Application of methylene blue -vitamin C –N-acetyl cysteine for treatment of critically ill COVID-19 patients, report of a phase-I clinical trial

www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014299920305860

要旨

COVID-19は、重症急性呼吸器症候群を引き起こす世界的な大災害である。発症機序は不明のままで、低酸素症が主な合併症の一つとなっている。現在承認されている治療法はない。COVID-19によって誘発される微生物の脅威は、マクロファージの活性化を引き起こし、大量の炎症性分子と一酸化窒素（NO）を産生する。

プロ炎症性表現型へのマクロファージ集団の活性化は、自己強化サイクルを誘導する。酸化ストレスとNOはこのサイクルに寄与し、患者を殺すことができるカスケード炎症状態を確立する。簡単な治療法でこの悪循環を中断することで、重症患者の命を救うことができるかもしれない。

亜硝酸塩、硝酸塩（NOの代謝物）、メトヘモグロビン、プロオキシダント-抗酸化バランスレベルは、25人のICU COVID-19患者と25人の健康な人で測定された。最後の治療オプションとして、5人の患者にメチレンブルービタミンC-N-アセチルシステイン（MCN）を投与した。

亜硝酸塩、硝酸塩、メトヘモグロビン、酸化ストレスは健常者と比較して患者で有意に増加した。5人の患者のうち4人は治療に対して良好な反応を示した。

結論として、NO、メトヘモグロビンおよび酸化ストレスは、重症COVID-19病の病態形成に中心的な役割を果たしている可能性がある。MCN治療はこれらの患者の生存率を高めるようである。

マクロファージの活性化が致命的なNO、酸化ストレス、サイトカインカスケード症候群につながるという悪循環を考慮すると、MCNの治療効果は妥当であると思われる。したがって、より広範な臨床試験が設計されている。なお、本試験では、FDAが他の疾患で承認している低価格の薬剤を使用していることに注意が必要である。

試験登録番号
NCT04370288。

キーワード

コロナウイルスCOVID-19治療メチレンブルービタミンCN-アセチルシステイン

1. 序論

SARS-CoV-2による致命的なCOVID-19の急速な蔓延は、現在、全世界にとって悪夢となっている。COVID-19はこの壊滅的なパンデミック病の原因となっている。WHOの報告によると、感染者の14%が重症化して入院を必要とし、5%の感染者が非常に重症化して集中治療室への入院（主に人工呼吸）を必要とし、4%の感染者が死亡するという（Grech、 2020）。

重症COVID-19病の病態生理と治療法を見つけるために膨大な努力がなされてきた。多くの治療法が提案されているが、ほとんど成功していない。非常に低い生存率とICUでの長期治療につながる重症患者の治療のための世界的に承認されたプロトコルは存在しない。このようにICUでの長時間の治療は成功しないことが多く、先進国や豊かな国でも医療システムに大きな負担をかけている。組織損傷の正確なメカニズムは不明のままであり、患者の管理は、主に支持療法、例えば、酸素化、換気、および流体療法の提供を強調している（Galluccio et al 2020）。臨界状態の病態をよりよく理解することは、合理的な根拠に基づいた臨床治療戦略を開発し、どのサブセットの患者が重症化のリスクが高いかを決定するために極めて重要である。現在標準治療として使用されている治療法や臨床試験で使用されている様々な治療法によって調節可能な疾患経路に関与する因子の測定を開始することが重要である。

SARS-CoV-2は、マクロファージを活性化させて大量の炎症性分子を産生させ、このサイトカインストーム症候群は、CoVID-19患者における死亡の主な原因である（Allunno et al 2020）。また、誘導性一酸化窒素（iNO）（Miclescu and Wiklund、 2010）や活性酸素種（ROS）（Shehat and Tigno-Aranjuez、 2019）の過剰生産がマクロファージの活性化に伴って起こり、サイトカインの過剰生産のためにマクロファージが活性化するという悪循環に陥ることは他の疾患でも知られている（Wang and Ma、 2008）。

NOと酸化ストレスは、COVID-19患者の主な合併症の一つである低酸素を増加させる中心的な役割を果たすことができるだろうか？効果的で強力な抗NO療法と抗酸化療法を用いて、NOと活性酸素のこの悪循環を阻止することはできるのであろうか？

