A Genome Epidemiological Study of SARS-CoV-2 Introduction into Japan

msphere.asm.org/content/5/6/e00786-20

概要

2020年1月15日に日本でコロナウイルス感染症2019（COVID-19）の最初の症例が発生した後、2月末までに複数の全国的なCOVID-19クラスターが確認された。日本政府は、積極的な全国疫学的サーベイランスを実施することで、出現したCOVID-19クラスターの緩和に注力した。しかし 2020年4月上旬まで症例数の増加が続き、その多くは感染経路が不明で最近の海外渡航歴がないものであった。

我々は 2020年4月上旬までに出現したCOVID-19症例から重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のゲノム配列を評価し、その系譜ネットワークを明らかにすることで、日本国内での感染経路の可能性を示すことを目的とした。患者から鼻咽頭検体を採取し、SARS-CoV-2の逆転写定量PCR検査を行った。陽性のRNAサンプルは全ゲノムシークエンシングを行い、ハプロタイプネットワーク解析を行った。

日本で2020年1月から2月にかけて確認された一次クラスターの一部は、中国から分離された武漢-胡-1関連株やその他の別個のクラスターから直接降下したものであった。クラスターは3月中旬までほぼ収束していた;ハプロタイプネットワーク解析により、3月下旬から4月上旬にかけてのCOVID-19症例は、ヨーロッパでの発生に関連した追加の大規模なクラスターを形成し、日本国内でのさらなる拡散につながった可能性が示された。以上のことから、ゲノムサーベイランスの結果、中国やその他の国から日本にSARS-CoV-2が少なくとも2つ導入された可能性が示唆された。

重要性

本研究の目的は、COVID-19例の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のゲノム配列を評価し、その系譜ネットワークを明らかにすることで、日本での感染経路を明らかにすることであった。その結果、日本へのSARS-CoV-2の導入は少なくとも2つあり、最初は中国から、その後ヨーロッパを含む他の国から導入されたことが明らかになった。本研究の結果は、SARS-CoV-2がどのようにして日本に侵入したのかを理解するのに役立ち、アジアにおけるSARS-CoV-2に関する知識の向上と、実施されている留守番・避難所・自粛・閉鎖措置との関連性に貢献するものと考えられる。本研究は、潜在的な感染の関連性を明らかにし、日本における COVID-19 の次の波を軽減するためには、疫学的な現地調査を支援するためのリアルタイムゲノムサーベイランスを用いて、より効率的な封じ込め戦略を策定する必要があることを示唆している。

はじめに

2019年12月下旬に中国・武漢で発生したコロナウイルス疾患2019（COVID-19）の初期発生。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）として知られるベータコロナウイルス属の新株によって引き起こされた（1-3）。2020年1月15日に日本で最初のCOVID-19患者が確認された後、2月末までに全国で複数の局所的なCOVID-19クラスターが確認された。日本政府は、新たに出現したCOVID-19クラスターがさらに拡大する前に、その特定と緩和に注力した。これらのクラスターを封じ込め、新たな患者数を制限するために、既存のCOVID-19患者の密接な接触者を特定するために、各クラスターの全国的な疫学的サーベイランスが積極的に行われた。わが国では，COVID-19の発生クラスターを中心に，緩やかな感染拡大を維持してきたが，4月上旬までCOVID-19の患者数は増加の一途をたどっており，すべての感染経路を特定することは困難であった。

COVID-19発生クラスターの一部は食い止めに成功したものの、症例数は増加の一途をたどってた。2020年4月16日、日本政府は感染拡大の深刻化に鑑み、全国的な非常事態を宣言した。継続的な疫学的サーベイランスを支援するために、私たちは日本国内の保健所と協力し（の表S1参照)SARS-CoV-2の全ゲノムシークエンシングを実施した。私たちの目的は、ゲノム疫学を応用して、クラスター内またはクラスター間の潜在的な感染経路を予測することであった。これまでに、全国的および世界的な比較ゲノムサーベイランスを用いてCOVID-19の感染拡大を実証するために複数の研究が行われてきた;2020年6月2日時点で、すでに33,483件の完全ゲノムがGlobal Initiative on Sharing All Influenza Data（GISAID）プラットフォーム上で公開されている（4）。米国(https://covidgenomics.org/)、英国(https://www.cogconsortium.uk/)、ハンガリー(5)、オーストラリア(6)、デンマーク(7)、アイスランド(8)、カリフォルニア(9)で観察された地域特異的なクラスターや国内外への広がりを強調した詳細な報告もある。

