ブログ記事：mRNAワクチン中の外来DNA
Foreign DNA in the mRNA Vaccine

Foreign DNA in the mRNA Vaccine

近年、mRNAワクチンの開発と応用は大きな進歩を遂げている。かつては実験室にしか存在しなかったものが、今ではmRNAワクチンを何度も接種することで、私たちの多くにとって現実のものとなった。この技術は現在、将来の医療介入のための有望なツールと見なされている。近い将来、さまざまな病気と闘うために、より多くのmRNAベースのワクチンが市場に登場することが期待されている。その概要はこちらをご覧ください。

現在、Covid-19ワクチン接種用のmRNAワクチンは世界で6種類承認されており、そのうち2種類はEUで承認されている。欧州医薬品庁（EMA）は、承認されたこれらのmRNAワクチンの安全性プロファイルを非常に安心できるものと分類している。しかし、最近「コロナワクチン中の外来DNA」の問題を扱った報道が物議を醸し、注目が高まっている。

情報源

• コロナワクチンに含まれるDNA汚染は「常軌を逸している」：フロリダ州軍医総長がワクチン中止を求める声を説明
• ファクトチェックフロリダ州軍医総長が指摘したワクチンDNAリスクの証拠なし
• Covid-19ワクチンに含まれる有害なDNAに関する虚偽の主張が再流行
• コロナワクチンのDNA汚染、米国医師・外科医学会誌に掲載
• ファクト・チェックコビッド・ワクチンのmRNAにがんを引き起こす。「グリーンモンキーDNA」が検出された証拠はない
• mRNAワクチンにおけるDNA汚染を発見したゲノミクスの専門家、規制当局のがんリスクに関する嘘を告発
• DNA不純物疑惑で気分操作

私たちの健康にとってmRNAワクチンが本質的に重要であることを考えると、正確な背景と批判的な視点を詳しく見てみることは興味深い。

公共の場での議論では、科学的な議論が文脈から取り去られ、一般的な説明と混同されることが多い。特に政治的、経済的な利害が絡む場合、公の場での言論における客観性はますますないがしろにされているように思われる。この問題を明らかにすることは、科学的な観点から重要であるだけでなく、社会政治的な文脈にも関連している。

本稿の目的は、専門文献における高度に専門的な科学的説明と、メディアにおける一般的に理解しやすい説明との間に橋渡しをすることである。ワクチン中の外来DNA」というトピックに関する詳細な知識を伝えることで、複雑なプロセスをより多くの読者に理解してもらうことを目的としている。

したがって、この記事の各セクションは、連続した順序で読むことをお勧めする。こうすることで、情報が体系的に積み重なり、トピックをより包括的に理解することができる。

このテーマに深く関わることで、興味を持った読者は知識のベースを広げ、根底にあるつながりをより深く理解することができる。この文脈において、知識は極めて重要なリソースとなる。ワクチン開発に関与するプロセスをよりよく理解している個人は、このような知識を持たない人が他人の発言や信念に頼るのとは対照的に、十分な情報に基づいた意思決定を行う可能性が高くなる。

1. ワクチン中の外来DNAの発見

2023年4月11日にOSF Preprintsプラットフォームで発表された研究によると、ファイザー社およびモデルナ社のCOVID-19 mRNAワクチンのバッチに、欧州医薬品庁（EMA）の定める330ng/mgおよびFDAの定める10ng/doseを超えるDNAの混入が確認された。これらのDNA汚染は「外来DNA」と呼ばれ、人体に本来存在しない遺伝物質を意味する。この研究は、このテーマに関する研究の始まりである。

この研究は、ケビン・マッカーナンと彼のチームの指揮のもとに行われた。ケビン・マッカーナン博士はアメリカの遺伝学者、植物生物学者である。当初はマサチューセッツ工科大学（MIT）でヒトゲノム計画の研究開発部門の責任者を務めた。その後、メディシナル・ゲノミクス社を設立し、CSO（最高科学責任者）を務める。バイオテクノロジー業界、特にDNAシーケンシングとゲノミクス・プロジェクトにおいて豊富な経験を有する。専門は次世代シーケンサー技術にまでおよび、DNA解読のための手法や技術の開発に尽力。

2023年10月19日、ファイザー社とモデルナ社のmRNA製品にDNAが混入していることを調査した別の研究が発表された。この研究の主著者はDavid Speicher博士で、共著者としてKevin McKernan博士が挙げられている。

私たちの研究では、スパイク遺伝子、ORI（複製起源）、SV40エンハンサー遺伝子のDNAコピーを測定しました。ファイザー社のSV40エンハンサー・プロモーター、ORI、ウイルス・スパイクの負荷は1回あたり1860億コピーに達します。

ORIとスパイクDNAの数百万コピーがモデルナのバイアル瓶からも検出されたが、SV40エンハンサー遺伝子は検出されなかった。研究

このことから、COVID-19ワクチンに外来DNAが含まれているのではないかという議論が始まった。

2. 研究結果の爆発性は？

2.1. mRNAワクチンにおけるDNAの重要性

BioNTechのショートビデオで説明されているように、mRNAワクチンの製造は、ワクチンの基礎となる遺伝情報、特にDNAを特定することから始まる。この場合、それはSARS-CoV-2ウイルスのスパイクプロテインDNAである。ワクチン製造に十分な遺伝物質を得るために、まずこのDNAを複製する。この複製プロセスには様々な方法がある。複製されたDNAは次にmRNAを合成するための鋳型として使われる。産生されたmRNAはスパイクプロテインの遺伝情報を運ぶ。

2.2. BioNTech mRNAワクチンの製造工程

BioNTech mRNAワクチンの欧州医薬品庁（EMA）評価報告書の18ページには、臨床試験で使用された工程1と大量生産で採用された工程2という2つの異なる製造工程が記載されている。

工程1では、ポリメラーゼ連鎖反応PCR法を用いてスパイクプロテインDNAの複製を行う。工程2では、スパイクプロテインDNAの複製はバクテリアを用いて行われる。ワクチンの需要に迅速に対応することが急務であるため、「工程2」が大量生産の標準として確立されている。

イスラエルの研究者であるジョシュア・ゲツコウとレツェフ・レヴィは、この問題を初めて世間に知らしめた。彼らは、法的手続きによって徐々に公開されてきたファイザー社の文書を分析した（こちら：訴訟と裁判所命令）。この分析結果は、2022年5月に『British Medical Journal』に掲載された。そこには次のように書かれている：

“2020年10月、ファイザー/バイオエンテックBNT162b2（Comirnaty）臨床試験（C4591001）のプロトコルが修正され、臨床試験で使用されたほぼすべてのワクチン用量が、”プロセス1 「と呼ばれる方法で製造された」臨床バッチ「から得られたことが示された。しかし、承認後の」緊急供給「のための大規模な流通のために、新しい製造方法である」プロセス2 「が開発された。その違いは、RNAの転写に使用するDNAテンプレートや精製段階、脂質ナノ粒子の製造工程の変更などである。注目すべきは」プロセス2 “のバッチはmRNAの完全性が大幅に低いことが示されたことである。プロトコルの修正では、「プロセス2」で製造されたBNT162b2の各ロットは、16歳から55歳の約250人の参加者に投与され、無作為に選ばれた250人の「プロセス1」バッチのレシピエントと免疫原性と安全性の比較分析が実施されることになっている。我々の知る限りでは、この「工程1」と「工程2」の投与量の比較に関する公表された報告はありません。”

言い換えれば、承認プロセスは『工程1』の製造工程から得られた製品に基づいている。これらのmRNAワクチンは22,000人のボランティアに投与され、有効性と安全性の主張はこれらの人々のデータに基づいている。
しかし、mRNAワクチンの世界展開には、まったく異なる製造工程である「工程2」が使用された。この製法で製造されたワクチンは、250人のボランティアに対してのみテストされた。

この点に関して、EMAはバイオエヌテックのmRNAワクチンの評価報告書32ページで次のように指摘している：

「CQA（Critical Quality Attribute：重要品質特性）mRNAの完全性に関して、原薬工程 1と 2 で製造されたバッチ間で観察された差異と、特性評価データの欠如に基づき、提案された。1 つの受入基準の比較可能性、特性評価、臨床適格性に関して、MO（Major Objection：重大な異議）が提起された。活性物質の生物学的特性は限定的であり、機能性に対処するための追加データと議論が要求された」

McKernanとSpeicherによる調査結果は、「工程2」で製造されたワクチンバッチに関するものである。

mRNAワクチンの安全性プロファイルを決定する上で、ワクチンの組成、純度、安定性など、ある種の特徴が極めて重要である。ワクチンの純度は、潜在的に有害な汚染物質を含まないことを保証するために不可欠です。汚染物質は望ましくない免疫反応やその他の副作用を引き起こす可能性があります。

「工程2」では、スパイクプロテインのDNAをバクテリアで複製し、DNA断片、バクテリアの残留物、工程に関連した不純物を除去するために精製を行う。

モデルナも同様のプロセスを採用しているようだ。研究

しかし、Speicher DJらの研究は、ワクチン溶液の精製が必ずしも効果的でない可能性を示唆している。この研究では次のように述べている：「これらのデータは、これらのワクチン中に1回投与あたり数十億から数千億のDNA分子が存在することを示している。フルオロメトリーを用いると、全てのワクチンはFDAとWHOが設定した残留DNAのガイドラインである10ng/用量を188-509倍超えている。”

このような状況とその潜在的な意味をよりよく理解するために、以下の章では、mRNAワクチンの製造工程と品質保証の方法について、より詳しく紹介する。

3. ナッチェルの製造工程

すでに述べたように、「プロセス1」と「プロセス2」は、主にコロナウイルスのスパイクプロテインの設計図を含むmRNAを産生するための鋳型となるスパイクプロテインDNAの複製方法が異なる。

工程1」はDNA複製のためにPCR装置を利用するもので、試験管内試験の手順であり、「工程2」はDNA複製のためにバクテリアを利用するもので、生体内試験の手順である。

以下の表は、ファイザーの製造工程における類似点と相違点を大まかにまとめたものであるが、実際には異なる場合がある。

(*) EMA「Covid-19 Vaccine Comirnaty EPAR」（セクション 2.2.、32 ページ）に基づく製造工程に関する情報。

3.1. 遺伝情報の抽出

最初のステップは、目的のタンパク質（この場合はコロナウイルスのスパイクプロテイン）の遺伝情報（DNA）を特定することである。

図1：SARS-CoV-2スパイクプロテインの遺伝情報がDNAの鋳型となっている　

スパイクプロテインの同定されたDNAは、製造工程においてmRNA合成の鋳型となる。この文脈では、同定されたDNA配列はしばしば「DNAマトリックス」または「DNAテンプレート」と呼ばれる。

スパイクプロテインのDNAにアクセスするには、まず血液や組織などの感染サンプルからウイルスを分離しなければならない。その後、ウイルスの塩基配列を決定し、ウイルスDNA中のヌクレオチド（遺伝子の「文字」）の正確な配列を決定する。こうして得られた遺伝子情報は公開データベースに登録される。これにより、研究者やバイオ技術者は、たとえウイルスを分離していなくても、過去に発表された遺伝子データにアクセスすることができる。ウイルスの塩基配列データがあれば、バイオ技術者はスパイクプロテインを合成生産することができる。

研究チームや企業が、他の研究者から提供された公開データベースの既発表遺伝子データにアクセスすることは一般的である。このアプローチについては、SARS-CoV-2に関する考察「World Economic Forum Panel on Preparing for the Next Pandemic」（議事録：12:20-13:51）の中で、イルミナのCEOであるFrancis Aurelio deSouza（2016年から2023年まで）が簡単に説明している。

3.2. スパイクプロテインDNAの複製

3.2.1.スパイクプロテインDNAの複製 – 工程1
3.2.2.スパイクプロテインDNAの複製 – 工程2

3.2.1.スパイクプロテインDNAの複製 – 工程1

工程1」は、試験管内試験の手順であるDNA複製のためにPCR装置を利用する。試験管内試験’という用語は、生体の外で行われる実験やプロセスを指し、一般的には試験管やペトリ皿の中で行われる。PCRは、生体内で起こるDNA複製を模倣している。

COVID-19の大流行が始まって以来、PCRという略語は誰もが知っている。しかし、PCRがどのようなもので、どのように機能するのかを知っている人は非常に少ない。そこで、ここではその概要を簡単に説明する。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）

PCRとはPolymerase Chain Reaction（ポリメラーゼ連鎖反応）の略である。ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）の助けを借りて、試験管内試験で特定のDNA断片のコピーを多数生産することができる。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を開始するためには、さまざまな材料と装置が必要：

a) 複製するDNAテンプレート（図1参照）

b)ヌクレオチド：新しいDNAを合成するには、DNAの構成要素である多くのヌクレオチドが必要である。遺伝情報を運ぶヌクレオチドは全部で4種類ある：アデニン（A）、チミン（T）、シトシン（C）、グアニン（G）である。

図2：ヌクレオチド

c)DNAポリメラーゼ：DNAポリメラーゼはDNA合成において重要な役割を果たす酵素である。DNAポリメラーゼは建築業者に例えられる。DNAポリメラーゼは既存のDNAを鋳型とし、ヌクレオチドのビルディングブロックを使って新しいDNA鎖を構築する。DNAポリメラーゼは、これらの構成要素を正しい順序で組み立て、DNAのコピーが元のDNAと全く同じ形になるようにする。

d)プライマー：プライマーはDNA合成の出発点となる短いDNA配列である。プライマーはDNAポリメラーゼのガイドとして働き、DNAのコピーをどこから始め、どの方向に進めるべきかを示す。

図3：DNAポリメラーゼ酵素とプライマーの模式図

e)緩衝液：緩衝液はPCRのための安定した制御された環境を作り、DNAポリメラーゼが効率的に働くようにする。pHを最適化し、酵素活性を安定させ、DNA合成を成功させるために必要なイオン（通常はマグネシウムイオン）が存在するようにする。

簡単に言えばPCRにおける緩衝液はスープのダシのようなものである。PCR反応は、すべての材料が完璧に相互作用しなければならない複雑な料理を作るようなものだと考えてほしい。緩衝液は出汁の役割を果たし、味に影響を与えるだけでなく、すべてがスムーズに進むようにする。要するに、緩衝液はPCRを成功させる。「出汁」のようなものであり、DNAポリメラーゼが主役の「料理」なのである。

f)サーモサイクラー：PCRの温度サイクルを自動的に行う装置。様々なPCRステップの温度を正確にコントロールすることができる。

図4：緩衝液とサーモサイクラーの模式図

ポリメラーゼ連鎖反応の手順

DNA鋳型、ヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、プライマーなどのすべての成分を、緩衝液の入ったチューブに加える。その後、チューブをサーモサイクラーに入れる。基本的な手順には、変性、プライマーのアニーリング、DNA合成が含まれる。

ステップ1 – 変性（分割）：PCRはDNAテンプレートをサーモサイクラーで加熱することから始まる。DNAはおよそ94-98℃で20-30秒間加熱される。この過程でヌクレオチド間の結合が切断され、DNAの2本鎖が分離する（変性）。二本鎖DNAから二本の一本鎖DNA分子が形成され、これが複製用の鋳型となる。

図5：変性

ステップ2-プライマーのアニーリング：第2ステップでは、反応混合物を約50-65℃に冷却する。ここでプライマーはDNAの個々の鎖に結合する。プライマーはDNA合成の出発点となる。PCRでは、増幅したい領域を示すために、DNAの各鎖に1つずつ、合計2つのプライマーが使われる。相補的塩基対形成の原理が適用される（アデニンはチミンと、グアニンはシトシンと）。

図6：プライマーのアニーリング

ステップ3 – DNA合成：このステップは、増幅（ラテン語 amplificatio：増幅）、伸長（ラテン語 elongare：伸ばす）、重合（ギリシャ語 poly：多数、ギリシャ語 meros：部分）としても知られている。温度はDNAポリメラーゼの最適作業温度（約70℃）に設定される。DNAポリメラーゼはプライマーに結合し、新しいDNA鎖の合成を開始する。その間、DNAポリメラーゼはDNA鋳型の一本鎖を3′から5′の方向に読み取り、新しいDNAを5′から3′の方向に合成する。これは塩基対形成規則（AとT、GとC）を用いて行われ、2本の新しい二本鎖ができる。

図7：DNA合成

サイクルの繰り返し

得られたDNA二本鎖は、次のサイクルの鋳型となる。ステップ1から3を、必要なDNA量が得られるまで繰り返す。サイクルごとにDNA量は倍増する。ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）」という用語は、この技術の周期的性質を表している。これは、プロセスが連続したサイクルで繰り返され、各ラウンドでDNAが指数関数的に増加することを示している（1-2-4-8-16-32など）。

図8：DNAの指数関数的増幅

3.2.2.スパイクプロテインDNAの複製 – 工程2

工程2」は、DNAの複製に生きた細胞、具体的にはバクテリアを利用するもので、これは生体内の手順である。In vivo（ラテン語で「生きているうちに」という意味）とは、科学においては、生きている生物の中で起こるプロセスを指す。

a)なぜバクテリアなのか？

進化の核心は、遺伝物質の絶え間ない変化にある。この柔軟性は、生物が何世代にもわたって新しい環境条件にうまく適応していくために極めて重要である。生物が遺伝物質を変化させる方法には様々なものがある。突然変異は既存の遺伝要素を変化させ、遺伝子導入は新たな要素を加える。