医学では、メチレンブルー（メチレンブルー、酸化形態、青色）ではなく、還元形態（還元型メチレンブルー：Leucomethylene blue、無色）は、マラリア、手術、整形外科、細菌感染症、ウイルス感染症などの様々な疾患に使用されてきた（Hamidi Alamdari et al 2020）。

COVID-19患者における低酸素症の可能性のある理由は、ヘモグロビンに含まれる鉄の鉄から鉄の形態への酸化に起因するメトヘモグロビン血症である。この酸化は、酸素を運ぶヘモグロビンの能力の低下と関連している（Hamidi Alamdari er al)。

本研究では、亜硝酸塩、硝酸塩（NOの代謝物）、メトヘモグロビン（メトヘモグロビン）、プロオキシダント-抗酸化バランス（PAB）が、ICU患者の低酸素を激化させる関与因子として推定された。5名の重篤なCOVID19患者は、標準治療の後、医師によって最終段階にあることが特徴で、温情的治療としてメチレンブルー、ビタミンC、N-アセチルシステインを投与され、すでに実施されているより大きな臨床試験に含まれている。

2. 材料と方法

本試験は、倫理委員会の承認（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04370288; 2020年4月19日）を経て、書面によるインフォームドコンセントを得て、2020年にイラン・マシュハドのマシュハド医科大学で実施された。また、本臨床試験はIRCTへの登録申請を行った（Trial Id 49、767）。

本試験は、Pa02/Fi02が200以下でICUに入院したCOVID-19肺炎患者25名と健常者25名を対象に実施した。全患者の血液ガス、CBC、LDH、CRPを測定し、高分解能コンピュータ断層撮影（HRCT）を行った。

2.1. 血漿中の亜硝酸塩、硝酸塩の測定

NOは、その短い寿命（数ミリ秒）のため、その酸化生成物：亜硝酸塩と硝酸塩の量に基づいて決定された。亜硝酸塩と硝酸塩は、血漿サンプルのためのGriess反応アッセイを使用したYegınによって記載されている方法に従って測定された（Yegın er al)。、 2015）。

2.2. メット-Hb

抗凝固剤としてEDTA-K2を用いて鮮血を採取し、氷上で実験室に移した。メトヘモグロビンは、佐藤（Sato er al)。

2.3. PAB

PABは、Alamdari DH(Alamdari er al)。、 2007)に記載された方法に従って測定した。

2.4. 臨床試験患者

最後の治療オプションとして、ICUCOVID-19の患者25人のうち5人を臨床試験に募集し、MCNを用いた治療を行った。患者には、メチレンブルー（1mg／kg）をビタミンC（1500mg／kg）およびN-アセチルシステイン（1500mg／kg）とともに、各症例について記載されているように経口または静脈内投与した。

2.5. 臨床試験の基準

包摂基準は以下の通りであった。COVID-19（採取した鼻咽頭スワブ上のRT-PCRまたは臨床的特徴とHR-CTによる）が確認された症例であり、年齢が18歳以上であること。除外基準：G6PDH欠乏症の既往歴、重度腎不全、肝硬変、活動性慢性肝炎、メチレンブルーに対するアレルギー反応の既往歴のある患者、免疫抑制剤による治療歴のある患者、妊娠中または授乳中の女性。

3. 結果

患者および健常者の人口統計学的特徴および検査結果を表1に示す。メチレンブルーによる治療前後の患者のデータを表2に示す。

表1. 患者、健常者（HI）の人口統計学的特徴と検査結果

HI (n = 25) 患者群 (n = 25) P値

• 年齢（） 56.6±11.4 59.9±13.6 0.22
• 男／女 12/13 11/14 0.74
• NO2・(μmol/l) 7.6 ± 3.9 10.7 ± 7.9 0.01 a
• NO3・(μmol/l) 22.4 ± 15.3 44.7 ± 30.1 0.002 a
• メトヘモグロビン (%) 2.5 ± 0.9 16.4* ± 9.1 0.0001 a
• PAB (HK) 35.8 ± 15.3 88.4* ± 28.4 0.0001 a
• CRP (mg/dl) 8.7 ± 4.5 94.3* ± 49.5 0.0001 a
• LDH (U/l) 251.6 ± 139.9 1036.6* ± 348.8 0.0001 a