表 S1

原文参照

本研究では 2020年4月上旬までに確認されたCOVID-19症例のウイルスゲノム配列を評価し、その系譜ネットワークを特徴づけることで、日本での伝播経路の可能性を示すことを目的とした。

結果と考察

SARS-CoV-2のほぼ完全長のゲノム配列（≧29kb、23,694項目）をGISAID EpiCoVデータベースから検索した（2020年4月16日までに収集 2020年10月4日までに提出）(4)。2020年4月6日までに収集された日本国内の臨床検体435例を用いて全ゲノム配列を決定した後、ゲノムワイド一塩基変異（SNV）を用いて系統解析を行い、潜在的な感染経路を追跡した（図1）。2020年1月15日に日本で最初のCOVID-19症例が確認された後、複数の局所的なCOVID-19クラスターが観察された。日本分離株のゲノム配列は、2月下旬からの中国分離株の系統図に基づいて割り付けられたが、SARS-CoV-2（10）の最尤（ML）系統図と動的系統命名法に基づいて、全国的な伝播がすでに存在しているように思われた（図1）。

図1　SARS-CoV-2ゲノム配列を用いた系統分類

A）PANGOLINプログラム（12）によるゲノム系統分類。日本人分離株を含む24,129株（n = 435）から144系統の系統が検出され、上位50系統の系統をバブルチャートで可視化した。赤丸と青丸は、それぞれ本研究の日本人分離株と他国から報告されているGISAIDデータベースで利用可能な配列を示している。円の大きさは検出された分離株数を示す。x軸は2019年12月19日から 2020年4月17日までの時間スケールを示す。B）FastTree-2とWuhan-Hu-1（GISAID accession no. EPI_ISL_402125）をアウトグループ参照として用いて最尤系統樹を構築したが、これは木の発根のための放射状樹の中心点に位置している。地理情報およびサンプル情報は、系統樹の外側スロット上のカラースキームで示されている。

SARS-CoV-2の系統解析では、当初は日本で最も一般的な亜種としてBおよびAクラッドが追跡されていたが、最近になってB.1.1クラッドが日本で最も活発なウイルス系統の一つとして同定されたことが示唆された（図1A）。また、ML系統樹では少なくとも4～5つの主要なクラスターが観察されているが（図1B)これは国籍、武漢帰国者であること、渡航歴などの患者情報を用いた現地保健所での現地疫学調査の結果を必ずしも十分に説明できていなかった。系図をまとめるために系統樹が広く用いられているが、系統樹だけで得られた結果を甘く解釈すると正確な結論が得られない可能性がある。SARS-CoV-2の進化率の低さやゲノムのサンプリングの偏りから、しばしばスプリアスな結論を導くことがあり（11)一方から他方への感染の方向性を示唆していない。

我々は、上述のように日本人分離株を含む合計24,129のゲノム配列を選択したが、系統解析に含まれる候補の数が多いため（図1B)患者間やイベント特異的クラスタ間でのSARS-CoV-2の感染経路の詳細が不明瞭であった。また、図1Bのや拡大画像では、特徴的なクラスターを地域的なものかイベント特異的なものかを識別することはできなかった。ハプロタイプネットワーク解析は、現在のCOVID-19発生時のような短期的な疫学のより良い画像を提供するが、サンプリングの偏りや遺伝的進化に基づく限られた多様性の問題を克服することはできない(12)。そこで、我々はハプロタイプネットワーク解析を用いて、非常に短い期間（数日、数週間、または数ヶ月）における潜在的な感染の連鎖を強調し、地域的またはイベント特異的なクラスタが症例数に依存していることを実証した（図2;のムービーS1も参照）。

