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pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19941989
FDA Guidance on Prophylactic DNA Vaccines: Analysis and Recommendations
2009年11月24日オンライン公開。 doi:10.1016/j.vaccine.2009.11.025
PMCID: PMC2847045
NIHMSID: NIHMS162389
PMID:19941989
デニス・M・クリンマン1スヴェン・クラシック2デブラ・トロス1城田秀和1 フォルカート・シュタインハーゲン1
要旨
FDAは、米国における予防的DNAワクチン試験の実施を15年近く規制してきた。この著作では、この間のFDAの政策の変遷、現在の規制ガイダンスの状況について述べ、この分野の開発を促進するための更なる変更についての提言を行う。
キーワードDNAワクチン、ガイダンス、臨床試験
1) DNAワクチンの紹介
感染症の予防は公衆衛生の優先事項であり、ワクチン研究の主要な目標である。この目標を達成するための有望な戦略のひとつに、病原性ウイルス、寄生虫、細菌に対する防御的な細胞性・液性免疫応答を誘導するための抗原コードDNAプラスミドの利用がある[1-3]。DNA ワクチンは、細菌 DNAのプラスミド骨格上に発現された、強力な哺乳類プロモ ーターによって発現が制御される抗原コード遺伝子から構成されている[1;3-5]。これらのプラスミドには、細菌の選択と複製に必要なDNA配列に加え、ワクチン受容体においてコードされたタンパク質の発現を増加させるように設計された様々なプロモーター、エンハンサー、その他の要素が組み込まれている。DNAワクチンでトランスフェクトされた細胞は、自己MHCの中でコードされたタンパク質を転写、翻訳、発現する[1;3;6]。プラスミドDNAの導入の性質や経路に影響されるとはいえ、結果として生じる免疫の誘導には、専門の抗原提示細胞（APC）が支配的な役割を果たす。皮膚や筋肉に直接トランスフェクションされたAPCは、一次リンパ臓器に移動し、そこで免疫応答を開始し[7-9]、トランスフェクションされた非免疫細胞（筋肉細胞など）によって産生された抗原を交差提示する[3;10–14]。
感染予防を目的としたDNAワクチンは、多くの動物実験で安全性と有効性が証明されている[3;7;9;10]。DNAワクチンを含む複数の第I相臨床試験が実施されている[15–17]。これらの臨床試験の結果から、DNAワクチンは安全であるように見えるが、ヒトにおいて誘発される免疫応答（効果）は控えめであることが示されている[15–20]。
2) FDA規制方針
2.1) 規制政策の策定
DNAワクチンの臨床開発に向けた継続的な進展は、米国食品医薬品局（FDA）の生物製剤評価研究センター（CBER/FDA）による規制環境の影響を受ける。CBERは、関連する連邦法令、法律、ガイドラインの解釈に基づき、ワクチン政策を定め、実施している。CBERの既存のガイドラインは、他の種類のワクチンや生物学的製剤の規制における経験を反映したものである。この保守的なアプローチにより、製品規制の一貫性を維持し、米国連邦規則集への準拠を確実なものにしている。CBERの方針では、DNAワクチンがヒトでの臨床試験に進む前に、1つ以上の「関連する」動物モデルで十分な前臨床データを取得し、安全性と免疫原性の可能性が高いと結論付けることを義務付けている。通常、前臨床試験は、ワクチンが免疫原性を有するかどうかを判定するためにマウスで、ワクチンが急性毒性または慢性毒性を引き起こすかどうかを判定するためにウサギで実施される。また、ワクチンが再現性よく合成できること、長期保存下でも安定であることを確認するために、様々な試験が必要となる。このような前臨床試験の結果は、ヒトに投与できるワクチンの数、時期、投与量に関する決定に影響する。