データは平均値±S.D.として示されている。

a患者とHIの間に有意差があった（p＜0.05）。

表2. 治療前と治療後の4人の患者のデータ

治療前（n = 4） 治療後（n = 4） P値

• NO2・(μmol/l) 2.8 ± 13.1 7.0 ± 1.4 0.009 a
• NO3・(μmol/l) 68.2 ± 44.7 40.7 ± 25.2 0.05 a
• メトヘモグロビン (%) 14.7 ± 2.2 4.5 ± 0.5 0.001 a
• PAB (HK) 90.5 ± 6.4 51.7 ± 21.7 0.001 a
• CRP (mg/dl) 99.0 ± 31.0 17.7 ± 2.9 0.005 a
• LDH (U/l) 859.75 ± 219.6 245.0 ± 100.7 0.002 a

データは平均値±S.D.として示されている。

a患者とHIの間に有意差があった（p＜0.05）。

3.1. 症例1

• 1.2020年4月13日、49歳男性が発熱、意識レベル低下、SPO2低下、高純度の気管分泌物のため当院のICUに入院した。入院時、患者はRASS -4（Richmond Agitation Sedation Score）を有し、発熱、頻脈、SPO2 86～88%の機械換気下にあった。血圧は正常範囲であった。
• 2.過去の病歴に併存疾患はなかった。
• 3.この患者は、入院14日前から頭痛、咳、筋痛、発熱、呼吸困難のため、2020年2月15日に他のICUに入院したことがある。
• 4.肺HRCTでは、びまん性の両側性基底硝子体混濁（GGO）と肺末梢部の圧密が認められた。上葉と下葉の両方が関与していた。
• 5.血球数は好中球88%、リンパ球3.6%、血小板数は16×103/μl。221×103/μl、LDH：906 IU/l、CRP：82 mg/dl、D-Dimer：2078 ng/ml、総ビリルビン：2 mg/dl、AST：134 IU/l、ALT：89 IU/lであった。RT-PCRはSARS-CoV-2陽性であった。
• 6.アジスロマイシン（500 mg/日）、ヒドロキシクロロキン（400 mg stat、200 mg BD）、メロペネム 1 gr TDSで治療した。
• 7.挿管期間が長かったため気管切開を行った。
• 8.気管分泌物の培養でアシネトバクターやシュードモナスなどの多抵抗性微生物が検出された。
• 9.3日後、呼吸困難が進行したため、カレトラ（ロピナビル/リトナビル、200/50mg）とヒドロコルチゾンを治療プロトコルに追加した。
• 10.亜硝酸塩と硝酸塩、メトヘモグロビン、PABはそれぞれ10.2μmol/l、35.1μmol/l、14%、95HKであった。
• 11.2020年5月24日、45日後に抗生物質への反応が弱く、離乳失敗したため、経口メチレンブルー(1mg/kg)ビタミンC(1500mg)、N-アセチルシステイン(2gr)をブドウ糖100ml中に1日2回投与を開始した。
• 12.副作用は認められず、アレルギー反応も認められた。8～12時間後に尿の色が青や緑になった。
• 13.メチレンブルー投与当日にデカンテーションを行い、気管切開を解除し、予備のバッグマスクによる酸素療法を開始した。
• 14.抗生物質療法を継続し、デキサメタゾン（8mg QID）を開始した。
• 15.メチレンブルー療法を開始した翌日、気管切開部位からの気管分泌量が多いが、高流量酸素でSPO2は90～92%であった。
• 16.メチレンブルー療法を開始して2日目、3日目には患者さんの改善が著しく、簡易フェイスマスクでSPO2が96になった。
• 17.メチレンブルー療法開始後4日目からデキサメタゾンを漸減し、患者の意識は改善し、気管分泌量は減少したが、発熱は少なかった。
• 18.メチレンブルー開始後6日目に酸素療法を中止した。
• 19.23日目にICUから退院した。
• 20.MCNによる治療後、亜硝酸塩は6.6μmol/l、硝酸塩は24.30μmol/l、メトヘモグロビンは4%、PABは62HKであった。