図2 全世界のSARS-CoV-2分離株のゲノムワイド一塩基変異を用いたハプロタイプネットワーク解析

A）日本で分離されたSARS-CoV-2分離株（n = 435）の全ゲノム配列を、GISAIDデータベース（n = 23,694［2020年10月10日更新］）で入手可能な全SARS-CoV-2ゲノムと比較した。2019年12月末に中国武漢市から播種されたSARS-CoV-2（武漢-Hu-1の潜在的な起源の1つ）をハプロタイプネットワークの中心にプロットしている。合計で 9,235 個の SNV が 24,129 個の分離株から検出された。スパイクタンパク質のD614Gアミノ酸置換を持つ単離株はピンク色の背景で強調表示されている。太い矢印は、40個以上のエントリーからなる顕著な大規模ゲノムクラスタを示している。クラスターノードの横には、PANGOLIN（A、B、B．B）時系列累積COVID-19症例の3つのプロットは、COVID-19症例の発生率の増加を可視化するために、各囲んだ四角で強調表示されている。時系列ムービー（mp4ファイル）は（動画S1）に掲載されている。

動画S1

原文参照

SARS-CoV-2ゲノム全体の系譜を解読するために、本研究で収集したゲノムデータセットと、武漢-hu-1ゲノムを最も最近の共通の潜在的な祖先とする祖先関係を記述したハプロタイプネットワーク解析を行った（図2）。合計で 9,235 個の SNV が 24,129 個の分離株から検出された。1月から2月にかけて日本で確認された主要なクラスターのいくつか（図2の赤丸で囲んだ2つの赤枠）は、中国から分離された武漢-Hu-1関連株でよく見られるハプロタイプから直接派生したものであった。また、中国からの分離株の最初の導入後には、他にも2つの明瞭なクラスター（図2のオレンジ色の枠内に赤丸で囲んだ2つの追加のクラスター）が観察された。これら4つのクラスターは、中国で発生した第一次波から直接発生したものと推測され、狭い地域でのパーティ、雪祭り、ロックコンサートなどの集団集会に関連していると考えられた。また、これらのクラスターは院内感染に関連している可能性もあった。大衆集会に関連したクラスターは、COVID-19患者と交流した人々がイベントに参加した後に帰宅することで、全国的な広がりをもたらした。これらのクラスターの大部分は、地方の保健所の努力と3月中旬までの日本での積極的なサーベイランスの実施によって食い止められた。

これとは対照的に、COVID-19の患者数は3月上旬に欧米で急増し（図2A、右)パンデミック（主にPhylogenetic Assignment of Named Global Outbreak Lineages [PANGOLIN] B.1およびB.1.1）が発生していることを示唆している。同時に、日本では3月末から4月上旬にかけて散発的なCOVID-19症例が多数検出された。ハプロタイプネットワーク解析の結果、さらに大きなクラスター（PANGOLIN B.1.1 .1）（図2AおよびBの赤い閉じた円とシアン色の枠）は、ヨーロッパからのオリジナル（図2のシアン色の閉じた円）と比較して、同一または追加のSNVを示した。しかし、追加されたクラスターは中国の武漢-Hu-1由来の8つのSNVを示しており（マゼンタ枠)系統的には別の系統（図1Aおよび図2AのPANGOLIN B）に属しており、日本での4月上旬の2回目の導入は武漢由来ではなく、ヨーロッパでの発生と密接に関連していたことが示唆された。この観察は、動画S1のタイムライン（mp4ファイル）で支持されている。

全ゲノム配列の解析は、クラスタ間のゲノムワイド SNV を用いた感染拡大の追跡に有用な情報を提供する。特定のSARS-CoV-2系統の導入にどのような日本の政治的決定（図3A、表S4）や活動が効果的に関与していたかを明らかにするために、自粛運動の前後で日本、米国、英国のiPhone（図3B）を追跡することで、毎日のCOVID-19の症例報告と人々の移動指数を特徴づけた。中国からの一次波では、2月上旬に国際空港で「武漢、湖北、浙江、中国」というキーワードでCOVID-19の潜在的な患者を調査した（図3A）。また、地方の保健所では、積極的な疫学的サーベイランスを実施することで、地域別のクラスター内でCOVID-19に感染している可能性のある患者とその近縁者を特定した。2月末以降、日本では自粛が開始され、週末の移動活動の急増が大幅に減少した。国内の状況は3月中旬頃には改善し始めていたが，COVID-19の新規患者が多数発生し，その多くは感染経路が不明であった。これらの患者の中には中国や日本以外の国への渡航歴がないものもあり、感染経路の追跡は困難であった。