高等多細胞生物の場合、遺伝子の混合は通常、同じ種の個体同士の交配によって起こる。父方の生殖細胞と母方の生殖細胞が結合すると、ユニークな遺伝的構成を持つ新しい生物が誕生する。

対照的に、バクテリアのような単細胞生物は有性生殖を行わず、単純な分裂によって生殖する。分裂の際、細菌細胞は2つの同一の娘細胞を形成する。このプロセスは、細胞内の遺伝物質の複製から始まり、細胞自体の分裂がそれに続く。

図9：バクテリアの分裂

バクテリアのような原核生物では、生存、繁殖、進化に必要なことはすべて単一細胞内で起こる。とはいえ、彼らは遺伝子の交換にも努めており、適応性が高いと考えられている。

ヒトのような真核生物とは対照的に、バクテリアの遺伝物質であるDNAは核の中にパッケージされていない。DNAは細胞の内部、いわゆる細胞質に自由に浮遊している。

図10：バクテリアの構造

遺伝物質の大部分は、細菌染色体と呼ばれる単一のDNA分子に保存されている。さらに細菌は、プラスミドと呼ばれる独立したリング状のDNA分子を有している。これらのプラスミドは、しばしば重要な付加的遺伝情報を運ぶため、遺伝子導入において重要な役割を果たす。[遺伝子工学]

プラスミドによって、バクテリアはこの追加情報を互いに交換することができる。この遺伝子交換によって、バクテリアは新しい遺伝情報を迅速に獲得することができ、環境への適応、抗生物質への耐性、新しい食物源の利用能力などの利点を得ることができる。このメカニズムにより、バクテリアは変化する環境条件に効果的に適応し、うまく生き残ることができるのである。

バクテリアに遺伝物質を導入し、操作する能力、特にプラスミドを使用する能力は、遺伝子工学の発展における重要なマイルストーンとなった。

遺伝子工学の誕生は、1973年にスタンリー・コーエンとハーバート・ボイヤーが行った実験にまで遡ることができる。この実験で、彼らはプラスミドをバクテリアに導入し、挿入した遺伝子がバクテリア内で発現することを実証した。これは、ある生物種から別の生物種への遺伝子導入に成功した最初の試みであった。使用されたプラスミドは抗生物質耐性遺伝子を持っていたため、科学者たちは形質転換されたバクテリアとそうでないバクテリアとを区別することができた。このブレイクスルー研究は、現代の遺伝子工学の基礎を築いた。[コーエン・ボイヤー実験]

b) 大腸菌(Escherichia coli)

科学や研究において、大腸菌（Escherichia coli）はいくつかの理由でよく使われる：

• 大腸菌は実験室で簡単に培養・増殖できる。
• 大腸菌の複製時間は比較的短く、通常20分から30分である。
• 大腸菌のゲノムはよく研究され、理解されている。
• 大腸菌は遺伝子操作が容易である。
• 大腸菌の培養は、他の生物に比べて費用対効果が高い。

図11：大腸菌

大腸菌は分子生物学と遺伝学の観点から最もよく研究されている生物であり、それゆえ遺伝学者のペットとしても知られている。

こうした理由から、大腸菌はワクチン開発にも使われている。

c) プラスミド

プラスミドは細菌の染色体とは別に存在する追加のDNA分子である。プラスミドは細菌染色体よりも小さく、細胞内でその数を変えることができる。プラスミドは二本鎖DNAとして存在する。プラスミドは通常リング状をしており、これはDNAが閉じた円の中に配置されていることを意味する。このリング状の構造が、プラスミドを真核生物（ヒトなど）の細胞核に見られる線状DNAと区別している。

図12：大腸菌のDNAの模式図

プラスミドは様々な遺伝情報を運ぶことができる。例えば、抗生物質耐性の遺伝子、特定のタンパク質を生産する遺伝子、あるいはその他の有用な遺伝子が含まれているかもしれない。

科学者がプラスミド上にどの遺伝子が存在し、それらがどのように配置されているかを確認するために、いわゆる「プラスミドマップ」を使用する。プラスミドマップとは、プラスミドDNAの遺伝子構造を模式的に表したものである。以下の図は基本的な用語を説明するためのものである。

図13：プラスミドマップ-プラスミド遺伝子の模式図

ORI（複製起点）：プラスミドDNAには、「複製起点」（ORI）あるいは単に「ORI」と呼ばれる特別な領域がある。複製起点はプラスミドの複製開始点として働く。細菌が繁殖の必要性を感じると（好都合な環境条件と内部シグナルの下で）、この起点が活性化され、プラスミドはそれ自身のコピーを作る。プラスミドの複製を成功させるためには、このORIが細菌と一致しなければならない。ORIと細菌が適合していれば、プラスミドは細胞分裂を離れても、独立して複製することができる。

選択可能なマーカー：特定の条件下で細菌に生存の利点を与える特別な遺伝子セグメントである。これらはしばしば抗生物質耐性遺伝子であり、細菌が特定の抗生物質を含む培地で生き残ることを可能にする。

プロモーター：プロモーターは遺伝子の活性を制御する特定のDNA領域である。プロモーターは遺伝子発現を開始するシグナルとして働き、遺伝子からタンパク質が産生されるようにする。プロモーターが重要なのは、タンパク質合成のタイミングと量に影響を与えるからである。プラスミド上の特定の遺伝子がいつ、どの程度転写されるかを制御し、それによって対応するタンパク質の生産を制御する。

制限部位：制限部位とは、プラスミド上の特定のDNA配列のことで、制限酵素によって認識され切断される。制限酵素は特定の配列でDNAを切断する傾向があるタンパク質である。細菌は防御戦略の一環として制限部位を利用する。細菌は自分のものではない外来DNAに遭遇すると、制限酵素を使ってこのDNAを切断し破壊することができる。

d) 遺伝子工学におけるプラスミド

制限酵素は本来、外来DNAに対するバクテリアの防御の一部であるが、遺伝子工学の科学者たちは、遺伝子導入のために特別にこれらの酵素を使用している。

例えば、研究者がプラスミドにDNAを挿入したい場合、制限酵素を使うことができる。これらの酵素は小さな分子はさみのような働きをする。制限酵素はDNA中の特定の文字列（ヌクレオチド）を認識する。この配列は制限部位と呼ばれる。制限酵素は特定のDNA配列に出会うと、それに結合し、その特定の位置でDNAを切断する。DNAの両鎖を切断し、その部位でDNAを切断する。この切断によって2つの別々のDNA断片ができる。これらの断片は、この隙間に外来DNAを挿入し、DNAリガーゼと呼ばれる酵素で末端を再結合させることにより、さらに利用することができる。

このメカニズムは制限消化と呼ばれる。これにより、プラスミドに外来DNAを導入することができる。これは、標的を絞った遺伝子操作を行ったり、細菌に遺伝子を導入したりするための、遺伝子工学における重要な技術である。

図13-bは、インサート遺伝子とも呼ばれる遺伝子が挿入されたプラスミドマップである。

挿入遺伝子：挿入遺伝子とは、プラスミドに導入される実際の遺伝子または遺伝子配列のことである。これは特定のタンパク質をコードする遺伝子であったり、検査または発現される他の遺伝情報であったりする。

プラスミドとは何か、そして何に使われるのかについて、アニメーションで短くまとめたものがここにある。

e) ワクチン製造におけるプラスミド

プラスミドはそれ自身を複製する能力があるため、研究やバイオテクノロジーに非常に有用である。あらかじめプラスミドに導入された特定の外来DNAを大量に生産するために使用することができる。

f) スパイクプロテインDNAのプラスミドへの組み込み

SARS-CoV-2のスパイクプロテインのDNAはプラスミドに挿入される。特殊な酵素が遺伝子のはさみ（制限酵素）と接着剤（リガーゼ）の役割を果たす。プラスミドを特定の部位で切断し、スパイクプロテイン遺伝子を挿入する。遺伝子が挿入されると、プラスミドは再び閉じられる。

図14：SARS-CoV-2スパイクプロテイン遺伝子のプラスミドへの挿入

しかし、スパイクDNAは単独でプラスミドに導入されるのではなく、他の遺伝要素とともに導入される。

冒頭ですでに述べたように、Speicherらはファイザーとモデルナのワクチンを調査している間に、ORI、SV40成分、抗生物質耐性遺伝子など他の配列を発見した。

ファイザーとモデルナのプラスミドカードを簡略化して見てみよう。より詳細な表現はこちらをご覧ください。

図15：ファイザーとモデルナのプラスミドカードの簡略図

ORI（複製起点）：ORIはDNA複製の起点となる。ORIは複製装置にDNA複製を開始する場所を知らせるシグナルを提供する。

Spike-Protein-Gene：スパイクプロテイン遺伝子は、SARS-CoV-2ウイルスの表面に存在し、宿主細胞に感染する際に重要な役割を果たすスパイクプロテインをコードしている。

SV40-遺伝子-成分SV40はSimian Virus 40の略で、サルに見られるウイルスである。SV40はサルにもヒトにも感染する。SV40エンハンサー遺伝子とSV40複製起点(Ori)は、細胞内での遺伝子発現とDNA複製を促進するために分子生物学でよく使われるツールである。(遺伝子発現とは、遺伝子の遺伝情報が機能的タンパク質に変換される過程を指す）。SV40遺伝子の構成要素はファイザー社でのみ発見された。

抗生物質耐性遺伝子：バクテリアを抗生物質から守る形質をコードする遺伝子。遺伝学では、しばしば選択可能なマーカーとして用いられる。プラスミドを介して外来遺伝子を取り込んだバクテリアだけが、対応する抗生物質が存在する環境下で生き残る。このため、生産工程では、改変プラスミドをうまく取り込んだ細菌だけを得ることができる。モデルナは「カナマイシン耐性遺伝子」を、ファイザーは「Neo/Kan耐性遺伝子」を使用している。Neo/Kan耐性遺伝子とは、抗生物質のネオマイシンやカナマイシンに対する耐性を担う遺伝子の略称である。

g) 修飾プラスミドのバクテリアへの導入

スパイクプロテイン遺伝子を持つようになった改変プラスミドを、次に大腸菌に導入する。このプロセスは形質転換と呼ばれる。細菌はプラスミドを取り込み、細胞構造に組み込む。

分子生物学や遺伝子工学では、プラスミドが外来の遺伝情報の輸送や複製に使われる場合、しばしばベクターと呼ばれる。ベクターは、外来DNAを宿主細胞（細菌）内に導入するためのキャリアとしての役割を果たす。

図16：ベクターとしてのプラスミド

h) 細菌の増殖

バクテリアは発酵槽に入れられる。発酵槽はバイオリアクターとも呼ばれ、バイオテクノロジーにおいて抗生物質、酵素、ビタミン、ワクチンなどの製品を生産するために使用される装置である。大規模生産にも使用できる。発酵槽は、温度、pH値、通気、攪拌速度、栄養供給などの因子を正確に制御することができる。

発酵槽内の栄養培地には、バクテリアに必要な栄養素がすべて含まれている。このような好条件の下で、バクテリアは増殖を始める。この増殖の間に、バクテリア内のプラスミドも複製される。

スパイクプロテイン遺伝子を組み込んだプラスミドを取り込んだ菌だけが増殖するように、発酵槽内の菌に抗生物質を添加する。スパイクプロテイン遺伝子は抗生物質耐性と同じプラスミドにあるため、改変プラスミドをうまく挿入した細菌だけが生き残る（図15と16参照）。

大腸菌は20-30分に1回分裂する。数日以内に、スパイクプロテインの遺伝情報を持つ改変プラスミドを持った数兆個のバクテリアのコロニーが発酵槽の中で発達する。

i) 細菌の採取

大腸菌細胞がSARS-CoV-2スパイク配列を持つプラスミドを産生した後、細胞を採取する。「採取」とは、細胞を培地から取り出して回収するプロセスを指す。採取は通常、遠心分離によって行われ、容器の底に細胞を濃縮する。

j) 修飾プラスミドの単離

改変プラスミドの単離は、細菌を溶解し、その後不純物を除去するための様々な精製工程を経て達成される。「溶菌」とは、大腸菌の細胞膜を意図的に破壊し、細胞内容物を放出させることである。

図17：細菌の採取と溶解

溶菌過程で細胞膜が破れることにより、DNA、タンパク質、その他の分子からなる細胞内容物全体が放出される。溶解後、バクテリアの細胞内容物と細胞膜の残りの部分が溶液中に見出される（図17と18）。

図18：バクテリア溶解後の溶液の追加成分

従って、溶解後、抽出した物質を様々な方法で精製し、修飾プラスミドを単離する。精製工程では、タンパク質や他の細胞成分などの不要な不純物を除去する（セクション3.5.2.工程2の合成mRNAの精製を参照）。

この段階では、プラスミドは環状構造で存在する。

k) スパイクプロテインDNAの直線化

単離されたプラスミドは、制限酵素を用いて特異的に切断される。この制限酵素はSARS-CoV-2スパイクの特異的DNA配列を認識し、プラスミドから切り出す。この切断によってSARS-CoV-2スパイクの配列は直鎖状となり、転写に利用しやすくなる。直鎖DNAは一般に転写を担当する酵素によりよく認識される。

図19：スパイクプロテインDNAの直線化

3.3. RNAを生成するための転写

転写とは、DNAからRNAが合成されるプロセスのことであり、言い換えれば、転写とはDNAをRNAに「書き換える」ことである。体外転写（IVT）は、RNAポリメラーゼとして知られる酵素を用いて行われる（図20参照）。

図20：転写-DNAをRNAに書き換える

トランスクリプション・プロセスは主に3つの段階からなる：

開始：RNAポリメラーゼはDNA鋳型の最初に結合する。RNAポリメラーゼはプロモーターとして知られる特定のDNA配列を認識し、これが転写の開始点を決定する。転写を開始するには、まずDNA鋳型を変性させる。これは、DNAの二重らせんを分離し、一本鎖DNAをRNA合成に利用できるようにすることを意味する。

伸長：次に、RNAポリメラーゼがDNA鋳型に沿って移動し、それを読み取る。ポリメラーゼは5′から3′へと移動する（これについてはこちら）。読み取り中、RNAポリメラーゼはRNAヌクレオチド（RNAの構成要素）を使ってRNA鎖を構築する。これは、RNAヌクレオチドとDNA鋳型の塩基との間に相補的な塩基対を形成することによって行われる。塩基対形成はアデニン（A）とウラシル（U）、シトシン（C）とグアニン（G）の間で行われる。

終結：転写はDNA上の特定の停止シグナルで終了する。RNAポリメラーゼがDNAから離れ、合成されたRNAが放出される。

二本鎖DNAから一本鎖RNAが形成される。DNAとRNAは組成も構造も似ているが、大きな違いがある：

機能DNAには生物の構造と機能に必要な遺伝情報が含まれている。RNAは遺伝情報をタンパク質に変換する役割を担っている。

構造：DNAは通常、2本の鎖が絡み合った二重らせんとして配列している。RNAは通常一本鎖であるが、局所的な二重らせん構造をとることもある。

塩基：どちらもアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）を含むが、DNAではチミン（T）が使われ、RNAではチミンの代わりにウラシル（U）が使われる。つまり、DNAの塩基対はアデニン・チミン（A-T）とシトシン・グアニン（C-G）であるのに対し、RNAではアデニン・ウラシル（A-U）とシトシン・グアニン（C-G）である。

安定性と寿命：DNAは通常、RNAよりも安定していて寿命が長い。RNA分子は細胞内でより早く分解されるが、これはウラシルの存在によるものである。ウラシルは不安定な塩基で、酵素によって容易に分解される。

なぜ生物はRNAにウラシルを使うのか？
RNAの迅速な分解は、細胞が変化に素早く適応するのに役立つ。RNAの寿命が短いため、細胞は遺伝情報を迅速に変更することができ、これは細胞分裂や新しい環境条件への適応といったプロセスにおいて特に重要である。ウラシルはまた、細胞が遺伝子を素早くオン・オフすることを可能にし、これは異なる条件に適応するために極めて重要である。まとめると、RNA中のウラシルは、細胞により柔軟性を与え、遺伝情報をコントロールすることで、細胞の適応能力と生存能力に大きく影響する。

ウラシルはウリジンの構成成分であり、ウリジンはさらに糖を含む化合物である。したがって、ウリジンはウラシルと糖からなる分子であり、どちらもRNAの構成成分である（図21参照）。

図21：ヌクレオチド-RNAの基本構成要素

mRNAワクチンの製造には、ウリジンの代わりにシュードウリジンが使用され、よりゆっくりと分解される安定したRNAが確保される。[Karikoら]。

ファイザー社とモデルナ社のmRNAワクチンには、ウリジンの代わりにシュードウリジンψUが含まれている。[サイエンス]

転写の際、天然のヌクレオシドであるウリジンの代わりに、合成ヌクレオシドであるN-メチル-シュードウリジン（mψU）が人工RNAに組み込まれる（図22参照）。

図22：転写-ウリジンの代わりにシュードウリジンを用いてDNAをRNA（プレmRNA）に書き換える

しかし、転写の際には、DNA-RNAハイブリッドや二本鎖RNA（dsRNA）といった望ましくない副産物も生成される。

DNA-RNA-ハイブリッド

転写の際にDNA-RNAハイブリッドが形成されるのは、RNA鎖が一本のDNA鎖に結合するときである。この副産物はDNAの一部とRNAの一部からなり、ハイブリッド分子を生じる。