3.2. 実施例2

• 1.2020年5月7日、64歳の女性が意識レベルの低下と呼吸窮迫によりICUに入院した。彼女は直ちに挿管された。
• 2.彼女は過去にうつ病の病歴を持っていた。
• 3.Yangら（2020）の基準に基づき、発熱、呼吸器症状、肺炎の放射線徴候の存在により中等症型を呈した。
• 4.肺HRCTで左肺にGGO（ground-glass opacities）が認められた。
• 5.WBCは12×103/μl，好中球78%，リンパ球12.5%，血小板数は196×103/μlであった。196 × 103/μl、LDH：670 IU/l、CRP：79 mg/dl、D-Dimer。>5000ng/ml以上、総ビリルビン：1mg/dl、AST：116IU/l、ALT：76IU/l、SPO2 96%であった。RT-PCRはSARS-CoV-2陽性であった。
• 6.アジスロマイシン（500 mg/日），ヒドロキシクロロキン（400 mg stat，200 mg BD），セフトリアキソン（1 g BD）による治療を開始した。
• 7.亜硝酸塩と硝酸塩、メトヘモグロビン、PABはそれぞれ17μmol/l、24.3μmol/l、16%、84HKであった。
• 8.2020年5月11日にメチレンブルー(1mg/kg/)ビタミンC(1500mg)、N-アセチルシステイン(2gr)をデキストロース100mlに添加し、経鼻胃管q12 hで7日間投与した。
• 9.副作用は認められず、アレルギー反応も認められなかった。8～12時間後に尿の色が青または緑になった。
• 10.メチレンブルー療法後2日目、患者は無気力であった。
• 11.メチレンブルー療法5日目に機械換気を中止し、気管切開した。
• 12.9日目にICUから退院した。
• 13.MCN治療後、亜硝酸塩・硝酸塩、メトヘモグロビン、PABはそれぞれ8.5μmol/l、18.9μmol/l、5%、53HKであった。

3.3. 実施例3

• 1.2020年5月1日、60歳の女性が発熱と呼吸窮迫によりICUに入院した。
• 2.Yangら（2020）の基準に基づき、発熱、呼吸器症状、肺炎の放射線徴候の存在により中等症型であった。
• 3.糖尿病の既往歴があった。
• 4.肺HRCT検査で両側のグランドグラス不透過症（GGO）が認められた。
• 5.WBCは8.9×103/μl，好中球79%，リンパ球13%，血小板数は275×103/μl．血小板数：275×103/μl，LDH：712IU/l，CRP：90mg/dl，D-Dimer：1508ng/ml，総ビリルビン：1.8mg/dl，AST：125IU/l，ALT：95IU/lであった。RT-PCRはSARS-CoV-2陰性であった。
• 6.アジスロマイシン（500 mg/日），ヒドロキシクロロキン（400 mg stat，200 mg BD），セフトリアキソン（1 g BD）による治療を開始した。
• 7.亜硝酸塩と硝酸塩、メトヘモグロビン、PABはそれぞれ12μmol/l、109.2μmol/l、12%、86HKであった。
• 8.2020年5月4日、メチレンブルー(1mg/kg)ビタミンC(1500mg)、N-アセチルシステイン(2gr)を100mlデキストロース中に30分かけて静脈内注射し、12時間ごとに2日間継続した。
• 9.副作用は認められず、アレルギー反応も認められなかった。8～12時間後に尿の色が青や緑になった。
• 10.2日目、メチレンブルー療法後、簡易フェイスマスクによる酸素療法を行ったところ、SPO2が84%から93%に上昇した。
• 11. メチレンブルー療法4日目にICUから退院した。
• 12.MCN治療後の亜硝酸塩と硝酸塩、メトヘモグロビン、PABはそれぞれ7.8μmol/l、74.5μmol/l、5%、71HKであった。