図3 日本、英国、ニューヨーク市、サンフランシスコ湾岸地域におけるCOVID-19の人と日常のCOVID-19症例の移動指数（歩行）

(A) 日本におけるCOVID-19検疫の政治的決定と国家的行動の年表（の表S4も参照）。B）日本、英国、米国（ニューヨーク市とサンフランシスコ湾岸地域）におけるCOVID-19感染者数と1日のCOVID-19感染者数の移動指数。実線は、アップル社が提供した地図アプリの利用状況から推定した人の移動指数を示す。棒グラフは毎日のCOVID-19の事例を示している。注目すべきは、日本とサンフランシスコ・ベイエリアの人々が2月末から「留守番」対策に協力したことで 2020年3月下旬以降のSARS-CoV-2感染の拡大を抑えられた可能性があることを示唆するデータである。

2020年3月20日から22日までの祝日には、一部の住民が花見のために自宅を離れ、移動性が高まった可能性がある（図3B）。このような部分的な活動性の増加は、以前に流通していた最初の導入から残っていた系統の復活を可能にしたのではないかと推測された。しかし、SARS-CoV-2ハプロタイプネットワーク解析は、3月下旬に発生したCOVID-19の第2波は、第1波の系統とは明らかに異なる起源を持っていることを示唆した。第2波の系統は、ヨーロッパ、北米、その他の国（13）からの帰国者や旅行者によって輸入された可能性があるが（図2のシアン枠内の画像参照)武漢に残っていた系統からは輸入されていない可能性がある。欧州でのCOVID-19症例の増加と日本での輸入症例の検出を考慮し、日本政府は2020年3月27日に欧州からの移民を停止することを決定した。図3A）。一方、米国や英国では3月初旬まで移動の増加が続き、3月中旬からCOVID-19症例が急増した可能性がある（図3B）。興味深いことに、サンフランシスコ湾岸地域では、ニューヨークよりも早く活動が鈍化しており、ニューヨークではサンフランシスコに比べて留守番・避難指示の実施に3日以上かかったことが、サンフランシスコでのCOVID-19の広がりが緩和されたことを説明しているのかもしれない。

日本は、どの都市にもロックダウンのような厳しい規制を課していないが 2020年2月26日には国民に自粛が要請された。この自粛は、日本では毎週末のピーク時の活動が減少していることを反映している（図3B）。自粛要請は弱い規制ではあるが、3月中旬までのCOVID-19感染者数の増加を緩和するためには、このような長期的な自粛が有効であったはずであるが、3月中旬頃に大量の移民が発生したことや、欧州からの渡航制限が遅れたことが感染者数増加の原因と考えられる。

また，3月中旬の祝祭日中の移動活動の増加や，国家緊急事態宣言の遅れが，現地レベルでのパンデミックをエスカレートさせた可能性も考えられた。

結論

今回のゲノムサーベイランス調査により，日本へのSARS-CoV-2の導入は少なくとも2つの異なることが示唆された（最初は中国から，その後ヨーロッパを含む他国からの導入）．3月27日から入国制限が行われているため、これまでのところ、海外からの追加導入は確認されていない。実際、9月の現在のSARS-CoV-2分離株は 2020年3月中旬に確認された欧州関連の日本分離株（B.1.1 PANGOLIN）の子孫に分類されている。日本におけるCOVID-19の次の波を緩和するためのさらなる自粛要請は、国境を越えたさらなる拡散を回避することで局所的なクラスターの封じ込めにも役立つ可能性があり、潜在的な感染連鎖を浮き彫りにし、保健当局や政府による迅速な意思決定を可能にするためには、疫学的な現地調査を支援するためのリアルタイムゲノムサーベイランスを活用したより効率的な封じ込め戦略を策定する必要がある。