図23：DNA-RNAハイブリッド

体外転写(IVT)後、これらのDNA-RNAハイブリッドの分解は、生細胞のように自然には起こらない。このような副生成物を除去するために、特異的な精製ステップが実施される（セクション3.5.2参照）。

二本鎖RNA (dsRNA)

メッセンジャーRNA（mRNA）の試験管内転写（IVT）中に二本鎖RNA（dsRNA）が形成されることも望ましくない副産物である。[NIH – 二本鎖RNA…]。

上述したように、転写はDNA鋳型が変性、つまり2本の鎖に分離されると始まる。この時点で、RNAポリメラーゼは結果として生じた一本鎖DNA鋳型に結合し、相補的なRNA鎖の合成を開始する。変性環境などの特定の条件下では、合成されたばかりのRNA鎖は互いに相互作用し、二本鎖構造を形成する傾向がある。これは2つの方法で起こる：

分子間塩基対形成：異なるDNA鋳型から合成された2本のRNA鎖が相互作用し、塩基対を形成することができる。
分子内塩基対形成：1本のRNA鎖がそれ自身の上に折り重なり、それ自身と塩基対を形成することができる。

図24：二本鎖RNA（dsRNA）

このような副生成物を除去するために、特定の精製ステップ（セクション3.5.2参照）が採用される。

3.4. RNA処理

RNAプロセシングは、RNA（プレmRNA）を成熟した機能的mRNAに変換するために、転写後に起こる一連の修飾を含む。

ワクチン用mRNAの製造においては、真核生物（ヒトなど）の細胞で通常起こる転写と転写後修飾の自然なプロセスを模倣する努力がなされている。合成的に生産されたmRNAは、天然に存在するmRNAのある特徴を再現するように設計されている。

図25：プレmRNA

ワクチンとして機能するmRNAは、5末端の特別な保護キャップと3末端の安定化テールを含む、正常な細胞mRNAの構造を持たなければならない。これらの修飾はmRNAの安定性とタンパク質への効率的な翻訳に重要である。

したがって、プレmRNAの修飾には、保護キャップの付加（mRNAキャッピング）と安定化テールの付加（ポリアデニル化）が含まれる。

mRNAのキャッピング：mRNAのキャッピングは、RNAポリメラーゼがDNA鎖を読み取り、mRNAを合成する間に転写中に行われる。mRNAが短い断片を合成するとすぐに、7-メチルグアノシンからなる保護キャップがmRNAの5′末端に付加される。この修飾はmRNAを核分解酵素による分解から守る。

ポリアデニル化：ポリアデニル化は、mRNAの3′末端にアデニンヌクレオチドの長い鎖を結合させることにより、転写直後に起こる。このポリAテールは成熟mRNAの安定性を高め、分解から守る。ポリAテールの長さは数百ヌクレオチドにもなる。mRNAが読まれる頻度はポリAテールによって調節され、mRNAを鋳型としてタンパク質が合成される翻訳過程で徐々に短くなる。これはポリAテールが完全に除去されるまで続き、mRNAの分解につながる。

図26：成熟mRNA

3.5. 合成mRNAの精製

3.5.1.合成mRNAの精製 - 工程1
3.5.2.合成mRNAの精製-工程2

3.5.1. 合成mRNAの精製 – 工程1

PCR産物や試験管内試験転写されたRNAの精製は、取り込まれていないヌクレオチド、DNA鋳型、酵素などの汚染物質を除去するための重要なステップである。

精製にはいくつかの方法がある。EMAの「BioNTech/Pfizer COVID-19 Vaccine EPAR」（32 ページのセクション 2.2.）に記載されている製造工程に関する情報によると、「工程 1」では磁気ビーズを用いた精製が行われている。

磁気ビーズ精製

mRNAの精製には、通常、RNAに選択的に結合するように磁気ビーズを設計する。これは、ビーズ表面に特殊なプローブを付着させることで実現できる。これらのプローブは、mRNAのポリ A テールにあるアデニン（A）と相補的なチミン（T）の配列で構成されている（図 27 参照）。

図27：ポリ(A)RNA分子とポリ(T)磁性ビーズとの結合

その後、精製プロセスは次のように進む（図28参照）。

(b)磁気ビーズ上の分子は、mRNAの標的分子であるポリAテール上のアデニンに親和性を持ち、選択的に結合する。(c）磁気ビーズが標的分子と結合した後、磁場をかける。結合したmRNAを持つ磁気ビーズは磁石に引き寄せられ、血管の特定領域に引き寄せられる。(d) /strong>結合していない不純物を除去するため、新鮮な緩衝液を加えて数回の洗浄を行う。緩衝液とは、標的分子と磁気ビーズが互いに作用するのにちょうどよい状態にするための液体である。同時に、液のpHを安定させ、すべてがうまく機能するようにします。(e) /strong>結合した。mRNAを磁気ビーズから分離するために、特別な溶液である溶出バッファーを加える。溶出バッファーの条件により、磁気ビーズは結合した。mRNAを放出する。放出された。mRNA は濃縮された状態でその後の処理工程に使用することができる。

図28：磁気ビーズ精製

磁気ビーズ精製に関するさらに詳しい情報は、こことここにある。

公式情報によれば、磁気ビーズの精製は「工程1」の一部としてのみ行われる。大量生産（工程2）への移行に伴い、精製方法も変わる。この変化は、大量の精密分離に重要な役割を果たす磁力に関係している可能性がある。単純な磁石は、距離が長くなるにつれて磁力が急激に低下するため、限界があると考えられている。[sepmag]

3.5.2.合成mRNAの精製 – 工程2

プラスミドや試験管内試験転写によるmRNAの生産中に、様々な不純物が導入または生成される。[サイエンスダイレクト]

従って、目的の mRNAを含むワクチン溶液を、潜在的な汚染物質やその他の物質から精製する必要がある。潜在的な汚染物質には、DNA鋳型の残骸、二本鎖RNA、DNA-RNAハイブリッド、エンドトキシン、過剰なRNAポリメラーゼ、塩基性不純物などが含まれる。[セキュアセル]

内毒素：内毒素は細菌、より正確には大腸菌（E. coli）のようなグラム陰性細菌の毒性成分である。これらの内毒素は細菌の外膜の成分であり、生物に強い免疫反応を引き起こす。

DNAテンプレート：DNA鋳型（SARS-CoV-2スパイク配列）は転写の際に読み取られ、RNA合成の鋳型となる。これらのDNA鋳型の残骸はワクチン接種液中にまだ存在するため、純度と安全性を確保するために注意深く除去する必要がある。

二本鎖RNA（dsRNA）：転写の過程で二本鎖RNA（dsRNA）が中間産物として形成される。[PubMed]。
二本鎖RNAは、哺乳類を含む多くの生物においてウイルス感染の潜在的な指標として認識されていることから、免疫原性があると考えられている。二本鎖RNAを異物として認識し、免疫反応を引き起こす受容体には様々な種類がある。

DNA-RNAハイブリッド：転写の過程で、DNA鋳型と新しく合成されたRNAとの間でハイブリダイゼーションが起こることがある。RNAは部分的にDNAと結合し、DNA-RNAハイブリッドを形成する。このようなハイブリッドがワクチン溶液中に残存すると、望ましくない免疫学的反応やその他の予期せぬ効果を引き起こす可能性がある。

RNAポリメラーゼ：転写を行う酵素であるRNAポリメラーゼが過剰になると、汚染物質となる可能性がある。この酵素の過剰発現や不完全な除去は、望ましくない効果をもたらす可能性がある。(酵素はタンパク質に属する）。

基本的不純物：この用語は、様々な製造工程中に混入する可能性のある汚染物質を指す。これには、製造工程で使用される緩衝剤、酵素、タンパク質、その他の化学物質が含まれる。

転写された。mRNAの精製には様々な方法がある。BioNTech/Pfizer COVID-19ワクチンのEPAR」（セクション2.2,32ページ）で欧州医薬品庁（EMA）から提供された情報によると、「工程2」の製造工程では、Proteinase K消化とUFDF（限外ろ過/透析）ステップが適用される。EMA文書（17ページと40ページ）で言及されているもう一つの精製工程はDNase I処理である。

さらに、MERCKやSARTORIUSなどの大手バイオテクノロジー企業は、mRNAワクチン製造のさらなる精製段階としてクロマトグラフィーを挙げている。

公式文書には、現行のCOVID-19 mRNAワクチンの製造工程全体を通しての正確な精製ステップについての詳細な洞察は記載されていない。本稿の主な目的は、この分野の基本的な知識をわかりやすく提供することであるため、以下のセクションでは、例としてプロセスの特定の時点における精製ステップのみを説明する。精製ステップの正確な構成と順序は、実際の生産条件下では異なる可能性があり、しばしばはるかに複雑であることに注意することが重要である。[QdB] このトピックに関するさらに詳細な情報は、MERCK社（Herstellungsstrategien für mRNA-Ifstoffe und Therapeutika）およびSARTORIUS社（Overview of Sartorius Solutions serving mRNA Processing、7ページ）の刊行物に掲載されています。

以下では、以下の精製ステップを検討する：

a)DNase I処理
b)プロテイナーゼK消化
c)UF/DF（限外ろ過/透析ろ過）ステップ
d)クロマトグラフィー

a) DNase I処理

DNアーゼはDNAを切断することができる酵素である。この文脈では、DNAを「切断する」とか「消化する」といった言葉がよく使われる。DNアーゼは小さなハサミのような働きをし、DNAをより小さな断片に切断する。DNアーゼには様々な種類があり、DNAを特異的あるいは非特異的に切断する能力が異なる。

ウシの膵臓から得られることが多いDNase Iは、DNAを非特異的に切断する。

ワクチン製造において、DNase Iは溶液中の既存のDNAをより小さな断片に切断するために使用される。これらの小さなDNA断片は、その後の精製工程でより容易に除去することができる。

図29：精製ステップとしてのDNase Iの模式図

DNAに対するDNase Iの作用は、マグネシウムイオン（Mg2+）とマンガンイオン（Mn2+）の存在によって変化する。イオンの種類は、DNase Iの特異的な切断パターンに影響し、一本鎖(ssDNA)と二本鎖(dsDNA)のDNA断片を含む、異なるタイプのDNA断片が生じる可能性がある。[bioswisstec、YEASEN]。

Mg2+の存在下で、DNase Iは二本鎖DNAをランダムに選ばれた部位で独立に切断する。その結果、一本鎖DNA断片（ssDNA断片）が生じる。

Mn2+の存在下、DNase IはdsDNAの両鎖をほぼ同じ位置で切断する。このため、切断された断片が重なったり、共通する部分があると、二本鎖DNA断片（dsDNA断片）が形成される。末端が張り出した一本鎖DNA断片（ssDNA断片）も形成される。

図30：MgとMnの関数としてのDNase Iの模式図

ファイザー・BioNTechのサプライヤーであるサーモフィッシャーサイエンティフィック社が、オンライン記事でDNase Iの有効性について論じている。この文章は、DNase Iの有効性が、最初のDNA汚染など様々な要因に依存することを明らかにしている。DNaseⅠは二本鎖DNA（dsDNA）を効率的に切断できるが、一本鎖DNA（ssDNA）に対する活性は500倍も低いと説明されている。RNA-DNAハイブリッドに対する活性となると、dsDNAに対する活性の1-2%以下である。この論文では、RNAサンプルを調製する際に、DNAの分子鎖を1本残らず完全に除去することは困難である可能性が高いと指摘している。

b) プロテイナーゼK消化

プロテイナーゼKはプロテアーゼに属する酵素である。これらの酵素はタンパク質を加水分解する能力を持っており、ペプチドやアミノ酸のような小さな断片に分解することを意味する。ワクチン溶液中のタンパク質は、細菌成分や製造工程で使用されるアジュバントや安定剤に由来する可能性があります。

プロテイナーゼKの作用機序は、タンパク質との結合から始まる。この結合に続いて、プロテイナーゼKはタンパク質をより小さな断片に切断する。その後、生じた断片は酵素から放出される。

図31：精製工程としてのプロテイナーゼKの模式図

Proteinase Kを不活化した後、不要な残基を除去するためにワクチン溶液の精製がしばしば行われる。より小さな断片を除去するために濾過ステップを採用することができる。

c) 精製ステップUF/DF

略語の「UF」と「DF」は、それぞれ「限外ろ過」と「透析ろ過」を意味する。限外ろ過は分子の大きさに基づいて分子を分離し、透析ろ過はさらに不純物を除去し、目的の製品を濃縮するのに役立ちます。これらを合わせてUF/DFプロセスと呼ぶ。限外ろ過/透析ろ過（UF/DF）の組み合わせは、mRNAのような生物学的産物を精製するための一般的な方法である。

限外濾過は、孔径が規定された半透膜（部分伝染膜）を用いた特殊な濾過を伴うプロセスである。この膜を通して、分子はそのサイズに基づいて分離される。小さな分子は膜を通過できるが、mRNAのような大きな分子は保持される。

図32：小さな分子だけが膜を通過する

透析濾過では、限外濾過中に新鮮なバッファー（専用の液体またはワクチン溶液）を連続的に添加する。これにより、不純物がさらに希釈され、例えばmRNAが適切な緩衝液に濃縮される。

限外ろ過/透析ろ過（UF/DF）の主な技術はタンジェンシャルフローろ過（TFF）である。[ROCKER]

タンジェンシャルフローろ過

“デッドエンド濾過あるいは直流濾過として知られる伝統的な濾過法は、膜に試料を垂直に流し、低分子を通過させて分離する。しかしこの方法には、高分子が膜表面に蓄積してフィルターケーキ層を形成するという欠点がある。濾過時間が長くなると、この層は厚くなり、濾過効率の低下と膜寿命の短縮につながる。

図33：デッドエンドろ過とタンジェンシャルフローろ過の比較

一方、タンジェンシャルフローろ過（TFF）では、サンプル流は膜表面を接線方向に水平移動する。サンプルフローは連続的に濾過され、循環中にメンブレン表面を洗い流し、高分子の蓄積を防ぎ、流速低下による濃度分極を低減する。これにより安定した流量が確保され、フィルター膜の寿命が効果的に延長される。タンジェンシャルフローろ過は、濃縮と透析ろ過の両方を同時に行うことができるため、さらなる利点がある。”[ROCKER]

以下は図面からの定義：

保持液：濾過後に残る物質。ワクチン製造では、mRNAのような所望の物質を示す。

伝染液：伝染液はフィルターを通過する物質である。ワクチン製造では、伝染液はフィルター通過を許容される物質であり、ワクチンに望ましくない物質である。

図34：限外ろ過・透析ろ過（UF/DF）とタンジェンシャルフローろ過（TFF）の組み合わせ

図は、タンジェンシャルフローろ過（TFF）を用いた限外ろ過／透析ろ過（UF／DF）のプロセスを示している。ワクチン溶液はろ過システム（ここではTFFと呼ぶ）を流れる。限外ろ過は、一定サイズ以下の分子しか通さない孔径を持つ膜を用いて、mRNAを不純物から分離するために採用される。限外濾過の間に、透析濾過が行われる。このステップでは、mRNAを適切なバッファーで洗浄し、望ましくない不純物の濃度をさらに下げ、mRNAを適切なバッファー溶液に濃縮する。

このプロセスの結果、2つの製品ができる。一つ目は伝染液で、ワクチン溶液から除去された望ましくない物質を含む。そして第二に、添加された緩衝液と混合された、目的のmRNAを含む保持液である。

このサイクルを維持するために、ポンプが残った不純物と一緒に再汚染液を容器に戻します。これにより、溶液を再びUF/DFサイクルに通し、プロセスを繰り返すことができる。このサイクルは、最終製品に望ましいmRNAの純度と濃度が得られるまで繰り返される。

MERCKのオンライン投稿「mRNAワクチンと治療薬の製造戦略」の中で、精製方法としてタンジェンシャルフローろ過（TFF）が取り上げられている。TFFを使用する場合、小さなDNA断片がmRNAとハイブリダイズし、さらなる不純物を引き起こす可能性があることが指摘されている。しかしこのリスクは、投稿で説明されているように、分離によってDNAテンプレートを除去することで回避できる。

MERCKは、モデルナ社のCEOであるStéphane Bancelが2014年に取得した「RNA転写物の製造方法」に関する特許に言及している。そこにはこう書かれている：

[0079]直鎖化プラスミドDNA鋳型は、試験管内試験転写から除去され、例えば、DNA鋳型はRNA転写物から分離される。一実施形態では、DNA鋳型は、ポリA捕捉、例えばオリゴdTに基づくアフィニティー精製工程を用いてクロマトグラフィー的に除去される。

[0080]試験管内試験転写の直後にDNAテンプレートを酵素的に消化するためにDNase Iを利用するのが典型的である。本発明の方法では、DNaseは利用しない。分解されたDNA断片が転写されたmRNAにハイブリダイズするリスクが軽減されるため、酵素消化よりもプラスミド全体の除去が好ましい。

[0082]RNA転写物の生産方法は、試験管内試験転写の後に、例えばイオン交換クロマトグラフィー工程などの追加の精製工程を含むことができる。

包括的な精製のためには、DNase IとTFFに加えて、クロマトグラフィー工程を追加する必要がある。

d) クロマトグラフィー

クロマトグラフィーは、混合物中の異なる物質を分離する方法である。一般的に、このプロセスには移動相と固定相が使用される。移動相は分離される物質の混合物で、固定相の中を移動する。移動相中の物質は固定相中の物質と相互作用する。これらの相互作用により、混合物中の各成分が異なる速度で移動したり、引っかかったりすることで、様々な物質を互いに分離することができる。

