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A systematic review of experimental evidence for antiviral effects of ivermectin and an in-silico analysis of ivermectin’s possible mode of action against SARS-CoV-2
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33427370/
2021年1月11日
要約
記事ウイルス感染症は、新規治療薬のアンメット・ニーズが満たされていない経済的損失の主要な原因であり続けている。イベルメクチンは抗ウイルス性化合物であると考えられているが，そのメカニズムは，哺乳類の宿主インポーチンによって促進されるウイルスタンパク質の核内転座を阻害することであり，感染の伝播に必要なプロセスであると考えられている．
SARS-CoV-2を含むウイルス感染症に対するイベルメクチンの有効性，作用機序，選択的毒性などのエビデンスを系統的に検討した。SARS-CoV-2ゲノムを採取し、イベルメクチンの潜在的な核位置シグナルを決定し、生体内試験のメタアナリシスには、時間、用量範囲、および複数の臓器におけるウイルスの複製に関するすべての比較因子を含めた。
イベルメクチンは、フラビウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科を含む多くのウイルスの複製を試験管内試験で阻害した。イベルメクチンの潜在的な標的であるSARS-CoV-2において，実核および模擬核位置シグナルが同定され，インポーチンβの隔離ベイトとなり，感染細胞がウイルス耐性状態に達するのを阻止することが予測された。薬物動態評価では、試験管内試験でイベルメクチンを投与した場合に毒性を示す可能性があることが示されているが、生体内試験では、豚のサーコウイルスやマウスのブタヘルペスウイルスでウイルス複製の阻害が示されている。
イベルメクチン投与群と対照群との全体的な標準化平均値の差、95%信頼区間は以下の通りであった。-4.43（-5.81,-Accepted3.04)P < 0.00001であった。現在の結果から、イベルメクチンを抗ウイルス剤として再利用する可能性は有望である。
しかし、試験管内試験と臨床効果を両立させるためには、さらなる研究が必要である。イベルメクチンの追加抗ウイルス剤としての開発は、有効性が確認された感染モデルを用いた前臨床試験を中心に進めていくべきである。
キーワード
抗ウイルス剤; 核内位置シグナル; イベルメクチン; SARS-CoV-2
序論
イベルメクチン（図 1A）は、ヒトおよび動物におけるさまざまなタイプの寄生虫感染症の治療のために臨床承認されている必須の薬剤である。しかし、最近では、イベルメクチンの抗ウイルス効果や、ウイルス感染症の治療薬として再利用できる可能性が、いくつかの研究で報告されている[1,2,3]。この分野での科学的研究のほとんどは、哺乳類細胞を感染させることによって試験管内試験で行われており、このアプローチを用いて、多くのウイルス感染症に対する有効性が報告されているが、最も顕著なのは、以下のようなエンベロープ型、ポジティブセンス型、一本鎖フラビウイルスに対する効果である。デング熱、西ナイル熱、黄熱病、ジカ[4-8]などの多くのウイルスに対して有効性が報告されている。
イベルメクチンの抗ウイルス作用のメカニズムとして、哺乳類の宿主インポーチン（カリオフェリンα/β-1ヘテロ二量化としても知られている）によるウイルスタンパク質の核内転座の阻害が提案されている[2]。このメカニズムに基づき、イベルメクチンはインポーチンα（アルマジロリピート）ドメインに結合し、熱安定性とαヘリシティの構造変化を引き起こしてインポーチンβ-1への結合を妨げる [5,9]。これは真核生物の細胞に依存するプロセスであり、標的となるカーゴタンパク質の特定の機能に応じて、感染や複製を制限したり、宿主の抗ウイルス応答を増強したりする可能性がある[10]。イベルメクチンによるウイルス複製阻害のこのモードの詳細な説明は、インテグラーゼ酵素を介してヒト免疫不全ウイルス-1（HIV-1)非構造タンパク質5（ウイルスRNA合成のためのポリメラーゼおよび免疫シグナル伝達のための調節因子）を介してデングウイルス、DNAポリメラーゼUL42を介してブタヘルペスウイルス、および非構造タンパク質3（DNAヘリカーゼ酵素）を介して黄熱ウイルス、デングウイルスおよびウエストナイルウイルスについて示されている[4,5,11]。イベルメクチンがインポーチンαを阻害する証拠の最近の詳細なレビューについては、Jans and Wagstaff [2]を参照されたい。