予防用DNAワクチンの規制は、1990年代半ばに臨床試験が開始されて以来発展してきた。プラスミドの製造、ベクターの構築、ワクチンの免疫原性、安全性に関する情報など、前臨床および臨床での経験の蓄積が、規制ガイドラインの変更につながった。2007年、FDAは、感染症に対する感受性を低下させることを目的としたDNAワクチンの製造と試験に関するガイダンス文書を更新した[21]。自己免疫疾患や癌の治療など、他の用途を目的としたDNAワクチンは、このガイダンス文書の対象外であった。これは、既往症の治療に使用される製品と、一般市民が使用することを意図した予防ワクチンに許容されるリスクレベルの違いを反映したものである。FDAによる予防用DNAワクチンの第1相臨床試験の最初の承認は、プラスミドが安定的に製造できるという証拠と、広範な前臨床安全性データに依存していた。DNAワクチンの製造と試験に関する初期の勧告は、他のタイプのワクチンやDNAベースの製品に関するFDAの経験に大きく基づいていた[22]。それ以来、DNAワクチンの製造、活性、安全性に関して、かなりの追加的な情報と経験が蓄積された[21;23]。この新しい情報がFDAの規制ガイドライン改訂の基礎となった[21]。
2.2) 規制政策の評価
医薬品の開発は、基礎研究によって発見された医薬品や生物学的製剤が前臨床動物試験を経て、第Ⅰ相～第Ⅲ相臨床試験へと進む直線的なプロセスを想定している。DNAワクチンの開発は、この直線的なルートには沿っていない。免疫原性の懸念が、小規模な第I相試験から大規模な第II／III相免疫原性試験および有効性試験への取り組みを短絡させているからだ。現在までに、様々なプラスミド成分、配列モチーフ、アジュバント、投与部位／方法、その他の変数がワクチン免疫原性に与える影響を区別するために、数多くの第I相試験が実施されてきた[15–18]。実際、DNAワクチンの臨床試験では、単一の製品を開発するのではなく、複数の「候補」構築物を（同時に、あるいは連続して）設計し、その後のワクチンの免疫原性を改善するために組み込むことができる要素を特定することが一般的である。
現行のCBERガイドラインは、製品規制の一貫性を維持し、連邦規則（Code of Federal Regulations）の遵守を最大化しようとするものだが、そのような方針はDNAワクチン開発の緊急性を認識したり、それに対応したりするものではない。従って、現行の規制の保守的な性質は、ワクチンの性能を向上させる努力を妨げる可能性がある。上述したように、ほとんどの第I相DNAワクチン臨床試験は「候補」プラスミド（またはプラスミドとアジュバントの組み合わせ）を利用しており、認可に向けてさらに進む可能性は低い。従って、DNAワクチンに対する最適化された規制方針は、各試験が少数のヒトボランティアのみを対象とし、複数の第I相試験の実施を促進することになる。
2.3) 規制方針の変更推奨
いくつかの政策変更は、コストを大幅に下げ、第I相試験の開始を早めるだろう：
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CBERは、第Ⅰ相臨床試験を開始する「候補」ワクチンについて、より広範な毒性（統合を含む）試験を要求すべきではない。そのようなデータの要求は、第Ⅱ/Ⅲ相試験を目的としたワクチンにシフトすることができる。
理由：著者らは、この方針変更が第I相試験に参加する被験者のリスクを増加させると受け止められる可能性があることを認識している。しかし、ヒトに使用されるDNAワクチンに関するげっ歯類試験の予測値は信頼性に欠けるため、広範な前臨床動物試験が必ずしも被験者のリスクを軽減するとは限らない。実際、マウスでは強い防御免疫応答が繰り返し得られているが、ヒトでは得られていない。マウスやウサギで行われた安全性と毒性に関する研究では、DNAワクチンの安全性は一様に示されている[24–27]。毒性を引き起こすDNAワクチンがない場合、臨床における有害な結果を予測する上で、いずれの動物モデルの信頼性も確認することはできない。従って、「候補」ワクチンに対する広範な毒性試験の付加価値は不明である。さらに、DNAワクチンの安全性は、ヒト臨床試験ですでに確立されている[17;20;26;28;29]。
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CBERは、第Ⅰ相臨床試験に入る「候補」ワクチンについて、より要求の低い製品製造デ ータを要求すべきである。そのようなデータの要求は、第Ⅱ/Ⅲ相試験を目的としたワクチンに移行することができる。