3.4. 実施例4

• 1.2020年4月22日、66歳の男性が発熱と呼吸困難のため、当院の内科病棟に入院した。
• 2.本人に過去の病歴はなかった。
• 3.肺HRCTでびまん性両側性基底硝子体混濁（GGO）と圧密を認めた。
• 4.WBC：5.4×103/μl，好中球59%，リンパ球34%，血小板数154×103/μl，LDH：1.5×103/μl，LDH：1.5×103/μl，LDH：1.5×103/μl，LDH：1.5×103/μl，LDH：1.5×103/μl．154×103/μl、LDH：906IU/l、CRP：124mg/dl、D-Dimer：1405ng/ml、総ビリルビン：0.6mg/dl、AST：37IU/l、ALT：92。37 IU/l、ALT：92 IU/l、SPO2 88%であった。RT-PCRはSARS-CoV-2陽性であった。
• 5. アジスロマイシン（500 mg/日），ヒドロキシクロロキン（400 mg stat，200 mg BD），セフトリアキソン（1 g BD）による治療を開始した。
• 6.3日後，呼吸困難が進行したため，リバビリン，カレトラ，デキサメタゾンを追加した。
• 7.入院4日後、ICUに移送され、1回の血漿療法を受けた。
• 8.血漿療法後1週間で酸素濃度が悪化（非侵襲的人工呼吸でSPO2 59%、FIO2 100%）していた。
• 9.亜硝酸塩と硝酸塩、メトヘモグロビン、PABはそれぞれ45.1μmol/l、89.2μmol/l、22%、100HKであった。
• 10.メチレンブルー（1mg/kg）ビタミンC（1500mg）、N-アセチルシステイン（2gr）を100mlのブドウ糖に添加し、静脈内に処方した。注射前のSPO2は54%であったが、30分後には74%まで改善し、12時間持続した。 メチレンブルーの調製に予期せぬ制限があったため、本剤の継続は行わなかった。
• 11.副作用、アレルギー反応はなかった。
• 12.2日目、この患者は重度の敗血症性ショック、多臓器不全を呈し、期限切れとなった。このシナリオは、メチレンブルーの投与が遅れ、不完全であったことに起因する可能性がある。

3.5. 症例5

• 1.2020年5月13日、75歳の女性が冠動脈バイパスグラフト術のため緊急手術を受け、2日後にSPO2の低下と呼吸窮迫を呈した。
• 2.Yangら（2020）の基準に基づき、発熱、呼吸器症状、肺炎の放射線徴候の存在により重症型であった。
• 3.肺HRCTでは、グラウンドグラスオパシティ（GGO）を明らかにした。圧迫とGGOを合併していた。異常の分布は胸膜下肺領域で両側性であった。上葉と下葉の両方が関与していた。
• 4.糖尿病と高血圧の既往歴があった。
• 5.WBCは8.9×103/μl，好中球80%，リンパ球12.6%，血小板数は276×103/μl LD．276×103/μl、LDH：1151IU/l、CRP：145mg/dl、D-Dimer：1374ng/ml、総ビリルビン：1.5mg/dl、AST：115IU/l、ALT：90IU/l。RT-PCRはSARS-CoV-2陰性であった。
• 6.2020年5月15日、ICUに転院、血行動態は安定していた。SPO2は酸素療法なしで65～68%、リザーブバッグを介した酸素療法で78～80%であった。
• 7.非侵襲的人工呼吸（NIV）を行った後、SPO2は87-88%に達した。
• 8.治療はアジスロマイシン（500 mg/日），ロピナビル/リトナビル（200/50 mg，2錠×2日），ヒドロキシクロロキン（400 mg stat），ヘパリン5000 IU（q.i.d.静脈内投与），ヒドロコルチゾン（開始用量100 mg TDS，最近漸減）で開始し，5日間継続した。
• 9.亜硝酸塩は13.5μmol/l、メトヘモグロビンは104.3μmol/l、17%、PABは97%であった。
• 10.2020年5月16日、ブドウ糖100mlにメチレンブルー（1mg/kg）ビタミンC（1500mg）、N-アセチルシステイン（2gr）を添加し、経口投与した。
• 11.副作用及びアレルギー反応は認められなかった。8～12時間後に尿の色が青または緑になった。
• 12.心臓手術と白血球症のため、予防的に抗生物質を投与した。
• 13.初日、メチレンブルー療法後、SPO2に有意な変化は見られなかった。
• 14.メチレンブルー療法2日目にSPO2が増加し、非侵襲的人工呼吸（NIV）の持続時間が減少した。
• 15.メチレンブルー療法4日目、患者はNIVを必要とせず、酸素療法なしでSPO2は80～82%、酸素療法では97～99%に達した。
• 16.メチレンブルー療法5日目には酸素療法を必要とせず、SPO2は90～92%となり、完全に覚醒し、経口栄養を開始した。
• 17.7日目にICUから退院した。
• 18.MCN治療後，亜硝酸塩と硝酸塩，メトヘモグロビン，PABはそれぞれ5.1μmol/l，45.2μmol/l，4%，21．