図35は、逆相イオンペア、陰イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー技術を示す。

図35：mRNA精製における逆相イオンペア、陰イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーの比較　[MERCK]

MERCKによると、ポリ(dT)アフィニティークロマトグラフィーは大量生産に特に重視されている。そこで、アフィニティークロマトグラフィーの原理を次のステップで詳しく説明する。

ポリ(dT)アフィニティークロマトグラフィー

アフィニティークロマトグラフィでは、目的の分子（mRNAなど）は特定の材料に特異的な親和性または吸引力を持つという考え方があります。mRNA）分子（移動相）と物質（固定相）の間の引力は、混合物から目的の分子を分離するために利用される。

mRNAにはポリ（A）と呼ばれる特定の配列が含まれている（図36参照）。アフィニティークロマトグラフィーでは、Poly(dT)を含むカラムが使用される。Poly(dT)は塩基対「チミジン」を含むヌクレオチドの鎖である。一方、Poly(A)は、塩基対「アデニン」を含むヌクレオチドの鎖である。ポリ(dT)はポリ(A)の「カウンターパート」として機能し、互いに引き合う。

図36：mRNAのポリ（A）とポリ（dT）物質の結合

プロセスはだいたい次のような流れになる：Poly(dT)マトリックスをカラムに入れる。カラムは、特定のPoly(dT)材料で満たされた円筒形の容器と想像することができる。

b)mRNA はポリ(dT)マトリックスに特異的に結合し、c)一方他の成分は結合せずに通過する。d)その後、条件を変えたり、特定の溶出バッファーを加えることで、結合した。mRNAをカラムからリリースすることができます。

図37：ポリ(dT)アフィニティークロマトグラフィーの模式図

Poly(dsT)アフィニティークロマトグラフィーでは、二本鎖RNA（dsRNA）と一本鎖RNA（ssRNA）を区別することができず、またmRNAにハイブリダイズしたDNA断片などの製品に関連する不純物を除去することができないため、MERCKでは陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた追加のクロマトグラフィー工程を推奨しています。

陰イオン交換クロマトグラフィー

陰イオン交換クロマトグラフィー（AEXクロマトグラフィー）は、異なる電荷に基づいて分子を分離するクロマトグラフィー技術である。純表面電荷の違いを利用する。

このプロセスでは、正電荷を帯びた陰イオン交換樹脂を固定相として使用し、負電荷を帯びた分子を選択的に結合・分離する。この固定相は通常、小さなビーズまたは粒子で構成されている。移動相（この場合はワクチン溶液）には、標的分子であるmRNA、二本鎖RNA（dsRNA）、その他の潜在的不純物が含まれている（図38参照）。

負電荷を帯びた分子と樹脂の結合は、分子上の負電荷の強さに依存します。負電荷が高い分子は樹脂により強く結合し、負電荷が低い分子は相互作用が弱く、より容易に溶出（剥離）する可能性があります。

a)プロセスはカラム形式で行われ、ワクチン溶液は正電荷を帯びた陰イオン交換樹脂を含むカラムに適用される。ワクチン溶液中の負に帯電した分子は樹脂に結合し、b)結合していない分子は洗い流される。

mRNAも、dsRNAもリン酸基により負電荷を帯びているため、その構造の違いと陰イオン交換樹脂への親和性に基づいて分離が行われる。多くの場合、dsRNA は mRNA よりも樹脂に強く結合します。

溶出バッファーのイオン強度を上げる、pH値を変えるなど、バッファー条件を変えることで、結合したRNA分子は徐々にカラムから溶出される。陰イオン交換樹脂に対するmRNAとdsRNAの親和性が異なるため、保持時間（分子がカラムを通過するのに必要な時間）が異なり、c)一般的にdsRNAの方が樹脂に強く結合し、d)そのため結合している時間が長くなる。

図38：陰イオン交換クロマトグラフィーの模式図

BioNTechに関するEMAの公式文書には、製造工程でのクロマトグラフィーの使用に関する明確な指示はありません。しかし、オンラインで入手できるEMAの」非公式」作業文書には、29ページに精製工程としてクロマトグラフィーが記載されている。

ScienceDirect』（科学雑誌のオンラインプラットフォーム）の記事によると、モデルナのCOVID-19 mRNAワクチンは陰イオン交換とPoly dTアフィニティークロマトグラフィーの両方を用いて調製・精製された。

3.6. mRNAは脂質ナノ粒子にパッケージされる

精製されたmRNAは脂質ナノ粒子に封入される。これらの脂質シェルはmRNAを体内での分解から保護し、細胞への取り込みを促進し、細胞内部へのmRNAの放出を可能にする。製剤化されたRNAワクチンは、これで投与準備が整った。

図39：mRNAは脂質ナノ粒子にパッケージされる

3.7. 少ない結論

本章では、製造工程を図解することで、mRNAワクチンの製造工程に関わる構造的ステップを詳しく説明しただけでなく、製造業者が直面する技術的課題についてもおおまかに概説した。

メルク社、サルトリウス社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の文書が示すように、個々の技術的ステップの研究開発は現在も進行中である。EMAの文書は、いくつかの製造パラメーターに関する製造業者と規制当局との情報交換がまだ完了していないことを示している。ケビン・マッカーナンらによる批判的な報告書は、この枠組みの中で文脈づけることができる。

4. DNAとRNAの測定方法

RNA濃度と潜在的残存DNA（汚染物質）の検査は、COVID-19 mRNAワクチンの製造工程における重要なステップです。この措置は、製品のモニタリングと品質保証の観点から極めて重要である。これにより、製造されたワクチンが純度と有効性の要件を満たしていることが保証されます。

本章では、mRNAワクチン中のRNAとDNAの検出法として、以下のような様々な測定法の概要を説明する：

これらの技術は、読者にその主要な動作と潜在的なアプリケーションを理解してもらうために、より詳細に議論されている。

4.1. 蛍光アッセイ

蛍光アッセイとは、特定の標的分子の存在や量の指標として蛍光を用いる生化学的検査のことである。DNAやRNAなどの核酸の測定も含まれ、蛍光色素やプローブが標的核酸に特異的に結合することで蛍光シグナルが発生する。

蛍光アッセイは、以下のような基準によって決定される。

• 特異性（標的分子を選択的に検出すること）、
• 感度（標的分子の濃度が低くても）、
• 安定性と再現性、
• 頑健性（小さな変動に強い）、
• 実現可能性、
• 時間とコスト効率…

蛍光測定は、定量的PCR（qPCR）、DNAまたはRNA色素を用いた蛍光測定、量子ビット蛍光測定、その他多くの蛍光ベースの技術など、様々なアプリケーションを包含する包括的な用語である。これらの方法はすべて、蛍光の原理を利用して特定の分子を検出、定量、分析するものです。

一般的に、qPCR、DNA または RNA 染料を用いた蛍光測定、Qubit 蛍光測定などの蛍光アッセイの結果は、単位容量あたりの DNA 量として報告される。単位は通常ナノグラム/マイクロリットル（ng/µl）で、単位体積あたりのDNAの重量を示す。

4.1.1. 定量ポリメラーゼ連鎖反応 – qPCR

定量的PCR（qPCR）は定量的リアルタイムPCRとも呼ばれ、従来のPCR技術を拡張したもので、サンプル中の標的配列の量を決定することができる。qPCRの基本的なステップは前節（3.2.1）で述べたPCRと同じである。

qPCRでは、蛍光レポーターと呼ばれる特殊な色素を一種の「光シグナル」として使用し、PCRの過程でDNAの量を測定する。

qPCRには、DNA量を決定するための2つの異なる戦略がある：a)色素ベースのqPCRとb)プローブベースのqPCR。

a) 染料ベースのqPCR

分析では、ヌクレオチド、プライマー対（フォワードとリバース）、DNAポリメラーゼ、蛍光色素の混合物を調査対象のサンプルに添加する。SYBR Greenは、DNAを定量する定量的PCR（qPCR）で一般的に使用される色素である。

1)最初のステップは変性で、二本鎖DNAを摂氏95度前後に加熱することで2本の鎖に分ける。2 )続くステップでは、プライマーが低温でDNA標的配列の特定領域に結合する。3) 第3段階では、DNAポリメラーゼの助けを借りて新しいDNA鎖が合成される。色素は新しく合成された二本鎖DNAに結合し、蛍光を発する。この蛍光は各PCRサイクルで測定される。通常、35-40サイクルが実行される。DNA標的配列が増幅されるにつれて、色素の結合部位が増えるので、蛍光の増加は存在する二本鎖DNAの量と直接相関する。

図40：色素を用いたqPCR（模式図）

プライマーは極めて重要：色素ベースのqPCRにおける増幅には、特別に設計されたプライマーの使用が必要である。これらのプライマーは標的DNAの個々の鎖上の特定の配列に選択的に結合する。DNA合成はプライマーの結合が起こった後にのみ開始される。

色素ベースの方法では、一度に検出できるDNA標的配列は1つだけである。特定のプライマー対が1つだけ必要なので、この方法は迅速でコスト効率のよいオプションである。

しかし、色素が標的配列にのみ結合しない場合があり、測定が不正確になるという欠点がある。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)中に目的のDNA配列のみが増幅されたことを確認するために、通常、各実験後に融解曲線が作成される。DNA配列はそれぞれ特徴的な融点を持つので、この曲線は重要である。特異的で期待される融解曲線は、増幅が成功し特異的であったことを示す。

b) プローブベースのqPCR

分析では、ヌクレオチド、プライマー対、およびDNAポリメラーゼの混合物が、調査対象のサンプルに加えられる。さらに、フルオロフォア（蛍光色素）とクエンチャー（蛍光シグナルを抑制する）で標識されたプローブが導入される（図41参照）。プローブが無傷のまま分解されない限り、蛍光シグナルはクエンチャーに空間的に近接しているため抑制される。

1)最初のステップは変性で、約95℃に加熱することにより、2本鎖DNAを2本の1本鎖に分離する。2) 続くステップでは、プライマーと特異的プローブの両方が、低温でDNA標的配列の特定領域に結合する。3) 第3のステップでは、DNAポリメラーゼにより、新しいDNA鎖の合成が行われる。DNAポリメラーゼによるDNA合成中、プローブは分解され、蛍光団とクエンチャーが分離し、蛍光シグナルが放出される。qPCRでは、DNA合成中に発生する蛍光シグナルの量をリアルタイムで測定する。

図41：プローブベースのqPCR（模式図）

これらの光シグナルの増加は、PCRの各ラウンド中に増幅されたDNAの量に正比例して起こる。言い換えれば、測定された蛍光はサンプル中のDNA量に比例する。

プライマーとプローブの両方が重要：プライマーは標的DNAの個々の鎖上の特定の配列に結合する。プライマーが結合して初めてDNA合成が始まる。プローブは標的DNAを認識し定量するための付加的なツールとして機能する。qPCRにおけるプローブは、特定のDNA配列に特異的に結合するように設計されている。この配列は、検索されるDNA断片に固有で特徴的であるように選択される。プローブは、その塩基配列がサンプル中に存在する場合にのみ、標的DNAに結合する。これにより、特定のDNA配列を特異的に検索し、その量を定量することが可能になる。したがって、プローブベースのqPCRにおける測定は、色素ベースのqPCRと比較して、より正確で特異的である傾向がある。

2つのqPCR法がどのように機能するかについての詳しい情報は、ここにある。

qPCRはRNAの定量にも使用できる。

このためには、RNAを相補的DNA（cDNA）に転写するという追加のステップが必要である。このステップは逆転写（RT）と呼ばれ、したがってRNAに対するqPCRの適用はRT-qPCRまたは逆転写-qPCRと呼ばれる。このcDNAは次にPCR増幅の鋳型となる。その後、qPCRは上記のように実行され、サンプル中の特定のRNAの量を決定する。

qPCRの限界

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において、DNAの効率的な増幅はその長さに依存する。定量的PCR（qPCR）では、100bp（塩基対）以上のアンプリコン（増幅されたDNA断片）が好ましいことが知られている。塩基対とは、DNA内の2つのヌクレオチド（アデニン・チミンとシトシン・グアニン）間の結合を指す。

その理由は、アンプリコンが長いほど増幅が安定し、標的遺伝子の特異的検出が向上するからである。100塩基対（bp）未満のアンプリコンは特異性が低く、非特異的な産物を生成する傾向があるため、qPCRの結果が誤って解釈される可能性がある。

4.1.2. DNA-またはRNA-色素を用いた蛍光測定

核酸の蛍光測定は、DNAまたはRNAに選択的に結合する特異的な蛍光色素の使用に依存している。これらの色素は、ターゲットに結合したときのみ蛍光シグナルを発する。核酸の濃度は、サンプルの蛍光シグナルに基づいて決定される。

DNAおよびRNA定量におけるフルオロメトリーの基本ステップ：

DNA または RNA はサンプルから抽出され、精製される。タンパク質、脂質、その他の化学化合物などの汚染物質は、DNAやRNAへの蛍光色素の結合を阻害したり、蛍光測定において核酸に由来しないシグナルを生成したりする可能性があります。

蛍光色素は、DNAまたはRNAに特異的に結合するように選択される。この結合によってサンプル中の核酸がマークされ、その後の定量が容易になる。色素の選択は、核酸の特定の構造または特性に対する親和性に基づく。例えば、以下のようなものがある：

RNA用リボグリーン：リボグリーンはリボ核酸（RNA）に特異的に結合するように設計されています。この色素は異なるタイプのRNAを区別するのではなく、RNAとDNA全般を区別する。

DNA用のPicoGreen：PicoGreenはDNAに高感度。この色素はDNAの種類を区別するのではなく、DNAとRNA全般を区別する。

1)特定の色素をサンプルに添加した後、核酸（DNAまたはRNA）と相互作用する。2)色素は標的核酸に特異的に結合する。この結合により蛍光が放出され、標識核酸が発光する。3) サンプルは、蛍光測定用に設計された装置である蛍光光度計にセットされる。蛍光光度計は、サンプル中の色素を特定の波長（λex）の光で励起する。蛍光色素はこの光を吸収し、より長い波長の光（λem）を放出する。放出された蛍光が測定され、シグナルの強度が記録される。

図42：DNA色素を用いた蛍光測定（模式図）

正確な結果を得るために、測定された蛍光が標的核酸のみに由来することを確認するためのコントロールが行われる。標準曲線は多くの場合、定量用に事前に作成される。サンプル中のDNAまたはRNAの濃度は、この標準曲線を用いて算出される。

4.1.3. キュビット蛍光法

Qubit蛍光法は、核酸、特にDNAとRNAの定量分析に使用される特殊な蛍光法である。核酸と特異的に相互作用し、結合すると蛍光シグナルを発する蛍光色素を使用します。

蛍光強度の測定に頼ることが多い従来のフルオロメトリー技術とは対照的に、Qubitフルオロメトリーでは、核酸に結合した色素が発する蛍光シグナルの測定を行います。これにより、非常に低濃度であっても、サンプル中のDNAまたはRNA濃度を高感度かつ正確に測定することができる。

DNA測定

サンプルの前処理には、DNAに特異的に結合して蛍光シグナルを発する核酸結合蛍光色素を使用する。

Qubit蛍光光度計は、DNA色素溶液の蛍光シグナルに正しく反応し、正確な測定を行うために校正されます。DNA濃度が既知の一連の標準試料を調製します。これらのサンプルを用いて、蛍光強度とDNA濃度の関係を表す標準曲線を作成します。

1) サンプルをDNA色素溶液と混合し、Qubit蛍光光度計にセットする。2) 染料がDNAに結合し、蛍光シグナルを発する。3) 蛍光光度計がサンプルの蛍光シグナルを測定し、標準曲線と比較してサンプル中のDNA濃度を決定する。測定されたDNA濃度は、標準曲線を用いて計算され、クビット蛍光測定の結果として得られる。

図43：キュービット蛍光光度計（模式図）

RNAの測定は、特定のRNA蛍光色素を用いて同様に行われる。

Qubitフルオロメトリー – DNAまたはRNAをより正確に定量する方法

キュビット蛍光光度法は、UV 分光法やゲル電気泳動法などの他の方法と比較して、DNAや RNAをより正確に定量する方法であると考えられています。キュービット蛍光測定の正確さの主な理由は、サンプル中の他の物質による干渉を受けずに、核酸の蛍光を特異的かつ選択的に測定できることです。これにより、低濃度で複雑なサンプル中であっても、核酸の正確な定量が可能になります。

qubitフルオロメトリーは、サンプル中のDNAまたはRNAの総量を正確に測定する方法ですが、異なる配列を区別することはできません。測定できるのは、総 DNA 濃度または総 RNA 濃度のみです。DNAまたはRNA配列に関する特定の情報が必要な場合は、qPCRなどの他の方法を使用する必要があります。

4.2. オックスフォード・ナノポア・テクノロジー

ナノポアシークエンシングは、長いDNAまたはRNA断片のリアルタイム解析を可能にする。

ナノポアとは、わずか数ナノメートルの小さな開口部のことである。導電性材料でできた膜に埋め込まれている。この特殊な膜はチップの中に配置される。

図44：チップ上の導電性膜のナノ細孔（模式図）

DNAまたはRNAサンプルは、まず細かく断片化される。この断片化によって、ナノ細孔を通る分子の輸送が促進される。断片化されたDNAまたはRNAは、次に電解質溶液と呼ばれる液体に入れられる。この液体には溶解塩が含まれており、帯電した分子が自由に動くことができる。電解質溶液をナノ細孔に接触させ、配列決定プロセスを開始する。