理由：DNAワクチンの安全性プロファイルは優れている。製造業者は、第Ⅰ相試験で使用される候補ワクチンが無菌でエンドトキシンを含まないことを確認する必要がある。「候補」ワクチンはほんの一握りのボランティアにしか投与されないため、ロット間の一貫性と純度の問題は、主に第Ⅱ相試験に進むプラスミドにとって重要になる。このような規制要件の緩和に伴う潜在的なリスクは、新規ワクチンに曝露されるボランティアの数を最小化する用量漸増試験を実施することによって管理することができる。
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バイオテクノロジーおよび学術研究者が、試験デザイン/実施に関する助言をFDAに求める機会を増やす。これには、プレINDミーティングの回数を増やし、スポンサーがFDAの審査官と連絡を取り、その製品に関する「オフレコ」での助言を得ることを認めることが含まれる。欧州の規制モデルを反映し、FDAはこのようなアクセスの拡大に対して償還を受けることができ、FDAはこれらのサービスを提供するために必要な追加人員を雇用し、訓練することができる。
理由：プレ IND ミーティングは、新しい。DNA ワクチンを製造する側とそのような薬剤を規制する側との間で、オープンなデータや意見の交換を促進するものである。これらの会議は、製造者とCBERの審査官双方にとって非常に有用であることが証明されている。CBERのリソースが限られていた数年前、Pre-INDミーティングの回数は制限されていた。FDAに新たなリソースが提供されたので、このような非常に効果的な相互作用をより多くサポートすることに振り向けられるべきである。同様に、FDAの審査官が信頼できる助言を継続的に提供することは、ワクチン製造業者にとってかなりの利益となる。
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ワクチンの「候補」を「十分に特性化された製品」と定義する。これにより、プラスミドの生化学的分析が「候補」ワクチンの生物学的力価アッセイに代わることが可能となる。同様に、包括的な生物学的分布と統合性試験の実施は、第Ⅱ相臨床試験に入る製品にシフトすることで、第Ⅰ相臨床試験のスピードアップとコスト削減が可能となる。
理由：臨床試験を開始する生物学的製剤はすべて、無菌かつ非反応性であるべきである。しかし、ほとんどの「候補」DNAワクチンは第Ⅰ相試験以上には進行しない。そのような場合、製品の特徴づけの性質と範囲に関する要件は制限されるべきである。
3) 現行の規制ガイダンスの説明
3.1) 現行規制ガイダンスの進化
1996年12月、FDAはDNAワクチン開発者を支援するためのガイダンス文書「Points To Consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventive Infectious Disease Indications」[22]を発行した。このガイダンス文書では、DNAワクチン開発に関連する製造、前臨床、臨床に関する推奨事項が記載され、臨床試験開始前にワクチン開発者が考慮すべき安全性に関する懸念事項が提起されている。このガイダンスは、DNAワクチンに関連する製造、前臨床、臨床の問題についての理解が深まるにつれ 2007年に改訂された[21;23]。以下に、予防用DNAワクチンに関する最初のガイダンス文書（Points to Consider）と改訂されたガイダンス文書（Guidance）との間の規制上の観点における主な変更点の概要を示し、DNAワクチン開発をさらに促進する可能性のある追加の規制戦略についての解説を加える。
3.2) 製造とロットリリースの問題
