereusなどが含まれる[16,40,41]。
表2 NK生産株の供給源
| 情報源 | 系統 | 参考までに。 | ||
|---|---|---|---|---|
| 大豆発酵食品 | 納豆 | 納豆菌 | [24] | |
| 納豆菌 | [47] | |||
| 枯草菌REVS12 | [44] | |||
| 納豆菌B-12 | [48] | |||
| ダジャン | 枯草菌LSSE-62 | [49] | ||
| モロミ | 枯草菌K2 | [17] | ||
| ドウチ | 枯草菌DC33 | [50] | ||
| 枯草菌YF38 | [51] | |||
| 枯草菌MX-6 | [45] | |||
| アミロリケファシエンスDC-4 | [52] | |||
| トゥア・ナオ | 枯草菌 | [37] | ||
| チョングッジャン | バチルス属 CK 11-4 | [53] | ||
| ドゥエンジャン | 枯草菌WRL101 | [54] | ||
| バチルス属 DJ-4 | [55] | |||
| ジェンブス | プミルス | [56] | ||
| 土壌 | 納豆菌WTC016 | [57] | ||
| B. 亜炎RJAS19 | [58] | |||
| 枯草菌IMR-NK1 | [59] | |||
| 枯草菌TKU007 | [60] | |||
| 枯草菌 | [61] | |||
| シュードモナス属 TKU015 | [62] | |||
| マリン | 海水 | 枯草菌 | [63] | |
| 海洋文化 | 枯草菌ICTF-1 | [64] | ||
| 植物 | 紅藻ポルフィラ・デンタータ | 枯草菌N1 | [65] | |
| Stemona japonica(Blume) Miqの根組織 | 内生株EJS-3 | [66] | ||
| 乳製品 | 牛乳 | 緑膿菌CMSS | [67] | |
| 発酵乳 | 枯草菌VITMS 2 | [68] | ||
| さび | セレウス菌VITSDVM3 | [69] | ||
| 牛糞 | バチルス属 IND7 | [70] | ||
図2 NK産生株の供給源
枯草菌はグラム陽性で胞子を形成する桿菌の一群であり、一般に豆類発酵食品における安全な（GRAS）微生物生産者とみなされている[16,42]。枯草菌は、増殖サイクルが短く、発酵プロセスが容易で、遺伝子工学的な操作性が高く、遺伝的安定性が高く、代謝ネットワークが明確で、明らかなコドン選好性がない。最も重要なことは、タンパク質の分泌と発現能力が高いことである[42,43]。主に発酵野菜チーズ納豆から分離された枯草菌納豆は、約40 IU/g（湿重量）の多重効果線溶活性を示した[24]。NKの生産株であるB. subtilisREVS 12は、チェンナイで採取された納豆食品から分離された[44]。同様に、中国産のドウから分離されたB. subtilisMX-6は、NKをコードするaprNの存在を示し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法で確認された[45]。さらに、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. megaterium、B. pumilus、B.cereusなどもNK生産に利用されている[16,40,41]。さらに、他の微生物も代替品として使用されている。例えば、内生菌のフザリウム属、Zygosaccharomyces rouxii、Tetragenococcus halophilus、Pseudomonas属などである[17,46]。
4. NKの最適化戦略
【省略】
5. NKの濃縮抽出
【省略】
6. NK活性の維持
【省略】
7. NKの生物学的機能と医薬的価値
NKは、凝固を抑制し、血栓を溶解し、高血圧や高脂血症を抑制し、アポトーシスを促進し、オートファジーを制御することができる[134,135]。したがって、NKは、心血管疾患の治療や予防のための、天然で、安全かつ効果的で、低コストの臨床薬剤または食品サプリメントとして大いに有望である（図3）[10,15]。