いくつかのウイルスについてのこのような詳細な分子特徴付けにもかかわらず、類似した、または構造的に発散する核位置シグナルおよび対応する標的カーゴタンパク質が、イベルメクチンが有効である可能性のある他のすべてのウイルスに存在し、標的となる可能性があるかどうかは不明である。さらに、イベルメクチンの試験管内試験抗ウイルス効果が哺乳類の感染症に対する臨床応用につながる可能性はまだ明らかにされていない。抗ウイルス剤としてのイベルメクチンの最近のレビュー [2,3] は、薬理学的な考慮事項をよりよく理解する必要性を強調している。
そこで本研究では、イベルメクチンの抗ウイルス効果に関するすべての論文を系統的にレビューし、SARS-CoV-2の検討も含めて、農業および医学への応用を想定したイベルメクチンの質的および量的な抗ウイルス特性について、統合的かつ批判的な評価を行うことを目的とした。
材料および方法
文献検索戦略、研究の包含基準と除外基準
このシステマティックレビューは 2009年システマティックレビューおよびメタアナリシスの優先報告項目（Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses: PRISMA）声明[12]に従って実施された。具体的な目的は、イベルメクチンが感染予防、感染後のウイルス複製、感染誘発死亡率を含む抗ウイルス特性を発揮するかどうかを決定することであった。Medline、PubMed、Science Direct、Web of Scienceを含む主要データベースを、開始日から 2020年8月まで検索した。我々の戦略は、ウイルスに対するイベルメクチンの実験的または臨床的使用に関するすべての発表論文を捕捉し、分析することであった。具体的な検索語句は、キーワード検索と同様に、医学的主題の見出しにある(“Ivermectin”) AND (Virus OR Viral Infection)とした。英語の出版物のみを検討し、タイトルと要旨をスクリーニングして参考文献リストを作成した。また、含まれている研究については、含まれている基準に適合する追加の参考文献を調査した。イベルメクチンの抗ウイルス効果を検討したすべての対照一次研究は、ウイルスの種類や株、使用した試験管内試験培養系や感染モデル、イベルメクチンの投与量や投与経路に関係なく照合された。
データの抽出と品質評価
詳細な分析とデータ抽出が必要な研究は、両著者（RTKとLO）によって評価され、適格性が確認された。生データの一部が13]から直接取得された1件の研究を除き、すべてのデータは公表された研究のテキスト、表、図から抽出された。抽出された情報には、ウイルスの種類と株、試験管内試験培養に使用する細胞の種類、動物の数と年齢、感染条件、および観察されたイベルメクチンの質的および量的効果が含まれている。哺乳類におけるイベルメクチンの抗ウイルス効果を試験した個々の研究の質的評価は、SYRCLEの動物試験の偏りのリスクに基づく基準によって行われた[14]。これらの評価には、使用した動物の性と年齢、サンプルサイズの評価と正当化、実験群の生成と治療法の割り付けにおける無作為化、実験結果の評価における盲検化、関連する福祉規制と倫理の遵守、および利益相反の引用が含まれる。本稿執筆時点では、SARS-CoV-2に対するイベルメクチンの試験管内試験効果に関する査読付き論文[28]は1件のみであるため、本レビューには試験管内試験と生体内試験が含まれており、（生体内試験のサブセットとしての）査読付きヒト臨床試験は存在しない。
イベルメクチンの標的としてのウイルスゲノム中の核位置シグナルの同定
多くのウイルスのゲノムが核にアクセスする必要があるのと同様に、多くのウイルスタンパク質も核に入る必要がある。核内へのタンパク質のアクセスは、核内孔複合体（NPC）の「ロック」を介して行われ、核局在化シグナル（NLS）と呼ばれる塩基性アミノ酸（aa）の配列によって「ロックが解除される。これらのNLSは、ほとんどの場合、塩基性アミノ酸リジン（Lys）とアルギニン（Arg）[15]の配列の伸張であり、らせんを破る中性アミノ酸であるプロリン（Pro)グルタミン（Gln）またはグリシン（Gly）に先行することができ、一般的には負に帯電したアスパラギン酸（Asp）またはグルタミン酸（Glu）が先行することがある。NLSは、少なくとも4つの塩基性で酸性でも嵩高いアミノ酸でもないヘキサペプチドとしてのモノパルタイト（表I）（例えば、SV-40 T-抗原）であることができ[16]、らせんを破る残基（Pro、Gln、またはGly）[17]。NLSはまた、少なくとも9aa（例：DNAヘリカーゼQ1）または非古典的（例：Pro-Tyr）で区切られた塩基性アミノ酸の2つのグループを持つ二部作であることができる。これらの塩基性アミノ酸の伸張は、次に、核孔複合体を介して核内へのタンパク質の輸送のために、βインポーチンまたはα-βヘテロ二量体複合体インポーチンに直接結合する。