4. 考察

本研究は、患者において、亜硝酸塩、硝酸塩、メトヘモグロビン、および酸化ストレスが健康な人と比較して有意に増加していることを示した。これは、COVID 19疾患で観察されている炎症過程およびマクロファージ活性化と互換性がある（Alunno et al 2020;Wang and Ma、2008）。

 

低酸素誘導の病態生理に関与するこれらの因子を考慮する根拠は以下の通りである。

1微生物の脅威は、コロナウイルスによってマクロファージが活性化され、一酸化窒素（NO）などの炎症性メディエーターやその他の分子を大量に産生することで誘発される。NOは、その発生量や発生源に応じて、プロ炎症剤として、また抗炎症剤として作用する（小林・村田、2020）。マクロファージ誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）が炎症を循環させることが文書化されている（Wang er al)。 サイトカイン投与後、敗血症、潰瘍性大腸炎、関節炎、多発性硬化症、I型糖尿病など多くの疾患で亜硝酸塩濃度の上昇が検出されていることが報告されている（Hibbs er al)。 また、様々な炎症性疾患の経過中に過剰なNOが産生される（Clancy and Abramson、 1995）。病的炎症には単球とマクロファージの重要な役割があることが報告されており;COVID-19患者におけるマクロファージ活性化をモジュレートするための前向きな治療戦略についての議論が続いている（Merad and Martin、 2020）。

2　我々の結果は、COVID-19患者では血液中の亜硝酸塩と硝酸塩のレベルが上昇していることを示した。マクロファージ誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）は、炎症の後に2～3桁の大きさで誘導され、局所的および全身的な亜硝酸塩の増加につながる大量のNOを放出する。Kleinbongard et al 2003）。

3　我々の結果は、COVID-19患者においても酸化ストレスのレベルが増加していることを示した。NOは、酸化ストレス/nitrosative stressの主要な資源の一つである。NOはスーパーオキシド（O2–）などの活性酸素と反応してペルオキシナイトライト（ONOO-）を形成し、細胞にダメージを与える。一方、COVID-19関連凝固症は、深部静脈血栓症（DVT）、肺塞栓症（PE）、虚血性脳卒中、心筋梗塞（おそらくNO5の我々の症例でも観察された）、全身性動脈イベントを含む静脈・動脈血栓性イベントの発生として報告されている（Becker，2020）。iNOSによって生成される一酸化窒素（NO）は、凝固異常や臓器機能障害の重要なメディエーターと考えられている。. iNOSの選択的な阻害は、敗血症に起因する凝固異常や内皮機能障害の減衰と関連していることが証明されている。酸化的/窒素ストレスの減少は、おそらく iNOS 阻害による有益な効果に寄与していると考えられる (Matejovic er al)。、 2007)。数多くの研究により、血栓形成と血栓溶解の両方が酸化ストレスによって制御されていることが明らかにされている。深部静脈血栓症が解決した後、D-Dimerが増加し、酸化ストレスが解決を促進する可能性がある（Gutmann et al 2020）。我々の症例では酸化ストレスとD-Dimerの増加が見られた。

4　NOは血中でセルロプラスミンにより亜硝酸塩に急速に酸化される。亜硝酸塩と硝酸塩は、NO生成のマーカーであり、NO代謝の比較的不活性な最終産物と考えられている(Shiva er al)。、 2006)。炎症性疾患におけるCRPと亜硝酸塩の間には有意な相関がある。亜硝酸塩の測定は、この疾患の治療中に、診断ツールとしてだけでなく、予後を予測するツールになり得ることが示唆されている(Ersoy er al)。、 2002)。我々はまた、患者の亜硝酸塩とCRPレベルの上昇を観察したが、これはおそらく酸化ストレスの増加によるものと思われる。