一定の電圧をかけ、ナノ細孔にイオンの電流を発生させる。これにより、帯電したDNAまたはRNA分子がナノ細孔に移動し、そこを通過する（図45参照）。

酵素の一種であるヘリカーゼは、DNAの二本鎖に結合し、一本鎖に分離してほどき、ナノポアを通して輸送する準備をする。ヘリカーゼの作用は、すでに一本鎖になっているRNAには必要ない。

次に、ヘリカーゼの一部であるモータータンパク質が、一本鎖DNAまたはRNAをナノポアを通して押し出す。DNAまたはRNAがナノポア内を移動すると、ポアを流れる電流が変化する。この電気信号は、孔を通過するDNAの塩基配列に依存する。DNAの各塩基（アデニン、シトシン、チミン、グアニン）には特徴的な効果がある。この電流の変化が電圧の変化として認識され、ナノ細孔で測定される。ソフトウェアが電圧の変化からDNA配列を計算する。

図45：オックスフォード・ナノポア技術（概略図）

オックスフォード・ナノポア技術の結果は、DNAまたはRNAサンプルの塩基配列である。この塩基配列から、遺伝子の構成、長さ、あるいはその他の重要な遺伝的特性に関する情報を得ることができる。

ナノポアシークエンシングをより分かりやすく説明するために、このビデオをお勧めする。

4.3. 紫外分光法

UV分光法は核酸を分析するための一般的な技術であり、サンプル中のDNAやRNAの濃度を測定するために用いられる。その原理は、核酸、特にUV領域における電磁波の吸収に基づくもので、これにより特徴的な吸収パターンが得られる。以下では、この技術のRNAへの応用について説明する。

紫外分光法では、UV/VIS分光光度計と呼ばれる特殊な装置が使用される。これらは、放射線源、プリズムと隔膜からなる分光器、検出器から構成される。分析するRNAは、UV光を伝染する透明な試料担体の上に置かれる。測定中、サンプルはモノクロメーターと検出器の間に置かれる。モノクロメーターは、特定の波長の光だけがサンプルに当たるようにします。RNA分子は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルのような塩基の存在により、特定の波長、特に約240～300nm（ナノメートル）の範囲でUV光を吸収する。

図46: UV-分光法（概略図）

RNA溶液に放射線を照射すると、光の一部を吸収し、放射線を減衰させる。RNAの含有量が多いほど吸収率は高くなる。

RNA分子による紫外線の吸収は、特徴的な吸収パターンをもたらす。異なる波長での吸収を測定することで、UV分光法はサンプル中のRNAの濃度や純度、構造に関する情報を得ることができる。

このトピックに関する詳細情報はこちらをご覧ください。

UVスペクトロスコピーは核酸分析に非常に有用な技術であるが、汚染物質に敏感であるなどの欠点もある。正確な結果を得るためには、UV分光法はサンプルの純度を高くする必要がある。

サンプルにRNAとDNAの両方が含まれている場合、UV分光法の測定結果に影響を与える可能性があります。RNAとDNAの両方がUV光を吸収するため、サンプル中にDNAが存在すると、測定されたRNA濃度が過大評価される可能性がある。これは、UVシグナルがRNAだけでなくDNAからも発生し、吸収値が増加するためである。

5. 測定結果とその解釈

第3章と第4章では、mRNAワクチンの製造と品質保証における基本的な製造工程を詳細に描いており、独立研究所の分析結果とその結果についての考察をより深く理解するための土台を築いている。

5.1. ワクチン中の残存DNAを制限するためのガイドライン

現在、米国FDAは、ウイルスワクチンの製造業者に対し、非経口接種用の最終製品に残存するDNAの量を10ng/投与以下に制限し、DNAのサイズを機能的遺伝子のサイズまたは～200塩基対未満に制限することを推奨している。[これは世界保健機関（WHO）の勧告にも沿ったものである）[2,3]1985年にFDAが設定した以前のガイドラインでは、残留DNAの限度を10pg/投与（10pg=0.01ng）と定めていた。WHOの研究グループは1986年に、リスクは100 pg/線量まで無視できると結論し、1996年にWHOはさらに、1回の線量あたり10 ngまでと制限値を引き上げた。[2][研究]

[1]www.fda.gov/media/113760/download
[2]pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17321940/
[3]cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/documents/trs_978_annex_3.pdf

5.2. ファイザーが使用した測定方法

製造工程で世界保健機関（WHO）が定めた制限値を確実に遵守するため、ファイザーでは定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）測定法を用いて残留DNA量を定量しています（図47参照）。

この図には、メーカーがRNA量を測定するために「UVスペクトロスコピー」と「蛍光アッセイ法」を採用していることも示されている。「蛍光測定法」という用語は、蛍光に基づく様々な測定法を包含する広い用語である。プロトコルにはqPCRもqubit蛍光測定法も明記されていないことから、特定の蛍光色素を用いた蛍光測定法である可能性もある。

メーカーは、RNA含有量とDNA含有量を決定するために、選択的に異なる測定方法を使用している（こちら、こちら、こちらも参照）。

図47：EU公的管理-品質管理試験[出典]

RNAおよびDNA含量の測定値は、使用する測定方法によって異なることに注意することが重要である。RNA含有量の測定値が高く、残存DNA量が低いほど、通常、製品の品質が高いことを示す。品質保証のためにどの測定方法を使用すべきかを規定する規制要件はないことに留意すべきである。

5.3. COVID-19ワクチンで検出されたDNA断片

カナダにおけるCOVID-19ワクチンに検出されたDNA断片」と題された研究では、COVID-19 mRNAワクチンのRNA配列決定が行われた。David Speicher博士がこの研究の筆頭著者であり、Kevin McKernan博士が共著者として記載されている。調査の結果、製造工程で使用されたプラスミドに由来するDNA断片が明らかになった。ここに記載された情報はすべて、Speicherらによって行われた研究によるものである。

この研究では、カナダ産の27本のCOVID-19ワクチンバイアルを調査した。以下はその詳細なリスト：

ワクチンの種類ごとのバイアルの数：

• ファイザーバイオエヌテックBNT162b2：8バイアル（未開封、期限切れ）
• モデルナ Spikevax mRNA-1273：16バイアル（未開封、期限切れ）
• モデルナXBB.1.5：3バイアル（使用済み、期限切れではない）

検査ロットの詳細：

• 小児/成人用モデルナ一価ワクチン5バッチ
• 成人用2価BA.4/5ワクチン1バッチ
• 小児・成人用2価ワクチンWuhan-BA.1 1バッチ
• 一価モデルナ XBB.1.5ワクチン1バッチ
• ファイザー社製成人用一価ワクチン3バッチ
• 成人用2価武漢-BA.4/5ファイザーワクチン1バッチ

5.3.1. 測定方法と調査結果

この研究では、既発表のプライマーとプローブの配列を用いて、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）やqubit蛍光測定法など、DNAとRNAを検出するための確立され標準化された方法が用いられた。DNA断片のサイズ分布の決定には、オックスフォード・ナノポア・シーケンスが用いられた。使用した方法はすでに第4章で紹介した。

測定結果は以下の表に示され、測定値の範囲も示されている。ng/dose(nanograms per dose)の数値は、1ワクチン用量あたりのDNA量の測定値を示す。

qPCRでは、プラスミドの複製起点（ori）とスパイク配列に特異的なDNA配列のみを増幅するために、特異的なプライマーを使用する。したがって、各配列の値を別々に測定し、定量することができる。

一方、Qubit蛍光測定では、特定の配列に関係なく、サンプル中のDNAの総量を測定する。したがって、キュービット蛍光法では、個々の配列は区別されず、サンプル中のDNAの総量が定量される。

結論

入手可能なデータから、試験されたmRNA COVID-19ワクチンには、1用量あたり数十億から数千億のDNA分子が存在することが示されている。Qubit蛍光光度法を用いると、全ての試験済みワクチンはWHOの残留DNAガイドラインである10ng/用量を188～509倍上回っている。興味深いことに、qPCR法で測定した残留DNA量は、すべての試験製品でガイドラインを下回っていた。これらの結果は、DNA量に関するガイドラインを明確かつ一貫して解釈することの重要性を示している。研究

この時点で、測定データは使用した測定方法に強く依存することに注意することが重要である。したがって、この研究は、望ましい結果を得るために異なる測定方法を選択的に使用することができるという、規制ガイドラインの既存の弱点を浮き彫りにしている（図47参照）。

モデルナ社による特許US10077439B2（モデルナ社のCEOであるStéphane Bancelらが執筆）には、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）は既存のDNAの総量を過小評価することが明記されている。

[00103]…定量的PCRは残留DNAを測定するためにしばしば適用されるが、qPCRプライマーを両方含むDNA分子のみを検出するため、部分的に消化された他のすべての小さなDNA分子を測定することはできない。…

4.1.1. c) 「qPCRの限界」も参照。より詳しい情報については、McKernanによる。”Fluorometry Deep Dive“の記事を推奨する。

マッカーナンはREBEL News Canadaのインタビューで、「規制当局にとって重要なことは、どの技術も答えを与えてくれないということだ」と語った。

つまり、DNAとRNAの値を決定するために複数の測定方法を採用することは、結果の信頼性を高め、方法間の潜在的な不一致を特定することになる。複数の方法を使用することで、結果の内部検証が可能になり、潜在的なエラーの原因を特定することができる。例えば、qPCR法を用いてDNAとRNAの値を測定し、その結果をQubitフルオロメトリー測定法で得られた値と比較することができる。異なる方法による結果を比較することで、潜在的な差異や矛盾を特定することができる。

5.3.2. 予想外の発見：SV-40プロモーター／エンハンサー

Speicherらは、ファイザー社のワクチンにSV40-プロモーター-エンハンサー-オリ-配列とSV40-ポリA-配列を発見した。この研究の表2も参照。

SV40とはSimian Virus 40の略で、1960年にサルの腎臓細胞から発見されたウイルスである。サルとヒトの両方に感染する。SV40は生物医学研究への利用や、初期のポリオワクチンの汚染物質として知られている。

「ポリオワクチンに見られるような完全なSV-40ウイルスではない」[マッカーナン]

SV40には遺伝子がどのように活性化されるかに重要な役割を果たす特定の遺伝子部分がある。これらの部分にはSV40エンハンサーとSV40プロモーターが含まれる。

SV40プロモーターは遺伝子の開始配列として働く。遺伝子が発現する（活性化する）とは、その遺伝子の遺伝情報がタンパク質に翻訳されることを意味する。SV40プロモーターは、遺伝子発現を効率的に開始できる特に強力な開始配列である。遺伝子の発現を、自動車でモーターを始動させるようなものと想像してほしい。SV40プロモーターはエンジンをかけるイグニッションキーのようなものである。イグニッション・キーを回すとエンジンがかかり、車は動き出す。

SV40エンハンサーはプロモーターの近くに位置し、プロモーターの活性を高めることができる。SV40エンハンサーは、エンジンに余分なパワーを与えるターボブーストとみなすことができる。ターボブーストが作動すると、車はより速く加速し、より高速に達する。同様に、SV40エンハンサーはSV40プロモーターの活性を高め、遺伝子の発現を増加させる。

マッカーナン「もしこのDNAがワクチン内に大量に存在すれば、このプロモーターはゲノムに組み込まれる可能性がある。もしこのDNAがワクチン内に大量に含まれていれば、そのプロモーターはゲノムに組み込まれる可能性があり、SV-40プロモーターを大量に注入することは、ゲノムに不適切な遺伝子の発現を促進する危険性があるため懸念される。

SV40の成分と規制当局

下図は、左側がファイザー社のプラスミドマップで、マッカーナンの測定結果を用いて再構築したものである。右はファイザー社が欧州医薬品庁（EMA）の承認文書に記載したプラスミドマップである。右のプラスミドマップにはSV40の構成要素が欠けていることがはっきりとわかる。

図48：EMAに開示されたプラスミドマップ（右）（図S.2.3-1. pST4-1525プラスミドマップ参照）【パワーポイント収録Massachusettsスライド、スライド6】　

世界保健機関（WHO）と米国食品医薬品局（FDA）のガイドラインでは、SV40成分のようなオープンリーディングフレームやプロモーターはすべて開示しなければならないことになっているため、マッカーナンのチームは当局に測定結果を突きつけた。その結果、欧州医薬品庁（EMA）、FDA、カナダ保健省は、プラスミドに確かにSV40成分が使用されていることを確認した。[パワーポイント記録マサチューセッツスライド、スライド17].

エポックタイムズへの電子メール（2023年10月）で、カナダ保健省は次のように書いている。”ファイザー社のプラスミドの全DNA配列は最初の申請時に提供されましたが、スポンサーはSV40の配列を具体的に特定しませんでした”。

その直後、欧州医薬品庁（EMA）もEメールで『エポック・タイムズ』紙に伝えた：「コミルナティの最初の製造販売承認申請書では、プラスミド出発物質のDNA全塩基配列が提供されたが、申請者はSV40の塩基配列を特に強調しなかった。バイオエヌテックがワクチンにエンハンサーが含まれていることを強調しなかったのは、「エンハンサーはプラスミドの機能しない部分であると考えられた」からである。その後、EMAからの質問に対し、この情報を明らかにした。”

EMAが2020年末にバイオエヌテック社とファイザー社のCOVID-19ワクチンコミナティの条件付き承認を勧告したことを覚えている。当局がコミルナティの製造販売承認申請書にSV40の塩基配列を発見したのは、それからわずか3年後のことだった。

欧州医薬品庁（EMA）の広報担当者は、ファイザー／バイオエンテックワクチンとモデルナCOVID-19ワクチンについて、「残留DNAが承認／安全レベルを超えているという信頼できる証拠を確認していない」と明言した。 また、EMAは、「ワクチンバッチに存在する可能性のあるごく少量の残留DNAが、ワクチン接種者のDNAに統合される可能性を示す科学的証拠も認識していない」と述べた。

残留DNA量に関連する潜在的リスクについては、第7章 「さらなる調査は必要か？」で論じている。

5.3.3. 残留DNAのサイズプロファイル

残存DNA分子の異なるサイズや長さを捕捉するために、Speicher DJらは、オックスフォード・ナノポア（ONT）シーケンスを用いてBNT162b2ワクチンの塩基配列を決定した（図49）。

図49：オックスフォード・ナノポア・シーケンス【研究、左：図10、右：図11

シークエンシングの結果、プラスミドの全長は7810bp（塩基対）であった。図（左）に示すように、測定されたDNA分子の質量の大部分は小さい。解析の結果、平均DNA断片長は214bpであった。

「分子の50個に1個は1,000塩基以上の長さであった。[マッカーナン、Covid-19ワクチン専門家パネルによるマサチューセッツ州議会と公衆衛生当局へのブリーフィング、1:29:30].」

彼らはまた、3.2kb（キロ塩基対）または3200bp（塩基対）の長さで、プラスミドの裏側全体を覆っている断片を発見した（右図参照、青いベクター領域で示されている）。マッカーナンはインタビューの中で、この3200塩基対の断片には、対応するSV40プロモーターを含め、抗生物質カナマイシンとネオマイシンに対する耐性遺伝子が含まれていると説明した。彼は続けた：「同じような長さの他の断片にはスパイクプロテインの配列が含まれていた。

世界保健機関（WHO）のガイドラインによると、残存DNAのサイズを機能的な遺伝子のサイズ以下、または約200塩基対以下に制限することが推奨されている。

5.4. 研究結果の再現

5.4.1. フィリップ・バックホーツ博士

McKernanとSpeicherの発見は、サウスカロライナ大学教授のPhillip Buckhaults博士によって確認された。Phillip Buckhaults博士は経験豊富な分子生物学者であり、癌遺伝学者であり、グローバルな遺伝子発現解析や遺伝子変異検出のための次世代シーケンサーアプリケーションにおいて豊富な経験を有している。彼は2023年9月にサウスカロライナ州上院公聴会で、mRNA COVID-19ワクチンに関連するDNA汚染に関する知見を発表した。元の投稿はYouTubeから削除されましたが、こちらとこちらでご覧いただけます。

バックホーツ博士と彼の同僚は、ファイザー・バイオエヌテック社（Comirnaty）とモデルナ社（Spikevax）のバッチから外来DNAを同定した。[P_J_Buckhaults]。

公聴会の中で、バックホーツ博士はその所見を述べている：

「これは、ファイザーのワクチンのいくつかのバッチから、私がラボで行ったシークエンシングのリードの写真です。この小さな線（図50）は、ワクチンに含まれるDNAの小さな小さな断片です。それらはそこに属するものではありません。それらは売り込みやマーケティング・キャンペーンの一部ではありません。しかもたくさんある」

図50：ファイザーのワクチンから発見されたDNA断片[出典]

「この小さなグラフ（図51、左）の真ん中がサイズ分布で、100塩基対120塩基対あたりにピークがある。ワクチンに含まれるDNA断片は100 120の小さな断片で、500塩基対のものもあれば5000塩基対のものもあるが、ほとんどは100塩基対前後である。なぜこれが重要なのか？あるDNA断片がヒトゲノムに組み込まれる確率は、その大きさとは無関係だからだ。ゲノムのリスクは粒子の数によって決まる。…ワクチンに含まれるこれらの小さなDNA断片はすべて、ワクチン接種を受けた人の細胞を改変する何千回もの機会がある。しかし、その過程でゲノム改変の危険性を高めているのです」