NCBI Entressウイルス型ゲノムをデフォルト配列として採った。Zhouら[18]と同様に、ウイルスのオープンリーディングフレーム内の塩基性アミノ酸の伸長領域（表I）の検索を手動で行い、モチーフを以前に記載されたものと比較した[15]。ArgのLysへの置換およびその逆の置換は、機能性を損なうことなく交換可能であると考えた。Ala、Met、Val、Lue、Phe、Tyr、Ile、Trpのようなかさばる疎水性の任意のaaに”＆”を使用した。”X “は任意のアミノ酸に使用した。
データ解析
試験管内での細胞培養試験から抽出したデータをまとめ、以下の結果の項で定性的に示した。定量的には，イベルメクチンの選択性指数は，ウイルス活性を50%阻害するイベルメクチン濃度（EC50）と，利用した哺乳類細胞の50%に細胞毒性を引き起こす濃度（CC50）の比を求めることで評価した。多細胞生物におけるイベルメクチンの抗ウイルス効果に関する研究を節足動物と哺乳類宿主を含む2つの合理的なグループに層別化した。抽出したデータをメタアナリシスにプールし，RevMan 5.3 ソフトウェアを用いて，ウイルス感染，複製，ウイルス感染誘発死亡率に対するイベルメクチンの全体的な効果の大きさを決定した。利用した感染モデル，検討したウイルスの種類，イベルメクチンの投与量，投与量，治療期間に顕著な違いがあったため，データ解析は RevMan 5.3 のランダム効果モデルに基づいて行われた。データは標準化された平均値と95%信頼区間で示され、P値<0.05は有意であると考えられた。全体の標準化平均差に対する各研究の感度と効果は、メタアナリシスで一般的に使用されるleave one outアプローチによって決定された。抽出されたデータの不均一性の程度は、50%以上の値を有意とみなしたI2値から評価した。
結果
試験管内試験に基づくイベルメクチンの抗ウイルス効果の質的・量的検討
試験管内試験 試験に基づくイベルメクチンの質的及び量的な抗ウイルス効果 データベース検索から 1139 件の研究が同定され、そのうち 92 件は重複した記録であったため、さらなる解析から削除された（図 1B）。残りの 1047 件の研究のタイトルと要旨は、確立された包含基準に照らし合わせてスクリーニングされ、さらに 1017 件が削除された。30件の研究が包含基準を満たしていたが、1件のアブストラクトについてはデータにアクセスできず、学会発表として報告されており、4件の研究は一次データのないレビューであった。したがって、合計25件の研究が質的および量的分析の対象となった（表IIおよびIII）。イベルメクチンは，以下のようないくつかの科を代表する多くのウイルスに対して，時間と濃度に依存して感染と複製，およびプラーク形成を阻害することが，細胞培養物を用いた試験管内試験で示された。Arteriviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Herpesviridae, Paramyxoviridae, Polyomaviridae, Retroviridade and Togaviridae. しかし、2つの研究では、15〜25μMの高濃度では、イベルメクチンは複製を阻害するが、PAM-pCD163マクロファージにおけるBetaarterivirus感染後の細胞接着およびエントリーを特異的に阻害しなかったことが示されている[19]、およびMDBK細胞におけるウシのh-rpesvirus 1の感染[20]。イベルメクチンは、U87MGおよびVero細胞におけるベネズエラ馬脳炎ウイルスの感染および複製、ならびに一次神経細胞における馬ヘルペスウイルス1の感染および複製に影響を及ぼさなかった（表II）。ここに報告されている試験管内試験に使用される手順のアプローチおよびシステムに顕著な違いがあるため、我々は抗ウイルス剤としてのイベルメクチンの相対的な効力と安全性のマージンを評価することを求めた。その結果、イベルメクチンは、以下のような多くのウイルス種に対して広い試験管内試験安全性マージンを有していた。チクングニヤ、デング熱、ジカ、黄熱、ブタヘルペスウイルス1,ウエストナイルウイルスの昆人株を含む多くのウイルス種に対して、イベルメクチンは広い試験管内試験安全性マージンを有していた（図2）。対照的に、ポリオマウイルス、Betaarterivirus、ウシヘルペスウイルス1,ニューカッスル病ウイルスおよびウエストナイルウイルスのNY99株に対するEC50値は、哺乳類細胞に対する細胞毒性の範囲内に収まっていた（表IIおよび図2）。黄熱病ウイルスのEC50値は最も低かったが（0.5-5 nM)比較的高いEC50値（0.4-25 μM）が他のウイルスで見られた。哺乳類細胞を利用した場合のイベルメクチンのCC50値は以下の通りであった。Vero細胞では5.8±1.1μM，Huh細胞では8.4±0.8μM，BHK細胞では13.6±8.3μMであった（図2）。
動物を用いた生体内試験に基づくイベルメクチンの定性及び定量的な抗ウイルス効果