FDAガイダンスの重要な目標は、ワクチン製造に使用される方法、プロセス、設備が、一貫して安全で、純度が高く、効力のある製品を生み出すことを保証することである[30]。上述したように、DNAワクチンの10年の経験から、CBERはこれらの薬剤を「よく特性化された製品」として指定することができるはずだ。これにより、臨床試験用の「候補」ワクチンの製造が迅速化、簡素化される。DNAプラスミドのバックボーンがワクチン活性に影響するというエビデンスに基づき[4;5]、また、DNA配列決定の時間とコストを大幅に削減する技術の進歩も相まって、製造業者は、第I相臨床試験開始前にプラスミドの完全な配列を提供し続けるべきである。この塩基配列には完全な注釈を付け、予測塩基配列との相違点を特定し説明すべきである。
細菌によって最初に生産されるとき、プラスミドは全長でスーパーコイル型になる傾向がある。その後の製造や保存の過程でプラスミドに傷がついたり切断されたりすることにより、スーパーコイル型プラスミドが開環型、最終的には直鎖型に変換される。プラスミドのスーパーコイル型から閉じた環状型への分解がワクチンの免疫原性にどの程度影響するかについては意見が分かれている。FDAは慎重を期し、ロットリリース基準には、製品の80%以上がスーパーコイルドプラスミドで構成されていることを最低条件とすることを推奨した。しかしながら、スポンサーが特定のワクチンについて、スーパーコイルドプラスミドの含量が低いにもかかわらず高い免疫原性を維持していることを証明できる場合には、この基準を緩和することができる。
製品の品質を評価するために使用される力価測定法に関する推奨事項が 2007年のガイダンスで改訂された。歴史的に、効力は生体内試験でのワクチン免疫原性のモニタリングによって評価されてきた。FDAは、初期臨床開発（第I相および第II相初期）において、力価測定法の選択についてスポンサーにかなりの柔軟性を与えることを選択した。生体内試験での免疫原性の測定に加えて、試験管内試験でのトランスフェクション効率の測定（コードされた遺伝子の取り込み、転写、翻訳をモニターする試験を含む）を用いて効力を評価することが容認された。製品開発が承認取得に向けて進むにつれ、in vivoにおけるタンパク質の産生および／または免疫原性を評価する定量的な力価測定法の開発が最も重要であると考えられた。
3.3) 前臨床安全性問題
最初のDNAワクチンが臨床試験に入る前に、FDAによって潜在的な安全性の懸念が指摘された。これらの安全性の問題は、主に他のタイプのワクチンに関する過去の経験から導き出されたもので、DNAワクチン接種が、
- i)プラスミドのDNAに対する自己抗体の産生を刺激し、全身性エリテマトーデス（SLE）のような全身性自己免疫疾患の発症を誘発または促進する可能性、
- ii)ワクチンによってコードされた抗原を発現する細胞に対する局所的な炎症反応を誘発し、エピトープの拡散により臓器特異的自己免疫疾患の発症を促進する可能性、
- iii)コードされた抗原（宿主細胞によって発現され、自己の文脈で提示される;
- iv) プラスミドバックボーンに存在するCpGモチーフにより、宿主のTh1サイトカイン応答を選択的に増強する、および/または
- v) 宿主細胞のゲノムにプラスミドDNAが組み込まれ、発がんやその他の遺伝子異常のリスクを増大させる[31–36]。
動物実験で蓄積されたデータから、DNAワクチンは抗DNA自己抗体の産生を増加させるが、この効果の大きさは、全身性エリテマトーデス傾向のあるマウスで疾患の重症度を加速または増加させたり、正常な動物で自己免疫を誘導するには不十分であることが示された[33;34]。他の研究では、ワクチンでコードされた抗原を発現する細胞に対して免疫応答が誘導されたが、同じ組織内の非トランスフェクト細胞は免疫系による排除の標的とはならなかったことが示されている[34]。最後に、臨床試験で使用されたDNAワクチンの安全性を記述した論文には、ワクチン試験参加者に全身性または臓器特異的な自己免疫疾患が誘発されたことを示すものはなかった。これらの知見に基づき 2007年のガイダンス文書では、スポンサーはもはやワクチン接種が自己免疫に及ぼす影響を具体的に評価するための前臨床試験を実施する必要はないと結論づけた。むしろ、ワクチン接種が自己免疫疾患の誘発を含む有害事象を誘発するかどうかを判断するには、確立された臨床モニタリング手順で十分であるとした。