図3 NKの生物学的機能。
7.1.NKの抗血栓作用と線溶作用
血栓は血管内でフィブリンと血小板が大量に凝固することによって形成される。この凝固は線溶によって元に戻すことができる。様々な試験管内試験および生体内試験において、NKは、血漿凝血塊溶解時間を短縮し、心血管疾患のリスク上昇に関連する特徴を減少させるなど、出血のリスクが比較的低く、極めて強力な血栓溶解活性を示した[136]。NKは、血栓モデルにおいて75mg/kgで血栓形成を90%以上遅延させ、NKの安全量はt-PAの15倍であった。NKの経口投与と注射の両方で、誘発ラットモデルにおいて67.3～83.6%の有意な減少がみられた[82]。ヒトを対象とした試験では、NKカプセル2個（2000 FU/カプセル）を毎日経口投与したところ、心血管疾患患者の心血管疾患リスク上昇に関連する特徴、血漿フィブリノゲン値、第VII因子、第VIII因子が、それぞれ9%、14%、17%低下した[12]。別の研究では、第VIII因子活性は 2000 FU NKの経口投与4時間後と6時間後に、それぞれ平均7.4%と7.6%低下した。
7.2.NKの抗動脈硬化作用
様々な心血管疾患に共通する根本的な病理学的変化は、心臓病や脳卒中の原因となるアテローム性動脈硬化症（AS）である。ASは、脂質代謝障害に基づく病変群で、動脈血管壁の肥厚や硬化などの症状がある。NKは、抗酸化作用と抗アポトーシス作用の相乗効果により、内膜肥厚を抑制する。さらに、NKは脂質過酸化を減少させ、脂質代謝を改善し、低比重リポ蛋白（LDL）の酸化を抑制することにより、ASを予防する[139]。NK投与により、患者の内膜中膜厚は36%、頸動脈プラークサイズは10.62%、それぞれ有意に減少した。したがって、NKは動脈硬化性プラークが誘発する心血管疾患と脳卒中に対する実行可能な代替療法になると期待されている。
7.3.NKの高脂血症抑制効果
高脂血症（HLP）は、血中脂質濃度が高すぎる状態であり、アテローム性動脈硬化症などの重篤な疾患の直接的な原因となる。NKは脂質過酸化を抑制し、脂質代謝を改善することでHLPを予防した。臨床試験では、4000FUのNKを投与した原発性高コレステロール血症患者において、8週間後の血清総コレステロール（TC）値が、プラセボ群と比較して6.8%低下した[141]。さらに、NKと紅麹エキスの併用は、高脂血症患者に対して、トリグリセリド（TG）、TCおよび低比重リポタンパク質コレステロール（LDL-C）をそれぞれ15%、25%、41%低下させ、HDL-Cを7.5%増加させる高脂血症効果を示した[142]。雄の白ウサギモデルでは、NKと紅参の併用により、高コレステロール群と比較して、血清コレステリル・エステル転移タンパク質活性が平均22%低下した[143]。
7.4.NKの降圧効果
高血圧は、体循環における動脈血圧（BP）の上昇を特徴とし、最も一般的な慢性疾患であり、心血管疾患の最も重要な危険因子である。NKの補給は、血漿中のフィブリノーゲンの切断を通じて収縮期および拡張期血圧を低下させ、高血圧の予防および治療におけるその役割を示唆している[144]。さらに、NKは比較的強力なアンジオテンシン変換酵素阻害薬（ACEI）であると考えられており、これが血圧の低下に関与している可能性がある。試験管内凝固溶解アッセイでは、NKのACEI活性はNK濃度4.8mg/mLで最大87.45%に達した[68]。さらに、NKを8週間摂取すると、北米の高血圧患者において、ベースラインの平均拡張期血圧が86から81±2.5mmHgに低下した[145]。
7.5.NKの神経保護効果