動物において、イベルメクチンの抗ウイルス効果は、蚊、噛みつきミッドジ、ザリガニなどの異なる節足動物の感染モデル、およびマウスやブタなどの哺乳類宿主において検討されてきた（表 III）。イベルメクチンは節足動物に影響を与えないナノモルからマイクロモルの幅広い濃度で，des albopictus [21] のデングウイルス，Culicoides sonorensis [13] のブルートンウイルス，およびザリガニのパルボウイルス [22] の感染および／または複製を有意に抑制した。しかし，イベルメクチンはAedes aegyptiのジカウイルス[23]，Culex tarsalisのウエストナイルウイルス[24]，Culicoides sonorensisのエピゾート性出血性疾患ウイルスの感染および散布には効果がなかった（図3）。哺乳類宿主において、イベルメクチン 0.2 mg/kg を 2～6 日間投与すると、子豚では 21 日間にわたり、脳、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、リンパ節などの内臓臓器におけるポルシン・サーコウイルスの複製が抑制された[25]。0.2 mg/kg のイベルメクチン単回投与では感染は防げなかったが、マウスでは脳や腎臓での Suid ヘルペスウイルスの複製を抑制し、感染後 7 日目の死亡率を抑制した[11]。ある研究では、イベルメクチン4mg/kgを感染前2日間、感染後1日目、2日目、4日目に投与しても、マウスのジカウイルスによる感染や死亡率は予防されなかったと報告されている[26]。ここで検討したすべての動物実験で有意な不均一性があった（I2 = 98%; P < 0.00001; 図3）。これらのデータは、個々の研究の精査と適格性の確認を必要とするが、プールされたメタアナリシスは、上記で概説されたイベルメクチンの抗ウイルス効果が統計的に有意であることを示した。イベルメクチンと対照群の標準化平均差および95%信頼区間は以下の通りであった。節足動物では-3.95（-5.60,-2.30)（Z=4.69;P < 0.00001;図3)哺乳類では-5.71（-8.91,-2.51)（Z=3.50;P < 0.0005;図3）であった。
研究したウイルスのゲノムにおける核位置シグナルの同定
イベルメクチンの作用機序は、核細孔複合体を通って核内へのウイルスタンパク質の移行を助けるインポーチンαの作用を阻害していることが示されたため、ウイルスタンパク質の移行に必要な核内ロケーションシグナル（NLS）の役割が検討された。細胞培養物中のウイルスに対するイベルメクチンの研究のうち、16.6%はDNAゲノムを持つウイルスであったが、残りは驚くべきことにRNAウイルス（84.4%）で、フラビウイルス科（59%)特にデングウイルス（表II）に支配されていた。Pryorら[27]はデングウイルスの複数のNLS、特にタンパク質N5を実証し、Wagstaffら[5]はイベルメクチンがデングウイルスの複製を明確にブロックできることを示したので、これは驚くべきことではなかったかもしれない。デングウイルス2のタンパク質を分析したところ、10種類の主要なタンパク質のうち4種類が核内への移行を可能にするNLSを持っていることがわかった（表IV）。このことは、我々の解析ではフラビウイルスが優勢であることを説明しているのかもしれない。 Calyら[28]の結果は、SARS-CoV-2に対するイベルメクチンの限界的な選択性を示した（図2）。このことから、SARS-CoV-2のタンパク質にはNLSが存在し、同様のメカニズムが働いているのではないかという仮説を立てた。Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus（SARS-CoV-1）のオープンリーディングフレーム6（ORF6）（NCBIエントリーではORF7）を徹底的に調査したところ、その3’モックNLSはインポーチンβの隔離ベイトであり、5’末端は小胞体/ゴルジ体の膜に膜貫通で固定されていることが明らかになった[29]。これは、インポーチンβの隔離につながり、STAT1シグナル伝達機能を調節し、インターフェロン調節因子（IRF）遺伝子を介してインターフェロンγを産生する細胞を阻止した。これにより、細胞がウイルス耐性状態になるのを防ぐことができる。SARS-CoV-2のORF6は、61個のアミノ酸（aa）のうち42個についてはSARSと同一であり、61個のaaのうちさらに12個については類似（機能的、非相同置換）している（図4）。3’末端で疎水性のAlaを置換することにより、Friemanら[29]は、重要なモチーフはaa(49-53)であるが、aa(54-58)やaa(59-63)ではないことを実証した。この領域を検討すると、Lys+Lys46から型破りなTyr+Pro63モチーフにまたがる二部作のNLSが存在する可能性があることがわかる（「材料と方法」を参照）。