前臨床試験や臨床試験から、DNAワクチンが成人に耐性をもたらすという証拠はない。このようなワクチンが新生児や幼児に寛容を誘導する可能性については、まだ議論の余地がある。新生児マウスへのDNAワクチン接種後に長期寛容が発現する可能性があるという証拠があるにもかかわらず[32;34]、新生児にワクチン接種した場合は免疫の方がより可能性の高い結果である[37–40]。改訂されたガイダンス文書では、ワクチンによる防御が成体で達成された後は、適切な動物モデルを用いた注意深い前臨床試験により、徐々に低年齢の被験者での試験が可能になるはずであると結論づけている。
3.4) プラスミド統合の問題
DNAは「従来の」（非DNA）ワクチンの汚染物質と考えられている。製造者は通常、有害な可能性のある物質にヒトが暴露されるのを最小限にするため、製造過程で余分なDNAを最小限にするか、あるいは除去している。プラスミドDNAが宿主ゲノムに組み込まれ、悪性形質転換、ゲノム不安定性、細胞増殖異常の可能性が高まるのではないかという懸念が、DNAワクチンの臨床使用が最初に提案された際に提起されたことは驚くにあたらない[31;36;41]。ワクチン諮問委員会からの助言に基づき、FDAは、プラスミド統合の頻度が自然突然変異率よりかなり低いことを保証するためのガイドラインを設定した[42]。
DNAワクチンが宿主ゲノムに組み込まれるかどうかを検討する最初の取り組みとして、プラスミドの生体内分布と持続性をモニターすることが行われた。ほとんどの研究では、ワクチン接種を受けた動物の組織からDNAを単離し、高感度Q-PCRアッセイを用いてプラスミドの存在を調べた。その後、統合されていない小さなプラスミドから分離した高分子量のゲノムDNAをサイズ分画することで統合を評価した（この際、プラスミドコンカテマーを除去するために制限酵素消化が必要になることもあった）[24;43;44]。その後、Q-PCRおよび/またはRAIC-PCRを用いて、ゲノムDNA調製物中に存在する残存プラスミドを検出し、定量した。その結果、従来のDNAプラスミドの筋肉内、皮下、皮内、および粒子を介した送達では、ワクチン投与部位から遠方の組織においてプラスミドが長期的に残存することはほとんどないことが示された[24;43–46]。対照的に、投与部位またはその近傍の組織（筋肉やその上の皮膚など）には、投与後間もなく、宿主DNA1マイクログラムあたり数千から数百万コピーのプラスミドが含まれるのが一般的であった[24;43-49]。時間の経過とともに、このプラスミドの大部分は消失した[43–49]。複数の異なるプラスミドバックボーン、および同じプラスミドバックボーンに様々なプラスミドの挿入を含む研究に基づき、改訂されたFDAガイダンス文書では、許容可能な生体内分布／統合プロファイルを有すると以前に文書化されたプラスミドベクターを用いて調製されたワクチンについては、生体内分布／持続性試験を免除することができると示された。新規のプラスミドや製剤化・送達方法については、プラスミドが宿主DNA1ugあたり10,000 コピーを超えるレベルで持続する場合、統合試験が必要となる。この推奨は、送達方法に関係なく、持続するプラスミドのごく一部のみが宿主ゲノムに統合されるという予想を反映している[45]。
プラスミドが組み込まれることによる潜在的な害を評価する際、強力な制御領域を持つプラスミドが宿主ゲノムに導入されるリスクは、ランダムな点突然変異に関連するリスクをはるかに上回ることに注意すべきである[43;50]。さらに、プラスミドの持続性を検出するために使われる技術では、プラスミドの短い断片が統合される頻度は調べられない。この文脈では、7bpという短いDNA断片が、組み込みや組換えの速度に影響を与える可能性がある。例えば、VDJ組換えシグナル配列や関連配列、chi様エレメントやミニサテライト、ALU配列、B型肝炎や哺乳類ゲノムに存在するリコンビナーゼシグナル、トポイソメラーゼII認識部位などである[43]。
3.5) 一般的な毒性問題