中枢神経系の変性疾患は、慢性的な退行性組織の変性によって引き起こされる疾患群である。主な病理学的特徴はβアミロイドの細胞外沈着である。記憶障害、認知機能障害、言語機能低下などが一般的な臨床症状である。In vivoおよびvitroの研究では、NKの神経保護作用は、β-アミロイド沈着の抑制、タンパク質分解の促進、抗炎症作用、抗アポトーシス作用と関連していることが示された[146]。NKは、光血栓性脳卒中患者の脳梗塞容積を約61%有意に減少させた[147]。NKはまた、アルツハイマー病（AD）などのアミロイド関連疾患の治療においても重要な役割を果たした[148]。ラットモデルにおいて、NKは、学習障害、記憶能力の向上、βアミロイドの効果的な抑制など、AD経路における特定の因子の調節にプラスの効果を示すことができる。
7.6.その他の疾患
NKはまた、そのプロテアーゼ特性により、他の疾患に対しても有効な治療法である。NKは、抗血管新生作用により、網膜新生血管の代替治療戦略となりうる[149]。NKは、コラーゲン線維を加水分解することにより、増殖性網膜硝子体疾患の患者を治療することができる[150]。NKはまた、慢性副鼻腔炎患者の鼻ポリープのフィブリンを加水分解することにより、慢性鼻副鼻腔炎や喘息を治療する[151]。さらに、NKは肝臓がんマウスの生存率を改善し、腫瘍の成長を抑制した[152]。
8. NKの毒性評価
NKの潜在的な健康効果に対する人々の関心が高まっていることを考えると、NKの潜在的な毒性と全体的な安全性を評価することは重要である。発酵食品の生物活性成分としてのNKは、1000年以上にわたって摂取されてきた。NKは、推奨用量（1日200mg）であれば事実上安全であり、臓器や組織の病理組織学的検査においても毒性の兆候は見られない。14日間の急性毒性試験では 2000mg/kgのNKを経口投与したラットに、重大な副作用の徴候や死亡は観察されず、90日まで経口投与を続けたラットにも異常は見られなかった[153]。同様に、28日間および90日間の反復投与毒性試験期間中、1000 mg/kgおよび2000 mg/kgのNKを単回経口投与したラットモデルでは、死亡率、有害な臨床症状、あらゆる組織損傷、肉眼的病理所見は認められなかった。さらに、ヒト試験では、健康なボランティアがNK（10mg/kg）を28日間毎日経口摂取しても、副作用は認められなかった[154]。動物試験でもヒト試験でも、同じ生理学的効果がNKの生物学的同等性を示している。NKの安全性については、投与量、投与時間、毒性、遺伝毒性などの影響を含めて、まだ考え、研究する必要がある[144,154]。
9. 結論と展望
ナットウキナーゼ（NK）は、天然の安全で効率的かつ費用対効果の高い血栓溶解酵素であり、循環器系に有益な効果をもたらす可能性がある。本総説では、NKを濃縮した大豆発酵食品に焦点を当て、さらに系統的に、NKの微生物合成、抽出と精製、活性維持、血栓溶解活性、安全性評価について詳しく述べた。間違いなく、バチルス属による微生物合成は、NKを生産する一般的な方法である。NKの収率、線溶活性および生物学的利用能は、その工業的応用を直接決定するものであった。
現在、実用的な需要が徐々に増加するにつれて、NKおよびNKを豊富に含む大豆発酵食品の健康関連の可能性について、一般の人々の関心が高まっている。そのため、微生物合成はNKを生産する極めてコスト効率の高い方法であるが、その収量、活性および安定性が工業的応用の主な制約となっている。
NKの収量、線溶活性および安定性の向上には、潜在的なハイスループット微生物生産者スクリーニング、発酵培地および発酵条件の最適化、組換え発現、分子修飾が含まれ、NKの発現を増加させることができる。さらに、新規の濃縮・精製技術は、NKの活性と安定性を高めることができる。加えて、NKの様々な安定なデリバリーや製剤を開発することで、商業的な需要も満たすことができる。
NKの生物学的価値と機能的活性は、バイオアベイラビリティを高めるために、まだ検証される必要がある。さらなる研究は、NK微生物合成の複数の理論的研究と先端技術に焦点を当て、心血管疾患に貢献することは間違いないだろう。
資金調達
本研究は、中国農業研究システム（CARS-04）および中央公益科学機関基礎研究基金（S2021JBKY-02）の助成を受けた。
利益相反
著者らは利益相反がないことを表明している。