実験的な5つのAlaの疎水性系列は、主要な塩基性デュオであるLys-Lysのすぐ後ろにあり、したがって、この領域での結合と機能性を混乱させる[29]。SARS-CoV-2領域は、9/16 aaではSARSと同一であり、5/9 aaでは類似しており、インポーチンβに対するほぼ同様のベイト/モックNLS活性を予測する（図4,表IV）。異常な点は、SARS-CoV-2 ORFが2 aa短く、末端のTyr-Proが欠落していることである。NCBI GenbankのすべてのSARS-CoV-2 ORF6配列のチェック（2020年8月）は、これが本物であり、株のアーティファクトではなく、配列決定の誤りでもないことを示している。しかしながら、いくつかの要因は、これが全くNLSとして作用しているのではなく、Arg/Lys38以降の正電荷テール（エサの隔離）を持つ模擬NLSとして作用し、インポーチンティングβを捕捉し、効果的にダウンレギュレーションしていることを示唆している。
自然免疫を回避するコロナウイルスにおけるこの短いタンパク質の明らかに重要な役割は、SARS-CoV-2の検査のためにスワブをした後、鼻腔内スプレーを介してリポソーム中に送達された小型干渉RNA（siRNA）分解の主要な標的となることにつながるだろう（La Fauce and Owensのレビューを参照）[30]。Formigaら[3]は、マイクロおよびナノプスのための他の可能な送達システムについて概説している。より長持ちする治療法が必要な場合は、プラスミド中に送達された短いヘアピンRNA（shRNA）で代用することができる[30]。実際、Shiら[31]は、Vero細胞でSARS-CoVの構造タンパク質に対してsiRNAが70%の減少で有効であることを示している。siDirect version 2.0 [32]を使用してsiRNAを標的化するためのORF6配列を簡単に解析したところ、Friemanら[29]によって活性に重要であると同定された領域の3’ベイト/モックNLSシグナルを切断して分解する136bpから 158bpの位置にあるものを含む複数の候補が同定された。
SARS-CoV-2の制御に向けたコロナウイルスに対する抗ウイルス剤に関する最近のレビュー論文では、ORF6を標的とした薬剤は確認されていない[33]ので、上記の情報を考慮すると、これは抗ウイルス剤のための有益な標的である可能性があることを示唆している。ORF1abでは、7つの潜在的なNLSが同定された（表IV）。興味深いことに、3952(Lys-Lys-21aa-Lys-Lys-Cys-Lys)にある二部構造のものを除くすべての742個のNLSは、おそらくNLSとして動作するのを妨げるであろう、チェルスキーシグナルの中に破壊的なバルキーまたは疎水性aaを持っている。それは、進化の圧力がこれらのNLSを沈黙させたかのように見えるので、ウイルスタンパク質は核内に隔離されていない。一方、3952NLSが機能しない論理的な理由は見当たらないので、翻訳されて切断されたタンパク質であるnsp8は、インポーチンαによって時々核内に移動することになる。 したがって、イベルメクチンは、nsp8の核内への移動を遅らせる役割を持っているはずである。しかし、nsp8の役割は、ウイルス複製に必要な高度に保存されたウイルスRNA依存性RNAaseポリメラーゼ[34]であるnsp12へのコファクターとして、nsp7と一緒に作用することである。Nsp8はいくつかのDNAおよびRNA結合残基を持っており[34]、細胞内のDNAの主要な供給源である核内のDNAとの未検出の役割を示唆している可能性がある。この役割は、ウイルス複製のためのヌクレオチドを採掘することではないかと推測されている。
ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子N（表IV）は、基本的なaa（aa以降）の広い領域を持っており、その中には多くの強力な潜在的なNLSが存在している。しかしながら、無傷のNタンパク質の共焦点顕微鏡を用いて、我々自身およびRowlandら[35]によって発見された同じまたは類似のNLSが同定されたにもかかわらず、SARS-CoV-1コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質が核内または核葉内で発見されたという証拠はなかった。一方、Timaniら[36]は、実験的にSARS-CoV-1のNタンパク質の断片を共焦点顕微鏡で観察し、これらの断片が核や核葉に蓄積していることを示し、機能的なNLSを示唆している。Wolffらによる電子顕微鏡を用いた素晴らしい論文[37]では、ヌクレオカプシドタンパク質は細胞質に存在し、二重膜を持つウイルス複製オルガネラからウイルスRNAを取り込んでいる。すべてをまとめると、正に帯電した模擬NLSがウイルスRNAの負に帯電したリン酸塩バックボーンを捕捉し、コートして、細胞質でのウイルスの形成を開始する可能性が高いと考えられる。したがって、無傷のNタンパク質[35]中のこれらのモックNLSは、それらがすぐにサイトゾル中のウイルスRNAによって隔離されているので、NLSとして機能する機会を持っていない。
