骨治癒における低レベルレーザー治療の役割：系統的レビュー
The Role of Low-Level Laser Therapy in Bone Healing: Systematic Review

図1　データベース、登録、その他の情報源の検索を含むPRISMAフロー図[12]。

3.結果

3.1.低レベルレーザー治療 (LLLT)

レーザー治療は、さまざまな組織の生体刺激など、医療分野のさまざまな分野で広く用いられている治療法である。この場合、500mW以下の出力と500～1000nmの発光スペクトルを持つレーザーを使用することで、様々な組織の再生と修復を促進し、あらゆる損傷を防ぐ分子経路に干渉することができる。

LLLTは最近、整形外科分野でも骨治癒プロセスを促進するために使用されている。特に、使用されるレーザーは低密度エネルギーに基づいており、コヒーレント（レーザー）または非コヒーレント（LED）光源からの非熱放射光子を使用している。骨再生を促進する効果的な治療を行うためには、LLLTは特定の線量パラメーターを遵守する必要がある。残念ながら、正確なパラメーターを強調する文献上のエビデンスは相反するものであるため、最適と思われる値の範囲（表1）を特定することしかできず、それ以下では治療はあまり効果的でなく、それ以上では組織の損傷につながる傾向がある[13]。

表1 文献で観察されたLED装置の線量パラメータ

現在、最も確立された理論は、LLLTが様々な生物学的活性に影響を与えるという仮説である：LLLTは、CCOから抑制性一酸化窒素を光解離させることで、チトクロームcオキシダーゼ（CCO）の酵素活性を促進し、その結果、ミトコンドリアの呼吸が増加し、アデノシン三リン酸（ATP）が生成される[14,15]。LLLTはまた、ミトコンドリア膜電位の変化にも関連し、その結果、Fe2+の酸化、プロリン水酸化酵素（PHD）の阻害、因子HIF-1αの調節阻害を伴う細胞の酸化還元状態の上昇を引き起こす。さらに、活性酸素の増加は、細胞増殖、生存、修復、再生経路を含むいくつかのシグナル伝達経路の変化を引き起こす[5,16,17] 。

3.2.骨治癒におけるLLT活性化分子経路

骨再生は最適な生理学的プロセスである傾向があるが、骨感染症、血液不全、骨欠損、病的骨折、全身疾患があると、修復不全が起こりうる[10] 。このプロセスを刺激し促進するために、物理的刺激、化学的治療、光刺激など、さまざまな臨床的アプローチが研究されてきた。LLLTは、炎症期、血管間葉期、骨形成期、骨リモデリング期という4つの主な段階が重なり合う骨治癒プロセスを促進するために使用される[18] 。

炎症期は、まず腫瘍壊死因子α（TNFα）や数種類のインターロイキンを含む炎症性シグナルや成長因子の動員・活性化によって特徴付けられ、次いで多形核好中球（PMN）、マクロファージ、血小板が動員され、これらの細胞は骨折部位にすでに存在する骨形態形成タンパク質（BMP）とともに間葉系幹細胞（MSC）を呼び起こす[19]。この段階の重要な調節因子はWntであり、Wnt/β-カテニン（カノニカル）、Wnt/Ca2+、Wnt/平面細胞極性、Wnt/プロテインキナーゼ（非カノニカル）など、さまざまな分子経路を活性化できるシグナル伝達経路である[20] 。

高レベルのVEGF、PDGF、FGFを特徴とする血管間葉期には、新生血管の浸潤と形成が起こり、無血管軟骨マトリックスから骨組織への転換が脈管形成される。特に、肥大化した骨芽細胞と軟骨細胞によって発現される転写因子であるVEGFは、すでに存在する血管から新しい血管の形成を誘導する新生血管新生と、細胞増殖と内皮幹細胞の凝集を助ける骨折部位の再血行再建の両方を促進する[21]。

MSCの動員は、骨再生期の開始を意味し、これはMSCが新たに形成される骨の骨芽細胞や軟骨細胞へと分化することを特徴とする。この段階で重要な役割を果たす転写因子は、runx-2とosterixである。runx-2は、様々な骨基質遺伝子の発現を制御することにより、骨芽細胞分化の初期段階に影響を及ぼし、一方、osterixは、runx-2が制御されなくなる後期段階における分化制御に介入する。骨再生のこの段階は、骨形成タンパク質シグナル伝達経路（BMP）、腫瘍成長因子βシグナル伝達経路（TGF-β）、ホスホイノシチド3キナーゼ/Akt/ママルターゲットラパマイシンシグナル伝達経路（PI3K/Akt/mTOR）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路（MAPK）など、いくつかの分子経路によって特徴づけられる。