2007年のガイダンスでは、第I相試験を開始する前に局所反応原性と全身毒性を十分に評価すること、また、そのような試験ではヒトへの接種が計画されている最高用量のワクチンを「N+1」回（ここでNはヒトへの接種予定回数）接種することを推奨している。ガイダンスでは、最終ワクチン接種の2～3日後と2～3週間後に、短期毒性と持続毒性の両方を別々の動物コホートで評価することを推奨している。推奨される前臨床毒性試験には、血清化学、血液学、凝固検査に加え、肉眼的および顕微鏡的組織学（造血系や免疫系などDNAワクチン接種の標的となりうる臓器に特に注意を払う）が含まれる。特筆すべきは、FDAはDNAワクチンの安全性プロファイルに関して膨大な経験を蓄積してきたことである。従って、第I相臨床試験開始前に完全な毒性試験を実施するというFDAの要求は再評価に値する。このような高価で時間のかかる試験（通常ウサギで実施）が、ヒトへのDNAワクチン接種に関連するリスクを低下させたことを示す報告はない。「候補」プラスミドを含む小規模な第I相試験の開始前にこのような試験を要求するのではなく、この要求は第II相試験に入る製品に合理的に移行させることができる。
4) ヒト臨床試験
インフルエンザ、HIV、マラリア、B型肝炎、SARS、その他多くの感染因子の予防および／または治療を目的としたプラスミドDNAワクチンの臨床試験の結果が報告されている[15;20;29;51;52][16;17;19;26;28;53]。最大5mgのプラスミドが投与されており、複数回の注射で12mgの累積投与量を受けるワクチン接種者もいる。これらのDNAワクチンは通常、針と注射器、無針注射器（Biojector装置など）、または遺伝子銃を用いて、筋肉内または皮内に投与されてきた[15;16;19;20;29;51–53]。
これらの第I相臨床試験は、DNAワクチンが試験参加者の免疫反応を安全に誘導できるかどうかを決定するためにデザインされた。様々な免疫原性パラメータがモニターされ、これにはワクチンコード化タンパク質に対して産生される抗体の量やアイソタイプ、PBMCの活性化や増殖、サイトカインの産生、抗原特異的細胞傷害活性の発現などが含まれる。B細胞とT細胞の両方が刺激された証拠が報告されているが、第I相DNAワクチン試験で惹起された免疫応答の大きさは控えめであった[15;17;20;29;51;52]。プラスミドの生体内試験での取り込み、発現、持続性を高める、免疫アジュバントを併用する、あるいはタンパク質やウイルスベクターで再免疫することにより、DNAワクチンの免疫原性を改善しようとする取り組みが進行中である。
ワクチン試験の参加者はすべて、臨床的、血液学的、生化学的異常を検出するために注意深くモニターされている。DNAワクチン接種後の主な有害事象は報告されていない。疼痛、腫脹、発赤を特徴とする注射部位の一過性の軽度～中等度の炎症が最も典型的な副反応であった[15;16;19;20;29;51–53]。
5) 結論
この著作では、予防用DNAワクチンの製造と試験に関するFDAの現行ガイダンスの概要と、DNAワクチン開発に対するガイダンスの影響について述べている。FDAのガイダンスは、DNAワクチンの製造、免疫原性、安全性に関連する問題に関して得られた理解を反映し、時間の経過とともに発展してきた。これらの変更の多くは、規制要件の緩和を伴うものであり、例えば、i)初期臨床開発におけるロットリリース試験のための力価測定法の選択において、スポンサーに大きな柔軟性を提供する、ii)DNAワクチンが自己免疫を誘発するかどうかを特に評価するためにデザインされた前臨床試験の要件を撤廃する、iii)特定のDNAプラスミドの生体内分布、持続性および／または統合性試験の実施の必要性を低減する、などである。
現在臨床評価中のDNAワクチンは、ヒトにおいてわずかな免疫応答しか得られていない。そのためスポンサーは、プラスミドやその送達方法を変更したり、他のタイプのアジュバントやワクチンと併用することにより、ワクチンの免疫原性を高めることを目的とした新規戦略を追求している。このような新しいアプローチが免疫原性に影響を与えることが期待されているが、このような戦略が安全性を低下させるという証拠はほとんどない。従って、第I相試験の開始前に詳細な毒性学的試験と広範な製品の製造、安定性、一貫性に関するデータを求めるFDAの要件を再考することは時宜を得たものである。このようなデータの必要条件を第Ⅱ相臨床試験に入る製品にシフトすることで、認可可能な製品に進展する見込みのない「候補」プラスミドについて、時間と費用のかかる試験を実施する必要性を軽減し、新規DNAワクチンの開発を加速することができる。