考察
本研究では，イベルメクチンの定性および定量的な抗ウイルス特性を批判的に評価し，統合的なレビューを行った。試験管内試験では，確立されたEC50値に基づくイベルメクチンに対する感受性は，ウイルス株に依存する場合があるように思われた（表Iおよび図2）．例えば，ウエストナイルウイルスのKunjin株はNY99株よりも感受性が高く，ウイルス複製のEC50値に5倍の差があった。同様に、異なる哺乳類細胞における相対的な効力と安全性の評価では、イベルメクチンはウイルスに対して選択的な抗ウイルス活性を示さないことが明らかになった。Betaarterivirus、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、馬ヘルペスウイルス1および牛ヘルペスウイルス1に対しては、イベルメクチンは選択的な抗ウイルス活性を示さなかった。これらの種や株のイベルメクチンに対する感受性の違いには明確な理由や明らかな理由はないが、これはイベルメクチンの分子標的の特異的な違いに少なくとも部分的に起因している可能性がある。
もう一つの重要な考慮点は、イベルメクチンの効力、相対的選択性、毒性である。我々が行った試験管内試験の評価では、Vero, Huh, BHK細胞を用いたex vivo哺乳類細胞感染モデルにおいて、イベルメクチンはいくつかのウイルスに対して選択性を示すことが示された。しかし、ほとんどのウイルスで50%の複製を阻害するために必要なマイクロモル濃度範囲は、懸念の原因となる可能性がある。イベルメクチンの臨床的に承認された製剤は、経口、皮下、筋肉内、または局所に投与することができ、推奨投与量は、種および製剤、および適応される臨床用途に応じて、ヒトでは150～200μg/kg、動物では6～500μg/kgの範囲である。この用量範囲では、薬物動態学的特性解析により、到達可能なピーク血漿中濃度は用量とともに増加し、イヌでは3～48 ng/mL、ウマでは21～82 ng/mL、ブタでは7～40 ng/mL、ヒツジでは9～60 ng/mL、ウシでは12～133 ng/mL、ヒトでは20～81 ng/mLの範囲になることが示されている[38～40]。健康なヒトを対象としたイベルメクチンの増量投与の安全性及び忍容性に関する研究では、臨床的に推奨される用量（200μg/kg）の10倍の単回投与量（120mg）は忍容性が高く、248 ng/mLに相当するピーク血漿中濃度と19時間の排泄半減期が得られたことが示されている[41]。同様に、母集団ベースの薬物動態モデルにより、イベルメクチンを600μg/kgで3日間経口投与した場合、最大血漿中濃度中央値は105～119 ng/mL（0.12～0.14 μM)排泄半減期は3～5時間であることが明らかになった[42]。これらのデータは、極めて高用量のイベルメクチンを使用しても、到達可能なピーク血漿中濃度は、ほとんどのウイルスの試験管内試験で確立された EC50 濃度よりも著しく低いままであることを示しているが、駆虫活性に最適な 0.5-1 ng/mL よりは有意に高い。極端に高用量のイベルメクチンを使用すると、ウイルス感染症ではしばしば見られるように、ポリファーマシーを必要とする患者において有害な薬物間相互作用が生じる可能性が高くなると考えられる[2, 43]。したがって、試験管内試験で不死化した新生物細胞株を利用することで、イベルメクチンの選択性を効果的に決定し、生体内試験でのウイルス感染症に対する潜在的な臨床効果を表すことができるかどうかは不明である。したがって、イベルメクチンを抗ウイルス剤として再利用する場合には、試験管内試験実験に基づいて確立された抗ウイルス特性を、生体内試験の動物感染モデルで検証済みのものを用いて批判的に評価する必要がある。我々は、限られた数の研究で、多細胞生物におけるイベルメクチンの抗ウイルス効果を検討したことを示す。ほとんどの試験は節足動物の感染モデルで行われており、哺乳類を対象とした実験研究は 3 件のみであり、ClinicalTrials.gov に掲載されている SARS-Cov-2 [2] およびデングウイルスに対するヒト試験はいくつか登録されているが、まだ結論は出ていない。プールされたメタアナリシスでは全体的に有意な抗ウイルス効果が示されていることから、総合的な有効性データは有望である（表IIおよび図3）。しかし、これらのデータを解釈する際には注意が必要である。どのウイルス種や動物種を対象とすべきか、最適な投与レジメンは何か、どのようなコストや便益が生じるのかなど、より広範な疑問に依存するからである。これらすべての疑問はともかくとして、いくつかの個別の研究のメリットと応用の可能性は注目に値する。例えば、既存の鰓パルボウイルスを持つ Cherax quadricarinatus ザリガニを対象とした研究では、非毒性で忍容性の高いイベルメクチンの筋肉内投与量（3～7 µg/kg）により、この感染症に伴う病変が有意に減少した [22]。このウイルス感染は、養殖エビなどの養殖甲殻類における経済的損失の重要な原因であるため、この選択的抗ウイルス活性は、感染を制御するための追加のツールを提供する可能性がある。特にエビやザリガニを対象とした適用試験では、商業的に実行可能で、大規模投与に適しており、国民の懸念を最小限に抑えたイベルメクチンの剤形と投与レジメンを検討する必要があると考えられる。