5　亜硝酸は赤血球膜を通過する。亜硝酸アニオンは、Hbを酸化してメトヘモグロビンにするとともに、Hbを分解して低酸素、ビリルビン、鉄を増加させることが知られている。メトヘモグロビンはより多くの低酸素を誘発する中心的な役割を果たしており、メトヘモグロビンの補正は治療の重要なポイントとなる可能性がある(Vitturi er al)。、 2009)。今回の研究では、患者では健常者に比べてメトヘモグロビンが有意に増加しており、低酸素血症の原因となっている。私たちの症例報告で観察されたように、メチレンブルー患者の治療はメトヘモグロビンを減少させ、その後の低酸素血症レベルを減少させたと考えられる。

6　酸化ストレスはNOに加えて、ヘモグロビン（Fe2+）を酸化してメトヘモグロビン（Fe3+）に変化させる（Gutmann et al 2020）。我々の結果では、酸化ストレスとメトヘモグロビンの増加が認められた。

7　酸化ストレスと炎症は同時に相互作用し、脂質、チオール、アミノ酸残基、DNA塩基、低分子抗酸化物質を含む様々な生物学的標的や細胞の構成成分の酸化・ニトロ化により臓器損傷を助長する活性酸素・窒素種（ROSやRNS）の過剰産生により疾患を悪化させる悪循環を作り出し、その影響を悪化させる（Yegın er al)。 前述したように、メチレンブルーの還元により、青色の形態が無色の形態に変化する。摂取の8-12時間後には、尿の色が青や緑に変化しているのが観察された。これは、血液中の酸化剤がメチレンブルーの還元型（無色）を酸化型（青色）に酸化していることを示していると考えられる。この化学反応により、酸化ストレスが減少し、炎症性メディエーターが減少していると考えられる。

8　高齢者や複数の疾患を併発している人は、COVID-19による重篤な健康被害を発症するリスクが高いことがエビデンスで示されている。”酸化炎症老化」とは、老化に伴う慢性的な低悪性度の全身性炎症の現象を指する。老化細胞は増殖能力が低下しており、この老化細胞は免疫細胞の活性化とは無関係に慢性炎症を引き起こすプロ炎症性サイトカインの分泌を刺激する。この炎症はまた、酸化的/nitrosative ストレスを誘発する可能性のある活性酸素と RNS のレベルの増加につながる。酸化的／nitrosativeストレスはまた、体内のプロ炎症性経路の活性化につながる可能性があり、多くの加齢関連疾患の発症に寄与している。したがって、加齢に伴う炎症は、（iNOSによる）NOの産生を悪化させ、これは高度に酸化的／nitrosativeストレスを誘導する（Matsushita er al)。

 

最近提案されたプロトコル（Hamidi Alamdari et al 2020）では、メチレンブルー、ビタミンC、N-アセチルシステインを臨床試験で使用した理由を詳しく説明したが、それ以外の理由については以下で説明する。

(1)メチレンブルーは、一酸化窒素合成酵素（NOS）に対して、構成性および誘導性の両方の直接的な阻害作用を有し、酵素グアニル酸シクラーゼを阻害することにより、環状グアノシン一リン酸（cGMP）の蓄積を防止することが文書化されている（Miclescu and Wiklund、 2010）。臨床研究では、NOが敗血症に関連する血行動態変化の潜在的なメディエーターであることが文書化されている。血行動態に対するNOの悪影響は、酵素グアニル酸シクラーゼの阻害を介して、メチレンブルーによって部分的に拮抗することができる（Brown et al 1996）。

(2)メチレンブルーは、通常は遅いNADPH-メトヘモグロビン還元酵素経路の活性を増加させ、メトヘモグロビンを減少させることで低酸素を減少させる。少量のメトヘモグロビンは常に形成されているが、これらの酵素によって赤血球内で還元される。(1) NADH チトクロム-b5 還元酵素、(2) NADPH-メトヘモグロビン還元酵素。メトヘモグロビン血症のFDAの治療法の一つは、メチレンブルー（1-2mg/kgを5-30分かけて静脈内投与）の適用であり、その他の治療法は、アスコルビン酸と還元型グルタチオンである（McPherson、 2017）。