再生が終わると、成熟した骨芽細胞が骨折部位にコラーゲンとカルシウムを沈着させ、一次骨とも呼ばれるカルスを形成する。骨折の完治に重要な骨カルスが正しく形成されるためには、骨芽細胞と破骨細胞のバランスが重要であり、それぞれが新しい骨の形成と吸収を行う。このプロセスは成長ホルモン（GH）によって制御されており、直接刺激（GH）と間接刺激（IGF-1インスリン様成長因子を介した刺激）の2つの主な機能がある：新しい骨の形成を誘導するために骨芽細胞の増殖と活性を刺激し、骨吸収を促進するために破骨細胞の分化と活性を対称的に増加させる。さらに、GHには、骨成長領域に存在する軟骨細胞の終末分化を誘導する役割もある[23]。

骨再生プロセスは、インターロイキン、TNFα、インターフェロン-γを含む様々な炎症性シグナルによって誘導される。化学的治療、物理的刺激（機械的な力、超音波、衝撃波、異なる性質の刺激）、光刺激、細胞治療など、様々なアプローチがこのプロセスを刺激し、影響を与えることができる。

AI解説

• 1. 炎症期：
  • 骨折直後に始まり、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキンなどの炎症性シグナルが活性化されます。
  • 多形核好中球（PMN）、マクロファージ、血小板が骨折部位に集まり、骨形態形成タンパク質（BMP）とともに間葉系幹細胞（MSC）を活性化します。
  • Wntシグナル伝達経路が重要な役割を果たし、複数の分子経路を活性化します。
• 2. 血管間葉期：
  • 新生血管の形成が起こり、無血管軟骨マトリックスから骨組織への転換が行われます。
  • VEGF、PDGF、FGFなどの成長因子が高レベルで発現し、新しい血管の形成と骨折部位の再血行再建を促進します。
• 3. 骨再生期：
  • MSCが骨芽細胞や軟骨細胞へと分化し、骨の新しい形成を開始します。
  • 重要な転写因子にはrunx-2とosterixがあり、骨芽細胞分化の制御に関与します。
  • BMP、TGF-β、PI3K/Akt/mTOR、MAPKなどのシグナル伝達経路が活性化されます。
• 4. 骨リモデリング期：
  • 成熟した骨芽細胞がコラーゲンとカルシウムを沈着させ、一次骨（カルス）を形成します。
  • 骨芽細胞と破骨細胞のバランスが重要で、成長ホルモン（GH）によって制御されます。
  • GHは、新しい骨の形成を刺激し、骨吸収を促進し、軟骨細胞の終末分化を誘導します。

これらのプロセスは、骨折の治癒と再生において重要な役割を果たし、LLLTはこれらの過程を促進する可能性があります。さまざまな成長因子やシグナル伝達経路が相互作用し、骨の修復と再生を効果的に進めます。

現在最も効果的と考えられている後者のアプローチは、間葉系幹細胞を用いて骨再生のプロセスを促進するものである。間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、皮膚、臍帯、胎盤など、いくつかの組織から容易に得られるが、最良の再生結果は骨髄間葉系幹細胞から得られている。しかし、この細胞タイプには負の側面もあり、その中には、細胞の質と濃度に高いばらつきがあること、得られた組織源が異なること、コストと時間がかかることなどがある。

MSCsの使用にはこのような限界があるため、骨再生を促進する新たな治療法が模索されており、そのひとつがLLLTである。光刺激は、細胞内のミトコンドリア呼吸、ATP産生、活性酸素レベルなど、いくつかの生物学的活性に影響を与え、細胞の生物学的プロセスに変化をもたらす可能性があるようだ[17]。そのため、主にBMSC、HUVEC、MSC細胞、骨芽細胞を対象としたin vitroと、特にラットとウサギを対象としたin vivoの両方で、LLLTの効果を理解するための研究がいくつか実施されている。