図.51：左）ファイザー社製ワクチンのDNA断片の塩基対の長さによる分布、右）サンプル分析に基づく複製プラスミドマップ[出典]　

「私たちはこれらのDNAの断片をすべて採取し、それらを使って、元となったDNAがどのようなものであったかを接着したのです。この赤と緑の小さな線（図50）は、すべて独立した小さなDNAの断片です。この塩基配列の決定には100,000ものDNA断片が使われたはずですが、それらをすべてつなぎ合わせると、この円（図51、右）のようになります」

「このプラスミドはアジレントからオンラインで購入できる。ファイザーがこのプラスミドを手に入れ、スパイクをクローン化し、体外転写／翻訳と呼ばれるプロセスに使用したことは明らかです。そしてこのmRNAを取り出し、脂質ナノ粒子切断試薬と混ぜ合わせれば、mRNAワクチンの完成である。しかし、以前はDNAを取り出すことができなかった。この小さな断片は、RNAと一緒にパッケージされた血漿の小さな断片なのだ。DNAの塩基配列を見ただけでも、何が起こったかは明らかだ」

「研究室ではこの物質の量を簡単に測定することができる。ワクチンやその他の組織にどれだけの量が含まれているか正確に定量することができる。…しかし、これが20億コピーあるとすると、他のものは約2000億コピーあることになる。ということは、この血漿DNAはおそらく2千億個ずつワクチンの各用量に含まれていて、それがこの脂質ナノ粒子にカプセル化され、細胞内に送達できるようになっているということだ。これは悪い考えだ。

5.4.2.ユルゲンO. キルヒナー博士、ブリジット・ケーニッヒ博士

ドイツの生物学者ユルゲンO.キルヒナー博士は、デイヴィッドO.フィッシャーというペンネームで出版した『mRNAマシン』という本の中で、2022年の時点で早くもバイオエヌテックワクチンのDNA汚染の問題を警告していた。

キルヒナーは博士号を持つ生物学者で、製薬業界での豊富な実務経験を持つ。さまざまな製薬会社に勤務し、医薬品の有効性を実証するための研究に幅広く携わってきた。また、医薬品のマーケティングや承認取得も担当。

キルヒナー博士は、ドイツのマグデブルクにあるブリギッテ・ケーニッヒ教授の研究室に、検査のためにバイオナンテックワクチンのバッチを送った。

ケーニッヒ教授は、生物学、化学、医学を専攻し、「医療微生物学と感染免疫学」の学位を取得した。

キルヒナー博士の『エポック・タイムズ』紙とのインタビューからの抜粋である。

「mRNAワクチンへのDNA混入は非常に深刻な問題であり、2021年2月の段階で欧州医薬品庁（EMA）の報告書にDNA混入が記載されていたにもかかわらず、当初はあまり明らかにされていなかった。その程度はわかっていなかった。これはアメリカの科学者ケビン・マッカーナンと彼のチームによって発見され、今年（2023）4月に発表された。”

「その後、私はある研究所を見つけ、このワクチンのドイツ製ロットの検査を依頼し、私たちの状況を確認した。その結果は大失敗で、DNAの混入が非常に目立ったのです」

「このワクチンは、バクテリアの助けを借りて製造されるため、DNAに汚染されている。このバクテリアはDNAの鋳型を提供し、その鋳型を使ってmRNAを生成し増殖させる。臨床試験では、これはバクテリアなしで行われたため、臨床試験のワクチンは市販品ほどDNAに汚染されていなかった。これはまた、臨床試験のワクチンにはDNAが含まれていなかったため、ワクチン中のDNAがもたらすリスクが臨床試験でまったく検証されなかったことを意味する。つまり、この問題全体が、背後に何があるのか誰も知らない巨大なブラックホールなのだ。そして、それは非常に迅速に変更される必要がある。

「バイオエヌテックワクチンのチャージがテストされた。現在、5バッチ分のデータを使用していますが、その中から密封されたバッチを入手することができました。汚染の限界はWHO自身によって1回分あたり10ng（ナノグラム）に設定されている。あるワクチンから検出された最低濃度は83倍、最高濃度は355倍であった。……ここで言っているのは、制限値をわずかに超えるということではなく、むしろ10ではなく3500ということなのだ。これは単純に考えなければならないことである。”

彼らの分析結果は以下の表にまとめられている。

その結果は、2023年12月12日にMDRレポートとして一般公開された。しかし、MDR報告書はその直後にMDRメディアライブラリーから削除された。同レポートは現在もこのリンクから閲覧することができる。

なぜMDRのレポートが削除されたのか、というエポックタイムズの問い合わせに対し、MDRの広報担当者は次のように回答した：MDRは2023年12月12日午後8時15分、”Umschau “という番組でコロナウイルスワクチンに関するレポートを放送しました。社内で慎重に検討した結果、当グループのジャーナリスティック・デュー・ディリジェンスの基準を満たしていなかったことは明らかです。この報道は2023年12月17日に掲載中止となった。しかし、MDRは、どの「ジャーナリスティック・デューデリジェンス基準」が満たされていなかったのか、正確には述べていない。

5.5. 簡単な要約

• DNAとRNAの測定値は、分析に使用される特定の測定方法によって異なる。
• ある物質のRNAとDNAを検査するために、製造業者がどの測定方法を使わなければならないかを規定する、当局による統一された規制基準は存在しない。
• 大量の小さなDNA断片が検出され、WHOの推奨限界値である10ng/doseを超えた。
• 時折、WHOが推奨する200塩基対を超える非常に長いDNA分子も検出された。
• SV40ウイルスの機能的構成要素として、SV40プロモーターとエンハンサーが見つかった。
• mRNAを脂質ナノ粒子に封入する際に存在する可能性のある残留DNAも、脂質ナノ粒子に封入することができる。このような脂質ナノ粒子は、カプセル化された核酸の安定性を高め、生物系に通常存在するヌクレアーゼなどの酵素による分解から保護するのに役立つ。

6. 外来DNAに関する公式反応と知識

6.1. 欧州医薬品庁（EMA）

6.1.1. EMAとは何ですか？

欧州医薬品庁（EMA）は、オランダのアムステルダムに本部を置く欧州連合の機関である。EMAは、EU全体で医薬品の承認プロセスを標準化し、患者が新薬をより早く入手できるようにするために設立されました。EMAの主な業務は以下の通り：

医薬品の承認EMAは、欧州連合（EU）における新薬承認申請の評価において中心的な役割を果たしている。EMAは、医薬品が欧州市場で販売される前に、その品質、安全性、有効性を評価する。

医薬品の安全性の監視EMAは、すでに承認された医薬品の安全性を継続的に監視している。これには、副作用やその他の安全性に関する情報の収集も含まれます。必要に応じて、添付文書の改訂や販売承認の取り消しなど、患者の安全性を確保するための措置を講じることができます。

品質管理：EMAは医薬品の品質を評価し、必要な基準を満たしていることを保証する。これには医薬品の製造、試験、包装が含まれる。

6.1.2. EMAはDNA残基について何を知っていたのか？

以下は、いくつかのEMA文書のレビューと、それに対応する説明である。文書中の編集部分はEMA自身によるものである。

「アセスメント報告書」とは、ヒト用医薬品委員会（CHMP）による医薬品の評価を文書化するためにEMAが作成する評価報告書である。この報告書には、入手可能なすべてのデータの包括的な分析が含まれます。さらに、承認後の医薬品のさらなるモニタリングに関する勧告や要件が含まれることもあります。

2021年2月からのEMA文書

EMA-ドキュメント、2021年2月19日

「DNase消化工程の頑健性は、活性物質レベルでの残留DNA不純物の日常的な管理はあるが、包括的に証明されているとは考えられない。この工程の頑健性を高めるための研究が進行中であることが確認されており、報告されるべきである（REC7）。”

2021年2月のEMAのアセスメント報告書では、活性物質レベルでの残留DNA不純物のルーチン管理にもかかわらず、DNase消化ステップの頑健性が十分に実証されていないことが指摘された。このステップの頑健性を向上させるための研究が進行中であり、これらの研究は販売承認者（BioNTech社）の推奨（REC7）に従って報告されるべきであることが確認された。

2021年5月からのEMA文書

2021年5月からのEMA-文書

“この報告書は、MAHが行った以下の認可後のコミットメントをカバーしている：
REC7：MAHは、原薬製造工程におけるDNase消化工程の頑健性を高めるために実施された研究の結果を提供すべきである。”

このEMA文書の抜粋において、「MAH」とは、医薬品コミナティの販売承認（BioNTech）を保有する企業である販売承認者を指す。

この一節によると、MAHは、原薬製造工程におけるDNase消化工程の堅牢性を向上させるために実施された研究の結果を提供することを、承認後の約束としている。

これを明確にする：

• 3.5.2.で述べたように、DNaseはDNAを分解する酵素である。
• 活性物質の製造工程とは、医薬品の実際の活性物質が製造される工程を指す。
• DNase消化工程は、DNAを消化・除去するためにDNaseを使用する製造工程中の特定の工程である（3.5.2章 合成mRNAの精製-工程2を参照）。
• このステップのロバストネスとは、製造工程におけるこのステップの安定性と信頼性、そしてさまざまな状況下でどれだけ機能するかということである。

EMAはMAHに対し、活性物質の製造工程におけるこの特定の段階が信頼でき、安定したものであることを保証するために実施された試験の結果を提供するよう求めている。これは医薬品の品質と安全性を確保するためであり、特にDNA残留物による不純物の可能性を考慮したものである。

2021年5月からのEMA-文書

「DNase消化ステップの堅牢性を高めるために開始された研究の詳細な報告はない。

「DNase消化ステップの頑健性を高めるために実施された研究の結果の詳細な要約は、2021年第2四半期末までに提出書類のモジュール3.2S.2.5に含まれる予定である。

“PAMが満たされていない”

EMA文書のこのセクションは、MAHがDNase消化ステップの頑健性を向上させるために実施された研究についての詳細な報告を行っていないことを示している。

「PAMとは“Post-Authorization Measure 「の略で、医薬品が承認された後に講じなければならない措置を意味する。この場合」PAM not fulfilled “は、DNase消化を改善する試験の報告に関してMAH（BioNTech）が取らなければならなかった措置が履行されなかったことを意味する。

この一節によると、MAHは2021年第2四半期末までに、DNase消化ステップの頑健性を改善するために実施された研究の結果の詳細な要約を、一件書類のモジュール3.2.S.2.5に提出することになっている。

2021年8月からのEMA文書

DNase消化ステップの頑健性の向上」についての議論が続いている。

2021年8月からのEMA-文書

DNase 消化ステップの頑健性を高めるために実施された研究の結果を提供するという勧告#7 は、まだ一部しか満たされていない。2021年第2四半期末までに、研究結果の詳細な要約を提出し、これらのデータを提出書類のモジュール3.2.5.2.5に含めるなど、勧告#7 を満たすためのさらなる行動が必要である。

認可後の措置への対応
ACMF PPQキャンペーン中に観察された残留DNAの増加を受けて、DNase I消化工程の頑健性を高めるための小規模実験が開始された。残留DNAテンプレートのレベルに対する反応成分、プロセスパラメーター、操作パラメーターの影響をよりよく理解するための研究が行われた。小規模の研究では結論が出ず、DNaseステップの調整は推奨されていないため、これらの研究からのデータは提供されていない。

本文では、DNase消化ステップの頑健性を改善するための研究結果の提出に関する勧告No.7（REC7）は、部分的にしか履行されていないと述べている。さらなる対策が必要であるとしている。この勧告に対するBioNTech社の回答には、DNase I消化工程の頑健性を改善するための小規模試験が含まれている。これらの試験は、残留DNA量に対する様々な要因の影響をより良く理解するのに役立つはずである。しかしながら、実施された研究は結論に至っておらず、従ってDNaseステップの調整は推奨されないと結論づけられている。その結果、これらの研究からのデータは提供されていない。

2021年8月からのEMA-文書

ページのEMA報告書では、”GMP検査チェック「は」No“と評価されている。この評価は、GMP（Good Manufacturing Practice：医薬品の製造管理および品質管理に関する基準）の検査において、特定の要件または基準への適合に関する欠陥または不備が確認されたことを示す。その時点で、製品CormirnatyはGMP基準に適合していなかった。

2022年3月からのEMA文書

2022年3月のEMAの文書には、ステータス「REC 7」について以下のように書かれている：

2022年3月からのEMA-文書

「REC 7：「MAHは、DNase消化工程の頑健性を高めるために実施された研究の結果を提供すべきである」は、部分的に満たされている。

2022年3月からのEMA-文書

「REC/027 進行中、CHMP 結論　20/05/2021：2021年第2四半期末までに、試験結果の詳細な要約を提出し、これらのデータを添付文書のモジュール3.2.S.2.5に含めるなど、推奨7を満たすためのさらなる対応が必要である。”

「VAR IB-55: 申請者は、小規模研究は結論が出ず、DNase 消化ステップの調整は推奨されないと考えているため、結果は提供されない。これは受け入れられず、変更が必要ないことを裏付けるデータを提供すべきである。加えて、DNase I 活性と社内法で測定された残存 DNA テンプレートのレベルとの相関を十分に評価すべきである。”

「VAR IB-106-G：REC#7 を完成させるために、マインツ／レントヒラーとマールブルクの2つの追加施設のデータを提供すべきである。添付文書の3.2.S.2.5項を、3カ所すべての残留DNAレベルのデータで更新すべきである。さらに、3.2.S.2.5項は、強化された工程管理に関する情報で更新されるべきである。可能であれば、微調整は関連する受入基準に反映されるべきである。”

EMA文書のこのセクションは、医薬品「トジナメラン」の製造に関連する製造販売業者（MAH）の一定の義務（勧告、REC）の履行に関する審査について言及している。

「トジナメラン」はファイザー・バイオエヌテック社のCOVID-19ワクチンの有効成分名である。このワクチンは「Comirnaty」という商品名で販売されている。「Tozinameran」は、世界保健機関（WHO）が定めた有効成分の国際非専有名称（INN）である。この用語は、ブランド名とは関係なく、ワクチンの特定の有効成分を特定するために使用される。

部分的に達成された：DNase消化ステップの頑健性を向上させるために実施された研究の結果を提示するという公約は、部分的に履行されたことに留意されたい。しかしながら、勧告7（REC 7）を完全に遵守するためには、さらなる行動が必要であることが指摘される。

各変数（VAR）に関する特別な考慮事項：

• VAR IB-55:申請者はこの研究を結論の出ないものと考え、DNase 消化ステップの調整を推奨していないため、結果は提供されない。しかし、これは認められず、変更の必要がないことを示すデータが要求されている。さらに、DNase I 活性と会社独自の方法で測定された残存 DNAとの相関を適切に評価すべきである。
• VAR IB-106-G: 勧告7（REC7）を完成させるために、マインツ／レントヒラーおよびマールブルクの 2つの追加施設のデータを提供すべきである。添付文書の3.2.S.2.5項を更新し、3カ所すべての残留DNA含量のデータを提供すべきである。さらに、3.2.S.2.5項は、強化された工程管理に関する情報で更新されるべきである。可能であれば、軽微な調整を対応する受入基準に反映させるべきである。

全体として、EMAの公式文書によれば、2022年3月、つまりバイオエヌテック・ワクチンの大量使用から1年以上経過した現在も、この点は明確にされていない。

EMAは、”Partly Fulfilled“の認定にもかかわらず、MAH（BioNTech）が提案したバリエーションを “is/are approvable“とみなしている：

2022年3月からのEMA-文書

DNase Iの堅牢性に関するEMAとファイザーの論争をよりよく理解するために、ThermoFisher SCIENTIFICの記事がさらなる洞察を与えてくれる。この論文では、すべてのDNAコンタミネーションを完全に除去することは困難であることを指摘している。

6.2. ポール・エーリック研究所（PEI）

6.2.1. PEIとは何か？

パウル・エーリック研究所（PEI）はドイツの連邦当局で、連邦保健省の下で運営されている。ドイツの医学研究者ポール・エーリックにちなんで命名され、ヘッセン州ランゲンにある。PEIはドイツにおける医薬品の安全性とワクチンの承認において中心的な役割を果たしている。PEIの主な業務は以下の通り：

承認PEIは医薬品とワクチンの承認に責任を負う。PEIは、新薬やワクチンの品質、有効性、安全性をチェックし、認可を得る。

モニタリングPEIは、すでに市販されている医薬品とワクチンの安全性と品質を継続的に監視している。製品が適用される基準に従って製造され、安全性、純度、有効性の要件を満たしていることを確認する。また、潜在的なリスクを早期に発見し、公衆衛生を守るための適切な措置を講じるため、副作用や有害事象に関する報告を収集し、評価する。

研究開発PEIは、医薬品の安全性とワクチン開発の分野でも研究を行っている。他の国や国際機関、学術機関や産業界と密接に協力し、新たな知見を得るとともに、健康増進のための革新的なアプローチを推進している。

6.2.2. ポール・エーリック・インスティトゥート（PEI）への質問

27.09.2023 – ÄFIからPEIへの書簡

ÄFI = 個々の予防接種決定のための医師 e.V.
(予防接種個別決定医師団)