(3)メトヘモグロビン濃度の上昇は、（A）遺伝性または後天性のNADHチトクロム-b5還元酵素活性の低下に伴う二次的なものである;ホモ接合体のNADH-チトクロム-b5還元酵素欠損症では、メトヘモグロビン濃度は10%～50%（シアノティック）である。メトヘモグロビン濃度が10%～25%では明らかな症状はなく、35%～50%では労作性呼吸困難や頭痛などの軽度の症状が現れ、70%を超えるとおそらく致死的であると考えられている。

(4)還元型メチレンブルー（Leucomethylene: 還元型メチレンブルー）は、これらのメカニズムによりCOVID-19患者のメトヘモグロビン血症を減少させることができると仮説を立てた（Wang and Ma、 2008）。(A)迅速な直接効果：メトヘモグロビンを減少させる（我々はケース4で見たように）; (B)酸化ストレスを減少させる。還元剤としての還元型メチレンブルーは活性酸素をクエンチするが、メチレンブルー（酸化型）は他の分子（NADH-H+、NADPH-H+、GSH）から電子（フリーラジカルのようなもの）を吸収して酸化ストレスを誘発し、酵素的なメカニズムでメトヘモグロビンを減少させる（McPherson、 2017）。そのため、酸化ストレスを誘発しない還元型のメチレンブルーを用いた。C）炎症を減少させる。これは、酸化ストレスを減少させ、その逆も同様である。実験および臨床研究では、メチレンブルーが炎症を減少させることも示されている（Shehat and Tigno-Aranjuez、 2019）。

(5)メチレンブルーは、以下のような方法で、細胞毒性効果を阻害し、RNAウイルス（ポリオウイルスなど）の増殖を抑制することができる。(1)ウイルスの付着、浸透、増殖に必要な細胞部位を競合的に占有し得る容易に浸透するメチレンブルーによる機械的効果、(2)酸化とリン酸化のアンカップリングによる酸化ストレスの減少、(3)親油性物質であるメチレンブルーが脂質膜を介してウイルスに侵入し、RNAと結合することによるウイルス性効果(Kovács、 1960)などが考えられる。

(6)抗菌性。メチレンブルーは、抗菌化学療法-特に抗マラリア薬の分野-および神経弛緩薬ファミリーの基礎を形成してきた。局所感染を伴う慢性創傷の管理のための抗菌性発泡ドレッシングに使用されている（Woo and Heil、 2017）。

(7)メチレンブルー は強力な酸素スーパーオキサイドスカベンジャーであり、このイオンを迅速に除去して組織にダメージを与えないようにする。このアニオンは、急性心筋梗塞などの条件で虚血再灌流中に産生される。Wülfert et al 2003）。メチレンブルーのもう一つの抗酸化作用は、ROSの生成を防ぐキサンチンオキシダーゼなどの鉄含有酵素を阻害することである(Miclescu and Wiklund、 2010)。

(8)メチレンブルーは、血小板におけるアラキドン酸代謝を阻害することにより、血小板の活性化、接着、凝集を防止する（Miclescu and Wiklund、 2010）。主な合併症の一つは血栓性イベントであるので、これはCOVID-19患者において非常に重要である(Becker、 2020)。

5. 結論

この臨床試験の予備的な結果は、メチレンブルー、ビタミンC、N-アセチルシステインの混合物を用いた重症COVID-19の治療が安全で実行可能であることを示した。軽減されたメチレンブルーは、急速効果と遅発効果を有する。

急速な効果は、メトヘモグロビンを減少させることにより、SPO2%（全患者が100%酸素に達した）を増加させる。遅効性の効果は、通常は遅いNADPH-メトヘモグロビン還元酵素の促進、CRPやLDHなどの炎症性マーカーの改善、抗菌作用による重症度の低下などである。

還元型メチレンブルー投与の最適な時期は、重症度が非常に高く、多臓器関与・不全に陥る前の段階で投入するべきでことを示唆する。観察結果をより多くの患者で検証し、無作為化多施設臨床試験を実施すれば、COVID-19感染症の死亡率とICU滞在期間の平均値を有意に減少させることができると我々は考える。