以下に、in vivoとin vitroの両方で行われた、LLLTの可能な効果を示すいくつかの研究を示す。

3.3.インビトロ試験

LLLTは、主に骨再生過程の初期段階で相互作用することが観察されており、以下のシグナル伝達経路を刺激する（図2および表2）：

図2　低レベルレーザー治療（LLLT）によって活性化される分子経路の模式図。

略語：VEGF（血管内皮増殖因子）；FGF（線維芽細胞増殖因子）；PDGF（血小板由来増殖因子）；TGF-β（腫瘍増殖因子-β）；BMP（骨形態形成タンパク質）；AKT（AKTセリン/スレオニンキナーゼ1）；PI3K（ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート3-キナーゼ触媒サブユニットデルタ）；MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）；ERK（細胞外シグナル制御キナーゼ1/2）；SMADタンパク質（small mothers against decapentaplegic）；runx-2（ラント関連転写因子遺伝子）；col1（コラーゲンタイプ1遺伝子）；ocn（オステオカルシン遺伝子）；opn（オステポンチン遺伝子）；ibsp（ボーンシアロプロテイン遺伝子）。

表2 in vitro LLLT研究のまとめ

3.3.1.炎症期

• WNT/β-カテニンは、骨再生の進行に重要な役割を果たすシグナル伝達経路である；特にその活性化は、細胞質内のβ-カテニンを安定化させ、その核内移行を可能にし、アキシン、大腸腺腫症（APC）、プロテインホスファターゼ2A（PP2A）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK3）、カゼインキナーゼ1α（CK1α）によって形成されるタンパク質複合体を分解し、β-カテニンの破壊に関与する[20] 。活性化され核に移動すると、β-カテニンはLEFやTFCを含むいくつかのDNA結合タンパク質と相互作用し、骨形成マーカーの発現と前骨芽細胞の分化を誘導する[35] 。TNFを含む炎症性サイトカインの存在は、WNTシグナル伝達経路の活性化を防ぐアンタゴニストであるDickkopf-related protein 1 (DKK-1)の発現を刺激するため、炎症過程はこのシグナル伝達経路に悪影響を及ぼす。レーザー治療、特に波長830nmのレーザー治療は、β-カテニンの細胞質から核への移動を増加させ、経路の活性化を増加させ、骨再生プロセスを加速させる[25]。
• NF-kBは細胞質に存在する転写因子であり、その阻害複合体であるIkBαがリン酸化された後、核内に移動し、遺伝子の転写を通じて炎症プロセスを促進することができる。脂肪由来幹細胞（ADSCs）に波長660nmの赤色レーザーを照射すると、リン酸化IkBαと核内のNF-kB濃度の減少が見られ、NF-kB阻害を介して炎症プロセスを負に制御するLLLTの能力が強調された[27]。

3.3.2.血管間葉期

• VEGFは血管新生の主要な調節因子の一つであり、内皮細胞の移動と増殖を促進することができる。CD31とエンドムシンを高発現することからH型血管と呼ばれる内皮血管のサブクラスは、骨形成促進因子であるオステリックスを高発現する周囲の骨形成因子に抵抗することにより、骨形成に好影響を与える。ヒト骨髄腸間膜幹細胞に808nmのレーザーを照射すると、VEGFの発現とH型血管の形成の両方が増加し、血管新生プロセスが全体的に促進されることが、文献を通じて報告されている[16,29]。
• PI3K-AKTシグナル伝達経路を活性化することで、細胞増殖を促 進してアポトーシスを抑制する一方、MAPK/ERK経路を刺激すること で骨芽細胞分化を誘導する。また、血管新生と創傷治癒のプロセスにも関与しており、文献上の研究では、660nmのレーザー照射とFGF発現の増加との間に相関関係があることが示されている[28] 。
• PDGFは、MSC細胞の分裂促進、血管新生、増殖活性の調節に関与する因子である。PDGFは二量体化し、ホスホリパーゼC、キナーゼSrc、PI3キナーゼ、ホスファターゼSHP2などのシグナル伝達タンパク質を活性化することで、様々な増殖因子を呼び起こす。波長636nmのレーザーでMSC細胞を処理すると、この因子の有意な増加が観察された[26]。
• ROS/HIF-1α経路の活性化は、骨修復の2つの重要なメカニズムである細胞分化と内皮血管新生を促進する。最近の研究では、BMSC細胞を4.5 J/cm2でGaAlAsレーザー処理すると、単純培養ではもちろん、HUVECとの共培養ではより顕著に、ROS/HIF-1α経路が活性化されることが示されている[16]。