もう一つの有望な展望は、節足動物のベクター内でのアルボウイルスの感染、複製、感染を標的としたイベルメクチンの応用である。イベルメクチンのナノモル濃度は節足動物媒介性ではないが、Culicoides sonorensis のブルートンウイルス、Aedes albopictus 蚊のデングウイルスの感染と伝播を有意に減少させたことが示されている（表 III、図 3）。対照的に、イベルメクチンで処理した血液を給餌する同様の方法では、ナノモル濃度のイベルメクチンは、Culex tarsalis、Aedes aegyptiおよびCulicoides sonorensisに対しては飛蚊性を示したが、それぞれウェストナイルウイルス、ZikaウイルスおよびEpizootic haemorrhagic diseaseウイルスのベクター内感染率および複製には有意な影響を及ぼさなかった（表III）。イベルメクチンは、農業分野では家畜のダニ、ダニ、ハエ、シラミの防除、ヒトおよびコンパニオンアニマルの疥癬およびフィラリア症の防除の効能・効果がすでに承認されている。ヒトでは、フィラリア感染症の治療に使用されるイベルメフスチンの推奨用量（150 mg/kg）の血漿中濃度は、アノフェレス蚊の生存とマラリアの感染を有意に減少させることが確認されている。節足動物におけるイベルメクチンの抗ウイルス効果が実証されていることを考えると、臨床的に承認された用量のイベルメクチンをヒトや家畜に投与することで、節足動物のベクターの数を減らし、感染率を低下させるとともに、感受性が実証されているブルートンゲウイルスのようなアルボウイルスの感染率を低下させることも、並行して行われる可能性がある。興味深いことに、イベルメクチンをヒトに単回投与した後の血漿中ピーク濃度（40～45 ng/mL）は、アデス・アルボピクタスのデングウイルスの複製を減少させるのに有効な濃度範囲（16～64 ng/mL）とほぼ一致している[21]。哺乳類の病気を制御するためのこの特定の用途には可能性があるが、アルボウイルスや関連する病気を制御するための戦略的ツールとしてイベルメクチンを使用することは、健康、社会的、経済的な直接的な利益を批判的に評価してからでないと効果的ではない。このような詳細な疫学的・経済的評価は今回のレビューの範囲を超えているが、アルボウイルスに関連した経済的損失が大きいことを考えると必要である。ブルートンゲウイルスの感染による乳量の減少、体調不良、獣医学的治療や診断、死亡率の低下に起因する世界の家畜の年間経済損失は、30 億米ドルと推定されている[47]。ヒトでは、年間5,840万人の症候性デングウイルス感染があると推定され、年間90億米ドルの世界的コストがかかっている[48]。 脊椎動物、哺乳類のウイルス感染モデルでは、抗ウイルス剤としてのイベルメクチンの効果が検証され、現在までに3件の査読付き研究で報告されているのみである[11,25,26]。これら3つの研究から得られたデータをまとめてみると、強い一般的な抗ウイルス効果が示されているが、個々の研究から得られた結果は、これまでのところ明らかではない。5週齢のIfnar1//-マウスを用いたセネガル型ジカウイルス感染1日前と感染後3日間の高用量（4mg/kg）では、イベルメクチンは感染を抑制せず、死亡も防いでいない[26]。薬物動態学的評価と、試験管内試験でジカウイルスに対して有効であったマイクロモル濃度と一致するように、イベルメクチンの投与量をはるかに多くする必要があることに基づいて、この結果は驚くべきことではなく、実験動物を用いたジカウイルスに対する前臨床試験のフォローアップ試験の妨げになるように思われる。しかし、この特定の研究にはいくつかの制限があり、個々の研究の質的評価では低いランクになっていることは注目に値する。この試験は、ホモ接合型インターフェロン アルファ/ベータ受容体サブユニット遺伝子ノックアウトを持つ比較的若いマウスを用いて行われた（序論