ケビン・マッカーナンの研究により、またドイツにおけるワクチンの監視と品質保証に関するPEIの責任を考慮し、”Ärztinnen und Ärzte für individuelle Impfentscheidung e.V”（個人のワクチン接種決定のための医師団）は、2023年9月27日、PEI宛の書簡の中で、”ファイザー/バイオエンテックとモデルナのmRNAワクチンにおけるDNA汚染”というトピックについて、重要な疑問を提示している。

質問1：PEIが実施または開始するワクチンの安全性評価は、そのような異物（DNAを含む断片／プラスミド）を検出、分類、定量化するように設計されていますか？

質問2：「はい」の場合、PEI はどのような知見を得ましたか？PEI は、前述の mRNA ワクチンに DNAが有意に混入していることを示す知見を得ましたか？

質問3：「いいえ」の場合：2023年春に上記の結果が明らかになった後、PEIはドイツで使用された両ワクチンメーカーのバッチについて、汚染を排除するための安全性試験プロトコルの予防措置を取りましたか？

19.10.2023 – PEIからÄFIへの返答

PEIからの回答には次のように記されている：

「Paul-Ehrlich-Institutは、欧州OMCLネットワークの公式管理試験所であり、EU委員会が承認したCOVID-19ワクチン製品Comirnaty（すべての適応症と濃度）のほとんどのバッチを、OMCLのガイドラインと承認仕様書に従って試験し、該当する場合には、ドイツの国家バッチリリースを許可している。

「OMCLは、ワクチン中の残存DNA量のような、製造業者によって実験的にしか試験されないパラメータについては、製造業者の試験結果をチェックし、認可で指定された制限値をバッチごとに満たしているかどうかを確認する。

COVID-19ワクチンについてOMCLが実施するバッチリリース試験を表2にまとめた。

「ポール・エーリック研究所がテストし、公表したバッチには異状は見られなかった。したがって、それ以上の安全対策は必要なかった。すべての基準を満たさないバッチは、ドイツ市場では承認されない」

要約すると、ポール・エーリック研究所からの回答は、DNAの残留があることを確認し、ワクチン・バッチの実験的検証は製造業者が独占的に行っている。

この議論は勢いを増し、医療関係者からこのテーマについてさらに多くの問い合わせが寄せられるようになる。これを受け、ポール・エーリック研究所（PEI）は2023年12月22日、医療関係者向けの情報を掲載した書簡を発表する。

22.12.2023 – PEIからの医療従事者向け情報レター

この書簡から、PEIの主要な声明を分析する。より分かりやすくするため、文言は個別のセクションに分けられている。

セクションI

「COVID-19 mRNAワクチンの汚染疑惑に関して世間に出回っているデータや調査の多くは、方法論的欠陥に基づいている。さらに、調査されたワクチン用量の不適切な保管の可能性という問題もある。”

つまり、PEIは、ワクチンの残留DNAをあえて検査した科学者たちの無能を示唆しているのである。これらの科学者には、特に以下のような人々がいる：

ケビン・マッカーナン博士は、ヒトゲノム計画で研究開発チームを率いた。メディシナル・ゲノミクス社を設立し、アジェンコート・バイオサイエンス社を共同設立。著名なゲノム学者であり、ブレイクスルーシーケンス技術を開発。

David J. Speicher博士は、オンタリオ州ハミルトンにあるレディーマー大学の生物学および健康科学の助教授である。ウイルス学の博士号を有し、分子生物学的手法を用いた感染症の検出に豊富な経験を持つ。唾液バイオマーカーを用いた感染症検出を研究テーマとし、COVID-19検査施設の責任者を務めた経験もある。

サウスカロライナ大学教授のフィリップ・バックホーツ博士は、経験豊富な分子生物学者であり、がん遺伝学者でもある。グローバルな遺伝子発現解析や遺伝子変異の検出に次世代シークエンシング技術を活用する豊富な専門知識を持つ。また、ワクチン接種の推進者でもある。

ジェシカ・ローズ博士はカナダの研究者で、ニューファンドランド記念大学で応用数学の学士号と免疫学の修士号を取得。また、バル-イラン大学で計算生物学の博士号を、エルサレム・ヘブライ大学で分子生物学の博士号を、テクニオン工科大学で生化学の博士号を取得。

ケーニッヒ教授は、生物学、化学、医学を専攻し、「医療微生物学と感染免疫学」の学位を取得した。

などなど。リストは広範囲に及ぶ。

セクション II

「科学的に妥当な結果を得るためには、例えば、市販されているワクチン量に含まれる。第三者による残留DNAの実験的測定は、以下の基準を満たさなければならない。
「(i) 限切れ（有効期限を超えた）ワクチンバイアル、または開封済みもしくは不適切に保存されたワクチンバイアルから採取されたサンプルに対して実施してはならない。

a) ワクチン接種へのアクセス

ワクチンは通常、保健当局から医療機関、開業医、専門医、薬局、予防接種センターに配布される。つまり、これらの医療機関は、ワクチンの入手と流通を一種の独占状態にしているのである。

その中で、PEIが以下の2023年12月5日付で「医師と薬剤師」に宛てたアピールが注目される。

「まだ投与可能なワクチンを、手紙に記載された住所に送らないでください。そうすることで、貴重なワクチンを本来の用途から奪うことになります。”

同時に、何百万本もの貴重なワクチンが廃棄されている。そのわずか5日前、2023年12月1日付のZEIT ONLINEは、「今、パニック買いが復讐を始めている」と見出しを打っている。記事にはこうある：

“今年だけでも、9500万回分のコロナワクチンが中央倉庫で期限切れとなり、廃棄された……これは、これまでにドイツに納入された4億5800万回分の約3分の1に相当する……また、厚生省の報告によれば、さらに5600万回分のワクチンが現在連邦中央倉庫に保管されているため、期限切れワクチンの数は今後も増え続けると予想される”

これは疑問である。ワクチンの供給過剰が明らかであるにもかかわらず、なぜ検査のための個別用量の供給が妨げられているのか？ポール・エーリック研究所（PEI）はこの点についてどのような懸念を抱いているのだろうか？これらの追加検査は、独立研究所の結果を否定する可能性がある。なぜPEIは自らをテストしないのか？PEIによるこの反応はどの程度信頼構築に役立っているのか？

b) クラウス・チヒュテック 「ワクチンの品質に関する規制要件」について

COVID-19ワクチンの開発加速：2009年から2023年末までポール・エーリック研究所の総裁を務めたクラウス・チヒュテック氏は、他の研究者らとともに、「技術プラットフォーム、利益、関連するリスク」と題する論文を執筆し、以下のように支持している：

ワクチンの品質に関連する規制要件

一般的なワクチンと同様に、COVID-19ワクチン開発においては、完全に品質が保証された製造工程の確立が基本的に重要である。そのためには、工程に特化した詳細な開発および仕様、ならびに工程内管理を含む適切な管理手段の実施が必要である。ワクチンの製造全体は、「適正製造規範」（GMP）…COVID-19ワクチンについては、これらの工程性能確認ロットの製造範囲に関して、あるいは同じプラットフォーム技術の類似製品に関するそれぞれのデータを考慮することにより、ある程度の柔軟性が適用されている。
これらの試験には、コンタミネーションの可能性を最小限に抑えるための管理も含まれる。
承認されたワクチンは、Paul-Ehrlich-Institutまたは欧州OMCLネットワークの他の公的管理試験所によるバッチ試験も受ける。これにより、効力のような品質保証上特に重要なリリーステストは、正式なバッチリリースが市場に出る前に、適格な公的試験機関による追加的な実験的チェックを受けなければならないことが保証される。

臨床試験の要件

しかしながら、承認後、ワクチンの有効性（「日常使用における有効性」）と安全性に関するさらなる研究が連邦当局によって実施される。

調査中の医薬品のベネフィット・リスク評価の再検討には、例えば以下のようなものが含まれる：

• 重篤な副作用が予想され、予期せぬ結果となった症例が報告されている、
• 予想される重篤な副作用の頻度が臨床的に関連性をもって増加した、
• 関係者の安全性に影響を及ぼす可能性のある、試験の実施または調査対象医薬品の開発に関連する事象。

2023年12月5日付のPEI書簡にある前述の要求と、これらの記述はどのように矛盾するのか？

c)期限切れで密封されたmRNAワクチンバイアルで、残留DNA含量が増加する可能性はありますか？

DNAの半減期は521であり、サンプル中のDNA分子の半分がこの時間後に崩壊することを意味する。DNAが分解して小さく断片化しても、サンプル中のDNAの総量は変化しません。QubitフルオロメトリーとqPCRは単位体積当たりのDNA濃度を測定しますが、試料中のDNAの総量は、DNAがより小さな断片に分解されても変わりません。従って、mRNAワクチンバイアル中の残存DNA量は、2年という短期間であっても、最適な保存条件下であっても増加することはありません。

セクション III

「(ii)残留DNA量を決定するために使用された方法が適切で再現可能であることが証明されなければならない-特に、ワクチンバイアル中の脂質ナノ粒子の存在による試験干渉は除外されなければならない（最終ワクチンバイアルで試験する場合は保証できない）。

Speicherらの研究では次のように述べられている： 「これら3つのバイアルのワクチンを10倍に連続希釈し、qPCRでLNP阻害を評価した（図5）。1:10希釈後（1:10,1:100,1:1000）に予想される～3.3Cqの反応が観察されたことから、これらの希釈ではDNAの定量に影響を与える可能性のあるLNP阻害が存在することが示唆された（図6）。したがって、1:10希釈のデータをさらなる分析に使用した。この希釈は、いくつかの用量が使用前に希釈されるように設計されているという事実と同様に、計算において考慮された。”

これは、ワクチンバイアル内の脂質ナノ粒子の存在による潜在的な試験干渉を考慮した対策が取られたことを示している。

セクションIV

「(iii)使用される方法は、信頼性が高く検証可能な結果を提供するために検証されていなければならない。

“McKernanら（2023年4月）およびSpeicherら（2023年10月 ）による頻繁に引用されるプレプリント出版物では、選択された方法論のトレーサビリティの詳細と同様に、言及された条件が満たされたかどうかに関して提供される情報が不十分である。方法論のバリデーションは、使用された方法論が、常に、操作者に関係なく、信頼性が高く再現性のある結果をもたらし、その方法が意図された目的に適していることを保証するために不可欠である。残留DNA測定において科学的に健全な測定結果を得るための前述の条件は、製造業者によって遵守されている。”

ケビン・マッカーナン博士が、ポール・カレン教授、ヘンリーケ・スタール教授とのインタビューでこの話題について語っている：

「私たちの方法は一般に公開されており、独立した研究所によって再現されています。しかし、PEIは独自にワクチンのDNA検査を行っておらず、この検査は製造業者に委ねている。一方、製造業者は、私たちの知る限り、その検査方法についての詳細な知見を提供していない。サイバー攻撃によって開示されたEMAの文書だけが、検査方法についての若干の知見を提供している。もし、メーカーやPEIが自らの検査方法や自己収集したデータを透明性をもって公表すれば、私たちは喜んで比較し、互いに学び合うことができるだろう。「

」この時点まで、私たちの方法は、一般に利用可能な唯一の測定法であるだけでなく、最も検証された方法でもある。なぜなら、グラジエントPCR、検出下限値の決定、PCRプライマー濃度の分析、PCR阻害分析など、さまざまな「ストレステスト」を即座に行ったからである。さらに、増幅されたDNA断片は、ゴールドスタンダード、いわゆるサンガー法を用いて、第三者によって塩基配列も決定された。イルミナとオックスフォード・ナノポア法を用いた標準的な塩基配列決定も、いくつかの独立した研究室で行われた。”

「上記の」Rolling Review“文書からわかるように、EMAはDNA測定にはqPCRを、RNA測定には紫外線スペクトルのフルオロメトリーとスペクトロメトリーを認めている。この手順は、モデルナ社のボスであるStéphane Bancelが出願した特許US10.077.439と矛盾する。ここでは、qPCRは約100塩基対未満の断片を検出できないため、DNA量を過小評価することが示されている。

6.3. 簡単な要約

• 欧州医薬品庁（EMA）は、当初から「製造関連の残留DNA不純物」の問題を認識していた。早くも2021年2月には、DNAの除去に使用されるDNase消化ステップ（REC7参照）の頑健性（すなわち信頼性）を明らかにするため、メーカーに追加データを特に要求した。
• 2022年3月、EMAは申請者が小規模試験の結論に疑問を呈し、DNase消化ステップの調整を推奨しなかったため、結果を提出しなかったと指摘した（VAR IB-55）。この見解はEMAに受け入れられず、申請者は変更の必要がないことを示すデータの提出を求められた。さらに、DNase消化ステップと残存DNA含量との相関関係を十分に評価すべきであることが強調された。これらの懸念にもかかわらず、EMAは正式な承認を与えた。
• ポール・エーリック研究所（PEI）は、ワクチンに残存DNAが存在すること、およびワクチン・バッチの実験的検査が製造業者によってのみ実施されていることを確認している。
• PEIは、独立研究所が報告したワクチン中の残留DNAに関する測定結果に疑問を呈している。当局は、使用された測定方法と使用されたワクチンサンプルの品質に疑問を呈している。
• ポール・エーリック研究所（PEI）は、「医師と薬剤師への書簡」を送付し、ワクチンの接種量を独立した検査機関に送らないよう要請した。この呼びかけは、ワクチン投与量が余っている時期に行われた。
• McKernanらとSpeicherらの実験データは、現在の科学的基準を満たし、Pfizer/BioNTechとモデルナも使用している確立された手順に基づくものであるが、PEIは、すべての関係者が関与する独立した実験的調査をさらに行うことによって論争を明確にする努力をしない。

7. さらなる調査が必要か？

第6章の記述からは、mRNAワクチンの製造業者も、担当の規制当局も、第5章で得られた知見に専門家がさらに関与することに関心がないような印象を受ける。

規制当局の主な主張をマッカーナンが要約した：

図52：規制当局の対応【パワポ録画マサチューセッツ-スライド14

DNAが短すぎる、DNAの量が少なすぎる、DNAが機能的でないという当局の結論が、明確で議論の余地のないものであるかどうかを調査することが重要である。これらの結論を批判的に精査し、主張が本当に正しいのか、さらなる調査が必要なのかをより詳細に検討することが重要である。

7.1. 残留DNAに関する公式声明

ここでモデルナの特許のうち2つを取り上げておきたい。

特許US 10077439 B2“mRNA製造工程におけるDNA断片の除去”

ステファン・バンセル（モデルナ社CEO）らが執筆したモデルナ社のこの特許（2014）には、医薬品に残存するDNAが自然免疫反応の活性化を誘発し、特定の患者集団において発がん作用を引き起こす可能性があることが明記されている。

[なぜなら、医薬品中に残存するDNAは、自然反応の活性化を誘発する可能性があり、患者集団において癌化する可能性があるからである。規制ガイドラインはまた、RNA製品中のDNA鋳型の定量、管理、除去を要求することもある。現在利用可能あるいは報告されている方法では、この欠点に対処できない。

特許US 10898574 B2「人工核酸の送達と製剤」

モデルナ社の別の特許（2021）には次のように明記されている：
「効果的なタンパク質発現を達成するために医薬組成物を送達する先行方法論には、治療薬とバイオプロセス用途の両方で複数の問題がある。例えば、導入されたDNAはある程度の頻度で宿主細胞のゲノムDNAに組み込まれ、その結果、宿主細胞のゲノムDNAに変化や損傷をもたらす可能性がある。あるいは、細胞に導入された異種デオキシリボ核酸（DNA）は、娘細胞（異種DNAが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず）または子孫に遺伝する可能性がある。」

2009年の “FDA Guidanceon Prophylactic DNA Vaccines：2009年の「分析と推奨」にはこうある：

「DNAは「従来の」（非DNA）ワクチンの汚染物質と考えられています。製造者は通常、製造工程で外来DNAを最小化または除去し、ヒトが潜在的に有害な物質に暴露されるのを最小限に抑えています。当然のことながら、プラスミドDNAが宿主ゲノムに組み込まれ、悪性形質転換、ゲノムの不安定性、細胞増殖異常の可能性が高まるのではないかという懸念は、DNAワクチンが初めて臨床使用されることが提案された時に提起されました。

7.2. このテーマに関するさらなる研究

7.2.1. ウイルスワクチンに残存する細胞基質DNAに関連する問題

ウイルスワクチンに残存する細胞基質DNAに関連する問題」と題されたこの研究は、ウイルスワクチンに製造細胞基質由来の細胞DNAが残存することは避けられないと指摘している。このDNAが安全性リスクをもたらすかどうかは不明である。DNAには考慮すべき2つの生物学的活性がある。第一に、DNAは発がん性があり、第二に、DNAは感染性がある。

7.2.2. 哺乳動物細胞へのトランスフェクションによる末端修飾直鎖DNAの高い自然統合率

哺乳動物細胞へのトランスフェクションにおける末端修飾直鎖DNAの高い自発的組込み率」と題されたこの研究では、細胞を様々な形態のDNAで処理した後、ゲノムへの遺伝物質の組込み頻度が調査された。その結果、様々な形態の直鎖DNAで処理した後、細胞の約10～20%が安定的にトランスフェクションされることが判明した。言い換えれば、最初に処理した細胞のかなりの割合が遺伝物質を取り込んでいたのである。DNA末端が変化したにもかかわらず、線状DNAの統合は同様の頻度で起こった。これらの結果は、細胞は非天然DNA末端を除去し、その後統合によってDNAを救済するメカニズムを持っていることを示唆している。
この研究は、非統合遺伝子治療法がより広く使用されるようになるには、さらなる開発が必要であることを示唆している。