3.3.3.骨形成期

• ラント関連転写因子(runx-2)は、MSCsのリクルートと骨芽細胞への分化に関連した役割を担っており、骨マトリックス遺伝子であるコラーゲンタイプ1(col1a1)、オステオポンチン(opn)、オステオカルシン(ibsp)、オステオカルシン(ocn)の発現も誘導する[16,35]。文献によると、レーザー治療はMSCを骨形成分化に向かわせ、脂肪形成分化に向かわせることが示されている[25]。さらに、波長810nm、エネルギー密度2～4J/cm2のGaAlAsダイオ ードレーザーを照射すると、BMSCの増殖と骨芽細胞への分化が増加する ことが観察された［30］。
• 特に、TGF- βは骨芽細胞の増殖に重要な役割を果たし、BMPは骨形成において顕著な能力を有するだけでなく、骨形成の成熟過程においても基本的な役割を果たす[23]。文献において、様々な研究が、LLLTとTGF-βおよびBMP発現の増加との相関を報告している。特に、骨芽細胞様細胞（ヒト骨肉腫細胞株 MG-63）にLLLTを照射すると、BMPが増加し[31]、活性酸素の活性化を通じて骨形成分化が促進され、 TGF-β 1が活性化されることが観察された[16]。この相関関係は、低酸素条件下で骨芽細胞をGaAlAsレーザーで処理することによっても見出されている[32]。
• PI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路は、そのタンパク質エフェク ターの活性化カスケードにより、細胞生存に関与する主要な経路の一つであ り、細胞周期、運動性、アポトーシス、代謝、細胞分化、さらに転写と 翻訳のメカニズムを制御している。また、骨再生との相関もあるようで、実際、骨形成とリモデリングへの関与の可能性を示す文献研究もいくつかある[23]。これらの研究を通して、HUVECs細胞株を波長650nm、エネルギー密度1～4J/cm2のレーザーに曝すと、PI3K、AKT、mTORのリン酸化が増加し、シグナル伝達経路の活性化と機能性が高まることが観察された[33]。興味深い研究では、635nmを照射した骨芽細胞では、未処理の細胞と比較して、Aktの発現レベルとその活性化されたリン酸化形態を増加させるLLLTの役割が確認された[34]。
• MAPKキナーゼ経路は、細胞増殖や分化、細胞ストレスに対する応答など、いくつかの細胞プロセスを制御することにより、シグナル伝達において重要な役割を果たしている。さらに、骨形成を制御し、骨形成分化を誘導し、骨芽細胞の活力と機能を制御している。特に、MC3T3-E1細胞株に波長910 nmのレーザーを使用すると、ERKリン酸化が増加し、経路の活性が高まった[11]。

3.4.In Vivo試験

文献では、LLLTが骨修復に関連した役割を果たすことが、in vivoでも観察されている。In vivo研究は主にラットとウサギで行われ、LLLT照射後の骨治癒プロセスが有意に促進されることが示された（表3）。

表3 in vivo LLLT研究のまとめ

in vitroで得られた結果と一致して、in vivoの研究でも、レーザー治療が骨再生の初期段階を促進することが確認されている[41] 。60匹のラットに830nmのレーザーを照射したところ、炎症性インターロイキンIL-1、IL-6、IL-8、IL-18の調節が解除され、炎症過程の調節が認められ、骨欠損の修復が期待された[37]。特に、830nmのレーザー照射はVEGFの発現を増加させ[37]、1064nmのレーザーの使用はPDGFとFGFの発現を増加させた[38]。In vivoの研究でも、808 nmのGaAlAsレーザー照射後、BMP2やOCNを 含むさまざまな骨形成マーカータンパク質の発現が増加し、 レーザー治療後の骨インプラントのオッセオインテグレーシ ョンがより促進されることが確認されている[13]。

現在、文献上では、主に骨再生の初期段階において、レーザ ー治療の有効性に同意する患者に対するLLLT治療後の効果的な 有益効果に関するわずかな証拠しかない。これらの研究では、波長830 nm、エネルギー密度16 J/cm2のレーザー治療を患者に行った後、骨形成とミネラル化の増加、および骨芽細胞分化の促進が示された[39]。骨再生の顕著な増加は、外科的補助による急速上顎拡大術後の患者に実施された二重盲検臨床試験でも確認されており、波長660nm、エネルギー密度2.7J/cm2のGaAlAsレーザーによる術後治療により、骨再生の改善と合併症の減少が示されている[40]。