を参照）。本来、これらのマウスはウイルス感染に対して非常に感受性が高く、これがイベルメクチンを投与したにもかかわらず、試験されたマウスの数が少ない場合の顕著な死亡率の一因となっている可能性がある。さらに、この研究では、イベルメクチン投与に対する組織ウイルス負荷を評価しておらず、死亡率がジカウイルスの感染によるものであることを確認していない。これらの議論は、異なるウイルスと感染モデルの動物を用いた2つの生体内試験の結果を比較することで、少なくとも部分的には裏付けられているように思われる。6-8週齢のBALB/cマウスと30日齢の子豚において、イベルメクチン（0.2 mg/kg）は、それぞれSuidヘルペスウイルスとPorcine circovirusに感染した後の内臓臓器における複製とウイルスDNAコピーの有意な減少を引き起こした[11,25]。興味深いことに、これらのデータは、PK-15 細胞ではマイクロモル濃度のイベルメクチンが、BHK-21 細胞ではスイドヘルペスウイルスのウイルス複製を阻害した試験管内試験の結果と一致しない。このことは、ある種のウイルス感染症では、現在推奨されている治療用量でのイベルメクチンは、たとえ試験管内試験での有効濃度が相当に達成できなくても、毒性を引き起こさずに生体内試験で有効性を発揮する可能性があることを示唆している。この議論は以前にも行われており[6,8]、提案されている抗ウイルス機構は、細胞内輸送に重要な哺乳類細胞タンパク質を標的としているため、もっともらしいと思われる。これらの重要な機能は、ウイルスによってハイジャックされ、ウイルスの複製を促進する。イベルメクチンが哺乳類の宿主誘導型抗ウイルス剤として機能する可能性があるという事実は、低用量でわずかな量でもウイルス負荷を低減することが、ウイルス感染症との戦いにおいて免疫系を強化する上で補完的な役割を果たす可能性があることを示唆している[49]。実際、イベルメクチンの免疫刺激効果は文書化されており[50],0.2mg/kgの投与では羊の赤血球に対する抗体産生が有意に増加し、CD-1マウスのCD-1系統ではヘルパーTリンパ球およびマクロファージ依存性の反応も増加した。これらの観察結果から、広汎な抗ウイルス剤としてのイベルメクチンの高用量投与による包括的な毒性学的再評価の必要性は否定されるかもしれないが、これらの効果を確認するためには慎重に設計された前臨床試験及び臨床試験が必要であると考えられる。
コロナウイルスについては、インポーチンαのNLSを阻害することでイベルメクチンの作用機序が考えられるが、効率的に機能するNLSは、他のウイルス機能のために急速に隔離されていない共因子タンパク質であるnsp8に1つしか見出されていない。SARS-CoV-2の3つのタンパク質は、明らかなNLSを持っていたか、または模擬NLSを持っていた。論理的には、これらのタンパク質のほとんどは、核外の他の機能のために迅速に利用され、核内へのリークは、本質的な役割を持っていない、核外での共同因子の役割を持っているだけで、おそらくnsp8を除いて、わずかな核内へのリークが発生するだろう。イベルメクチンの適用は、現時点では十分に理解されていない臨床効果を持つべきであるようである。興味深いのは、SARS様コロナウイルスの本質的に乱れたタンパク質領域を計算機的アプローチで調べたGiriらの論文[34]である。彼らは、完全に独立して、全く異なる方法を用いて、高い本質的障害を持つタンパク質として、ヌクレオカプシドN、nsp8,ORF6のみを同定した。我々はレビューを行う際にこの論文を知ることができなかったので、同じタンパク質が全く独立した科学的アプローチと異なる目的で同定されていることに違和感を覚える。この興味深い偶然の一致は、さらなる精査が必要である。
結論
本レビューでは、イベルメクチン（寄生虫感染症治療薬として臨床的に承認されている）を幅広い抗ウイルス薬として再利用する可能性について批判的な評価を行っている。
分子生物学的研究では、哺乳類の宿主プロセスによって促進されるウイルスタンパク質の核内転座の阻害が主な標的であることが確認されている。また、ウイルス感染に対する免疫反応の刺激など、他のオフターゲット効果も考えられるが、直接の研究は行われていない。この分野における現在の知見の大部分は、細胞培養物を感染させることによって行われた試験管内試験研究に由来している。
イベルメクチンの抗ウイルス効果の生体内試験動物感染モデルでの試験は非常に限られているが、利用可能なデータは有望であり、これは特にアルボウイルス感染症に当てはまる可能性がある。
ウイルス感染症が医療や農業における経済的損失の主な原因の一つであることを考えると、イベルメクチンを追加の抗ウイルス剤として開発する可能性は、有効な感染モデルを用いた前臨床試験に重点を置いて追求されるべきである。
しかし、コロナウイルスによるインポーチンβへの攻撃を考えると、インポーチンαをさらにブロックするためにイベルメクチンを使用することは、イベルメクチンの更なる薬理学的研究なしには、臨床の場での優先順位の高い治療法としては逆行しているように思われる。
それにもかかわらず、イベルメクチンによって阻害されるであろう切断されたタンパク質NSP8をコードするORF1abには機能的なNLS（核局在化シグナル）が存在するようであり、これは優先順位の高い治療法としてさらに検討されるべきである。