7.2.3. 二本鎖DNAは血管内皮に血栓促進性表現型を誘導する

二本鎖DNAが血管内皮に及ぼす血栓性表現型」と題されたこの研究は、血管内皮として知られる血管の内壁に対する二本鎖DNA（dsDNA）の影響を調べたものである。研究者らは、実験室でヒト内皮細胞を合成dsDNAで処理した。その結果、血液凝固系を活性化する分子の産生が増加することがわかった。その結果、試験管内で血液凝固が促進された。また、dsDNAをマウスに注射すると（生体内試験）、血管内での血栓形成が促進され、血流が停止して血管が完全に閉塞するまでの時間が短縮された。この研究は、ウイルス由来と内因性（自然に体内に存在する）の二本鎖DNA（dsDNA）の両方が、血管内皮において直接的な血栓促進作用を誘導することを示している。

7.3. SV40の塩基配列

SV40の構成要素は遺伝子治療において重要な役割を果たしている。プロモーターとエンハンサーは、標的細胞における外来遺伝子の発現を増強するために遺伝子治療で使用されるSV40 DNAの2つの重要な要素である。

プロモーターは隣接する遺伝子の転写を開始する特定のDNA配列である。SV40では、プロモーターは複製起点と初期プロモーター領域と後期プロモーター領域の両方から構成されている。この構造により、プロモーターは外来遺伝子の発現を効率的に制御することができる。

エンハンサーとは、プロモーターに対する向きや距離に関係なく、プロモーターの活性を増幅することができる調節DNA配列のことである。SV40エンハンサーはその強力なエンハンサー活性で知られており、導入遺伝子の発現を増加させるために遺伝子治療ベクターにしばしば使用される。

遺伝子治療におけるSV40成分の重要な側面は、核内への取り込みをサポートする能力である。SV40エンハンサーは特定のシグナル伝達経路を利用して核孔を通過し、効率的に核内に入ることができる。この観点から、以下の研究は注目に値する：

• SV40ベースの遺伝子治療ベクター：敵を味方に変える
• 無傷の血管系におけるプラスミドの遺伝子導入と発現に対するDNA核標的配列の効果
• プラスミドとタンパク質-DNA複合体の核内標的化

早くも1997年の研究で、特定のSV40配列が細胞核への分子の輸送に重要であることが発見された。その後の1999年の研究では、SV40エンハンサーがプラスミドを様々な細胞種の核内に輸送することに成功していることが発見された。これらの研究結果は、特定のSV40配列がいかに細胞核への輸送を制御できるかを示している。

最も重要なことは、核内インポートは配列特異的であったことである。SV40 DNAの複製起点と初期プロモーターと後期プロモーターを含む領域はインポートを支持したが、細菌の配列だけや他のSV40由来の配列は支持しなかった。

1999年：「対照的に、SV40エンハンサーを持つ同様のプラスミドは、試験した全ての細胞型の核内に輸送される。

7.4. SV40プロモーターとp53-腫瘍抑制遺伝子

ケビン・マッカーナンはプレゼンテーションの中で、SV40プロモーターとp53の相互作用に関する研究に言及した。

p53は腫瘍抑制における重要なタンパク質であり、しばしば「ゲノムの守護神」と呼ばれる。細胞周期、DNA修復、アポトーシス（プログラムされた細胞死）、老化（細胞の老化）を制御している。p53遺伝子の変異は多くの種類のがんで頻繁に見られ、機能喪失や細胞増殖・分裂の制御の乱れにつながる。

ある研究が、p53がSV40ウイルスゲノムの「初期プロモーター」として知られる特定の領域と相互作用することを発見した。その研究結果はこう：「p53タンパク質はSV40初期プロモーターに結合する。

仮定の話だが、これはさまざまな効果をもたらす可能性がある：

p53の機能喪失SV40初期プロモーターがp53に結合してその正常な機能を損なうと、p53の機能喪失につながる可能性がある。p53は重要な癌抑制因子であり、通常は制御不能な増殖から細胞を守っている。従って、p53の機能喪失は、癌やその他の望ましくない細胞変化のリスクの増加につながる可能性がある。

p53を介したシグナル伝達カスケードの破壊：p53は細胞周期調節、アポトーシス（プログラムされた細胞死）、DNA修復に関与する多くの遺伝子の発現を調節する。もしSV40初期プロモーターがp53に結合し、その正常な転写活性を阻害するならば、これらの重要な細胞プロセスが破壊され、遺伝的不安定性や他の細胞障害を引き起こす可能性がある。

他のp53相互作用への干渉：p53は核内で他の多くのタンパク質や調節エレメントと相互作用してその機能を果たしている。もしSV40のDNA配列が核内に入りp53と相互作用すれば、他の重要なp53の相互作用を阻害し、細胞生理に多大な影響を及ぼす可能性がある。

これらは仮説的なシナリオであるため、SV40-p53相互作用の実際の効果を理解するには、さらなる実験的研究が必要であろう。

マッカーナンはプレゼンテーションの中でこのことにも言及している[マサチューセッツのスライド、スライド23]。彼は、SV40とp53の相互作用について遺伝毒性を調査する必要があり、現在遺伝毒性に関する研究は行われていないと述べた。統合的なリスクがあるのか、それとも発癌性のリスクがあるのか、分析し評価する必要がある。

7.5. 残存DNAと脂質ナノ粒子

この研究でSpeicherらは、プラスミドDNAがおそらく脂質ナノ粒子にパッケージされていることを発見した。脂質ナノ粒子の機能は、体内の酵素による分解から内容物を保護することである。脂質ナノ粒子は封入されたDNAを保護し、細胞膜を通過して細胞内に入ることを可能にする。DNAが細胞内に入ると、SV40エンハンサーがDNA配列の一部であれば、DNA配列を細胞核内に輸送するのに役立つ可能性がある。これによってプラスミドDNAがゲノムに組み込まれる危険性が高まる。

フィリップ・バックホーツ博士はこれを次のように例えている：

トロイの城壁の外をうろつく20人のギリシア兵は大したことではない。20人のギリシア兵が大きな木馬の中に詰め込まれるのは、また別の問題だ。

シュパイヒャーらの研究で導き出された結論は以下の通り：

「FDAとWHOのガイドラインは、脂質ナノ粒子におけるDNAのパッケージングを考慮していない。さらに、ガイドラインはLNPベースのmodRNAの累積投与を考慮していない。「

」我々の発見は、ワクチンの安全性に関する既存の懸念を拡大し、LNP（脂質ナノ粒子）を用いた効率的なトランスフェクションが導入される前に考案されたガイドラインの妥当性に疑問を投げかけるものである。いくつかの明らかな限界はあるが、われわれの研究を法医学的条件下で再現し、高効率DNAトランスフェクションと累積投与を考慮したガイドラインの改訂を強く要望する。”

7.6. DNAへの組み込みの可能性

7.6.1. さらなる研究

以下の研究では、まず「long-コビッド症候群患者の血清中のウイルススパイクプロテインとワクチンスパイクプロテインの存在」を調べた。解析した81人のlong-COVID患者のうち、ワクチン接種2カ月後の2人からワクチンスパイクプロテインの断片が検出された。この研究の著者らは、スパイクプロテインの永続的な産生がDNAの変化に基づくものなのかどうかを自問した。この疑問を明らかにするために、彼らは補足研究を行った。

補足研究では、Long-コビッド症候群患者の血液サンプルが「DNA中にBNT162b2ワクチンのスパイクプロテイン配列が存在するかどうか」検査された。そのために、特定のDNA検査を用いて、研究参加者の細胞ゲノムからコロナワクチンの遺伝コードを検出した。その結果、ワクチンに類似したスパイクプロテイン配列の存在が確認された。

考察では、この結果はワクチンスパイクプロテインが患者のDNAに統合された可能性を示している可能性に注目が集まった。また、同様の結果を示した他の研究との関連も指摘された。しかしながら、ワクチンとの統合を確認し、誤りの可能性を排除するためにはさらなる調査が必要であるなど、この研究は自らの限界も認めている。全体として、著者らは、Long-COVID患者におけるワクチン統合の特異性と有病率を評価するために、より大きなサンプルと対照群を用いたさらなる研究を推奨している。

7.6.2. より小さなDNA断片

宿主細胞のDNA汚染に関して患者の安全を確保するため、食品医薬品局（FDA）は細胞・遺伝子治療の製造に関する業界ガイドラインを発表した：

「細胞基質の中には、腫瘍を誘発する遺伝子配列や、感染を伝播する可能性のあるレトロウイルス配列を保有しているものもあるため、ウイルス調製に伴う残存DNAの生物学的活性を最小化する手段を講じることをお勧めします。これは、DNAのサイズを機能的な遺伝子のサイズ以下にまで縮小し、残存DNAの量を減少させることによって達成することができる。連続的な非腫瘍性細胞の残存DNA量を10ng/dose未満に、DNAサイズを約200塩基対以下に制限することをお勧めします。

腫瘍由来の細胞や、腫瘍原性の表現型、あるいは特別な懸念を生じさせる可能性のあるその他の特徴を持つ細胞を使用する場合、製品の安全性を保証するために、特定の残存DNA量の制限が必要となることがある。”

FDAのガイドラインでは、ワクチン中の残存DNAの制限を規定しているが、これは必ずしも200塩基対（bp）より小さいDNA断片が影響を及ぼさない、あるいは役割を果たさないということを意味するものではない。

小さなDNA断片であっても、それが細胞内に入り、細胞機構によって認識されれば、理論的にはゲノムに組み込まれる可能性がある。これらの断片がゲノムの中で機能的な役割を果たせるかどうかは、その塩基配列、ゲノム内での位置、修復機構の有無など、さまざまな要因に左右される。したがって、200塩基対以下のものを含む非常に小さなDNA断片であっても、ゲノムに組み込まれ、生物学的効果を持つ可能性がある。

ケビン・マッカーナンはサブスタックにこう書いている：

ガイドラインの中には、200塩基対以上のDNA断片にのみ焦点を当てているものもある。しかし、200塩基対以下の断片は関係ないという仮定は、欠陥のある論理に基づいている。この仮定は、このサイズのDNAはオープンリーディングフレーム（ORF）、すなわちタンパク質に翻訳するための情報を含むDNAまたはRNAの特定の部分をコードできないという仮定に基づいている。それにもかかわらず、翻訳が可能であったとしても、結果として得られるペプチドは非常に短い（66アミノ酸）ため意味がないか、短いDNAは急速に分解されると仮定されている。

“この議論にはいくつかの欠陥がある。
1) このDNAがヌクレアーゼ耐性を持つLNPの中にあることを規制は予期していなかったので、長さが短いからといって分解が速いということにはならない。
2) 小さなDNA断片でも機能することがある。72bpのSV40エンハンサーはそのようなエレメントの一つで、転写因子をリクルートし、DNAを核に動員することが知られている。David Deansの研究がこれをカバーしている。
3) 小さな断片であっても、もし組み込まれれば、ヒトの遺伝子をフレームアウトさせ、問題を引き起こす可能性がある。

ケビン・マッカーナンはプレゼンテーションの中で、ナノグラム単位のDNA量だけが決定的な要因ではなく、モル比、つまりある量の溶液（投与量）中のDNA分子の数も重要であると強調した。”200塩基の断片は散弾銃の弾丸のようなもので、ゲノムに入り込み、ゲノムを統合して損傷する傾向がはるかに高い”。

7.6.3. より大きなDNA断片

より大きなDNA断片の存在も調査すべき問題である。マッカーナンはインタビューでこの状況を説明している：

「Suttonらは、ハイブリッド、すなわちDNAとRNAのペアが、DNAの分解に関与するDNaseという酵素をブロックできることを示した。このようなハイブリッドはmRNAワクチンにも存在する可能性がある。ワクチンの修飾RNAに含まれるN1-メチル-シュードウリジンは、DNAと相互作用して結合する可能性がある。プラスミドDNAのシークエンシングはスパイク遺伝子の領域ではあまり効果がなかったことから、DNA：RNAハイブリッドがシークエンシング反応を妨害している可能性が示唆された。通常DNアーゼは二本鎖DNA（すなわちDNA:DNAハイブリッド）を標的にするので、このようなハイブリッドが酵素反応を阻害している可能性が高い。この問題については私のサブスタックに詳しく記述してある。”

7.6.4. フィリップ・バックホーツ博士

2023年9月、サウスカロライナ州上院での公聴会で、バックホーツはこう述べた：

「DNAの断片を採取し、ファイザーのワクチンのような脂質複合体と混ぜ合わせる。それを細胞にかけると、その多くが細胞の中に入り込み、その細胞のDNAの中に入り込んで、細胞の永久的な固定物となる。一時的なものではなく、その細胞とそのすべてのプロジニーに、これから先もずっと入っているのです。だから、私はこのDNAがワクチンに含まれることを憂慮しているんだ。DNAはRNAと違って永久的なものだから。これは、幹細胞のような長寿の意味細胞のゲノム改変に対する現実的なハザードであり、理論的な懸念ではあるが、分子生物学に基づけば、その組織に対する持続的な自己免疫反応を引き起こす可能性がある。また、この外来DNAがゲノムのどこに位置するかによって、腫瘍抑制因子を阻害したり、内因性遺伝子を活性化したりする可能性がある。

「DNAは長寿命の情報記憶装置だ。DNAは何十万年も生き続ける。RNAはその性質上、一時的なものであり、長続きしない。RNAのこの特徴はワクチンの売り込みの一部だった。…

「擬似ウリジンはRNAをもう少し長持ちさせるはずでしたが、それでも一過性の現象で、数時間から数日の話です。タンパク質は一度作られると、永遠に持続するわけではなく、数時間から数日です。しかし、DNAに組み込まれたものは、非常に長い間、もしかしたら一生続く可能性がある。

「私の考えでは、誰かが予防接種を受けた人の幹細胞から採取したDNAサンプルの塩基配列を決定し、この理論上のリスクが起こったかどうかを調べるべきだ。

7.6.5. ユルゲン O. キルヒナー博士

というエポック・タイムズ紙の質問に、キルヒナーはこう答えている：

「それはとても重要な質問だ。まず第一に、DNAは何をするのか？DNAが細胞内に導入されると、細胞核に移動してヒトのDNAに組み込まれ、遺伝子のスイッチを切ったり、遺伝子のスイッチを入れたりすることができる。また、細胞核に入るには大きすぎるDNA断片の場合、いわゆる細菌性プラスミドもワクチンから発見されたのだが、このプラスミドはすでに細胞核の外で活性を示すことができる。そして致命的なことは、ワクチンに含まれるプラスミドにはスパイク遺伝子と抗生物質耐性遺伝子が含まれているということだ。…これは科学的に調査される必要がある”

7.6.6. DNA統合の予備的兆候

2024年2月23日にワシントンDCで開催された国際危機サミット-5（ICS-5）で、ケビン・マッカーナンがDNA統合の可能性に関する最新の研究結果を発表した。プレゼンテーションの全容はこのリンクから見ることができる。

9分50秒以降、ワクチンで処理したOVCAR3細胞とMCF7細胞の試験結果が示される。

OVCAR3細胞：この細胞株は、卵巣の悪性腫瘍である卵巣癌に由来する。MCF7細胞：この細胞株は乳癌（乳腺腫瘍）に由来する。いずれの細胞株も、がん生物学の研究、薬剤の試験、治療法の開発のための確立されたモデルである。

ケビン・マッカーナンは、この方法で処理した細胞培養物からDNAが検出されたと報告した。「DNAを見ることができます。非常に高いコピー数です…全ワクチンのゲノムを約3000倍カバーしています」

簡単に言えば、これはワクチンの遺伝情報が細胞内に入り込んだことを意味する。研究者たちは細胞内のDNAを可視化することができ、それが非常に多く存在していることを発見した。

全ワクチンのゲノムを約3000倍カバー」というのは、ワクチンのDNA配列が細胞内でどれくらいの頻度で検出されたかということである。3000倍のカバー率」とは、DNA配列が検査された細胞内に平均して約3000回存在したことを意味する。これは、ワクチンの遺伝情報が大量に細胞内に入り込んだことを示している。

ケビン・マッカーナンは続けた：「ゲノム統合も2つ見つかりました。これらはqPCRのデータと同様、まだ再現されていませんので、非常に初期の段階ですが、スパイク配列と12番染色体、スパイク配列と9番染色体の間にDNAの融合が見られます。これはロングリード・シークエンサーで確認する必要がある。もう少し検証が必要だが、それでも少し心配だ。

詳細はこちら。

7.7. さらなる調査の必要性

WDRは2024年1月18日にも、mRNAワクチンにおけるDNA汚染について報じている：

以下はその要約である。

モアーズ・クリニックの肺専門医であるトーマス・ヴォシャール医師がWDRのために以下の質問に答えた：

「mRNAワクチンの再評価の時期に来ていることに同意しますか？」

「ええ、もちろんです。明らかになったことが2つあります。ひとつは、製造工程上、DNAがごく微量に存在する可能性があること。これはWHOの仕様です。なぜこれが妥当なのか、なぜ許可されているのか、疑問を持たざるを得ない。なぜなら、WHOは関連するリスクはないと言っているからで、だから私は今のところ安心しています。しかし、それはわかりません。どの程度なら無害で、どの時点で危険となるのか、まったく研究されてい