4.ディスカッション

レーザー治療は、医療分野を含む様々な分野で汎用性のある、正確な特性を持つ光ビームを照射することができる技術装置の使用に基づいている。出力が500mW以下で、発光スペクトルが赤と赤外の間のレーザーを選択することで、組織に有害な可能性のある熱を発生させない治療が可能になり、骨の治癒プロセスを刺激し促進することができる。

in vivoとin vitroの両方で実施された様々な研究によると、レーザー治療の効果が骨再生プロセスを増加させたのは骨折後の最初の数週間（2/4週）だけであり、約60日後にはコントロールに対する利点は観察されなかったことから[42]、LLLTはプロセスの初期段階でのみ有効であることが示されている。文献で実施された研究では、LLLTを最適なものとする特定の物理的パラメータは明らかにされなかったが、治療がおそらく効果的でない値の範囲を提供している。これらの結果は、低レベルレーザー刺激が、物理的刺激に対して共通に保存された反応メカニズムを活性化することを示唆している。さらに、再生に対するLLLTの良好な影響は、考慮した細胞株に関係なく観察された。骨再生は、最適な生理学的プロセスであるが、病的骨折や全身疾患が存在する場合には、問題を呈し、失敗することがある。4つの主要な段階が重なっているにもかかわらず、文献の結果は、LLLTが最初の3つの段階に関与する分子経路にのみ、特に血管間葉系段階と骨形成段階に関与するシグナル伝達経路を活性化し、炎症段階に特徴的なシグナル伝達経路を抑制することによって影響を及ぼすことを示しているようである。

血管や骨の破壊によって引き起こされる炎症反応は、組織の修復と再生に必要な細胞の動員を可能にすることで、骨治癒において重要な役割を果たしている[20] 。文献では、LLLTの適用が炎症反応の調節に役立つことが報告されている。in vitroでは、WNT活性化とNF-kβシグナリングの阻害の両方によるものであり[43]、

in vivoでは、炎症性プロインターロイキンIL-1、IL-6、IL-8、IL-18の調節が解除され、抗骨欠損修復作用がある[29]。これらの研究は、LLLTによる刺激の負の制御を示しているように思われる。新生血管の形成と無血管軟骨基質の血管化骨組織への変 化を特徴とする血管間葉期に関しては、いくつかの研究で、 LLLT治療が幹細胞（hBMSC、hMSC、hOB）のVEGF、FGF、 PDGFの増加を誘導し、CD31を高レベルで示す内皮血管のサブカテ ゴリーであるH型血管と呼ばれる血管の産生を誘導できることが 報告されている。これらの結果は、ラットを用いたin vivo研究でも見られた。これらのシグナル伝達経路の活性化は、増殖、骨形成分化、血管新生を促進した[16,26,29]。MSCの採用と骨芽細胞への分化は、骨形成期を特徴づける。実際、幹細胞（hMSC、ヒト骨肉腫細胞株MG-63）をラットに照射すると、BMPおよびTGF-βシグナルが増加し、その結果、骨形成分化が促進されることが報告されている。しかし、骨リモデリング段階に関する限り、これまでの文献で実施された研究では、レーザー治療の役割の可能性は強調されていない。最近のin vitro研究では、異なるタイプのLLLTをヒト骨芽細胞に照射することで、骨ミネラル化を増加させる効果の可能性が示されたのみである[44]。したがって、この仮説を検証するためにさらなる調査を行うことが適切であろう。

5.結論

文献に報告されているすべてのデータは、LLLTのさまざまな臨床応用を示しているが、異なる研究で使用された線量パラメータ（波長、パワー密度、エネルギー、照射時間、周波数繰り返し、試料からの距離）が大きく異なるため、細胞反応の刺激に関する正確な知識を提供していない。したがって、in vivoでの細胞の生存、アポトーシス、エピジェネティックな変化、ストレス応答などを調べるなど、より正確な分析を行い、細胞全体の状況や組織の生理病理をより幅広く把握する必要がある。しかし、生体系に対するLLLTのin vitroでの効果をよりよく理解することは、in vivoでの結果を予測する絶好の機会となる。標準化された実験ガイドラインがなく、in vitroとin vivoの両方で使用されるLLLTの線量パラメータが非常に不均一であるため、対照試験では比較可能なデータが得られず、結論が出なかった。

略語

ファンディング・ステートメント

本研究はRAMSのプロジェクトにより行われた：TI-RAMS：”Trattamenti innovativi per le muscolo patologie scheletriche: dal planning virtuale preoperatorio alla medicina rigenerativa TI-RAMS”, RCR-2021-23671217.

利益相反

著者らは利益相反がないことを表明している。