Low-Level Laser Therapy to the Bone Marrow Ameliorates Neurodegenerative Disease Progression in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease: A Minireview
Amir Oron医学博士1およびUri Oron博士2
要旨
目的
本報告では、低レベルレーザー治療（LLLT）による自己骨髄（BM）中の間葉系幹細胞（MSC）の刺激により、MSCの脳への浸潤、b-アミロイドの除去、認知機能の改善が促進されることを検討する。
背景
我々は最近、BMにLLLTを適用すると、MSCの増殖が促進され、虚血性心疾患領域へのMSCの移動が促進されることを報告し、再生医療や神経変性疾患への応用の可能性を示唆した。また、アルツハイマー病（AD）モデルマウスにおいて、循環単球が脳に浸潤し、脳アミロイド負荷を軽減することが示された。
方法と結果
LLLTで刺激した野生型マウスのMSCは、in vitroで単球系への成熟能と可溶性Abの貪食能の増加を示した。さらに、生後4ヵ月（5XFADトランスジェニック雄マウスの進行期）から2ヵ月間、毎週BMにLLLTを行うと、偽薬を投与したADマウスモデルと比較して、記憶と空間学習が改善した。組織学的には、レーザーを照射したマウスでは、非照射マウスに比べてAb脳負荷が有意に減少していた。
結論
BMへのLLLTの応用は、ADの進行期における治療アプローチとして示唆され、脳アミロイド原性疾患におけるMSC療法の仲介におけるその潜在的役割が示唆された。
はじめに
アルツハイマー病（AD）は、世界中で1,800万人以上が罹患し、進行性の記憶障害、認知障害、人格変化を特徴とする。ADの主な原因は、神経原線維のもつれ形成に伴うアミロイドβ（Ab）の産生と蓄積の増加であり、これが神経細胞死を引き起こす。この過程は、主に学習と記憶に重要な海馬に影響を及ぼす1。この構造には幹細胞が存在することから、成体神経新生現象と海馬機能におけるその役割に対する関心が高まっている2。海馬における神経新生に影響を及ぼす既知の因子の多くが、ADの発症に関与している3。神経新生は改変可能であるため、このプロセスを刺激すること、あるいは内因的に採取された幹細胞や移植によって移植された幹細胞を使用する可能性が、ADなどの神経変性疾患の治療法として考えられている。新しい脳細胞の供給源は、前脳の脳室下帯4や海馬の顆下帯5といった局所的なものである可能性が以前に示されている。同様に、最近、歯原性嚢胞性病変に発生するヒト歯根膜周囲嚢胞には、自己複製能と多系統分化能を持つ間葉系幹細胞（MSCs）が含まれていることが示された。別の研究では、胚性中脳の手がかりの存在下で、歯髄幹細胞が機能的なドーパミン作動性細胞型になる傾向を効率的に示すことが示された8。
link.springer.com/article/10.1007/s00441-019-03109-4
BMには、造血幹細胞、MSC、内皮前駆細胞、側集団細胞、多能性成体前駆細胞など、いくつかの異なるタイプの多能性細胞が存在する。他の幹細胞と同様、MSCは単一細胞から多系統に分化することができ、傷害を受けた組織をin vivoで機能的に再構成することができる9 。幹細胞の特性の一つは、一つまたは複数の適切な微小環境に移動する能力である10 。MSCの場合、末梢血中を循環するホーミング部位の性質やその動態につい ては、まだ議論の余地がある。しかし、注入後、MSCは複数の組織で見つかっており、MSCは多様な組織微小環境にホーミングし、分化経路を調整する能力を持っているという仮説につながっている11。最近、AD誘発モデルの脳に骨髄由来MSCを脳内移植すると、偽移植動物と比較して、Abタンパク質レベルが低下し、ミクログリア細胞の活性化が促進されることが示された。さらに、血液由来のミクログリア様細胞には、細胞特異的な貪食メカニズムによってアミロイド沈着を除去する能力があることが示唆された12。
低レベルレーザー治療（LLLT）は、さまざまな生物学的プロセスに対して光バイオモジュレーション（PBM）効果を持つことが判明している13,14。経頭蓋的にLLLTを照射すると、ラット、ウサギ、ヒトの脳卒中後に有益な効果があることが示されている15-17。さらに、ADマウスに経頭蓋的にLLLTを複数回照射すると、非レーザー処理マウスよりも神経機能が改善する18。
LLLTによる幹細胞や前駆細胞のPBMは、広く研究されていない。脂肪由来幹細胞への低レベルレーザー照射は、その活性を減弱させた。21 LLLTはまた、虚血心臓への移植後、MSCの生存および/または増殖を有意に増加させ、次いで瘢痕化を顕著に減少させ、血管新生を促進させることが判明した22。さらに、ラットの梗塞心臓の自家BMにLLLTを適用すると、MI後の心臓の瘢痕の程度が79％減少した23,24。この現象は、BMからレーザー誘導されたMSCが梗塞領域に動員される程度が高いことに部分的に起因している可能性がある。LLLTを用いてBMの多くの種類の細胞を誘導しようとする試みの背景には、MI後の複雑なプロセスや他の臓器の虚血傷害に、単一の種類の幹細胞で大きな影響を与えることはできないという理論的根拠がある。本来のBMには多くの種類の幹細胞が存在することが知られており、それらは様々な抗体に対する反応性によって定義されている。BMはまた、例えばマクロファージに分化する前駆細胞（単球）を多く含んでいる。マクロファージは最近、MI後の瘢痕形成プロセスの緩和において重要な役割を果たすことが示されている。このように、LLLTは、様々な種類の細胞を同時にBMに誘導する可能性があり、BMで増殖が促進されると、血液循環でその数が増加する。これらの細胞は、おそらく、最終的には、ある程度まで、また特定の状況下では、虚血臓器（心臓など）の虚血域に住み着くであろう。最近の研究では25、我々は、ADマウスモデルの進行段階において、BMへのLLLTが有益な免疫反応を活性化するか、あるいは幹細胞が脳に住み着くように誘導できるかどうかを明らかにしようとした。
我々はまず、レーザー処理したMSCがAbタンパク質を貪食する能力を評価しようとした。MSCsの単離は、基本的に既述の方法で行った。
培養されたMSCは、エネルギー密度1.0 J/cm2となるように、50 mW/cm2の出力密度で20秒間Ga-Al-Asレーザーに曝露された。MSCsを含むもう1セットの6ウェルプレートは、偽のレーザー照射（コントロール）を行った（細胞は上記と同様に処理されたが、レーザーは照射されなかった）。レーザー処理したMSCとコントロールのMSCは、レーザー処理後3日間インキュベーター内に放置し、その後70％コンフルエントになるまで培養した。Abの貪食については、既述のようにMSCを抗CD11b抗体で標識し26、Abの貪食率を蛍光活性化セルソーティングで解析した。
レーザー処理した細胞では、レーザー処理しなかった細胞と比較して、Ab（1-42）の貪食が有意に（p = 0.041）35％増加した。さらに、単球由来細胞のCD11b活性化マーカーにおいて、有意な（p < 0.0001）10％の増加が検出された。これらの結果は、BMのMSC集団のうち、単球または貪食活性を示す他の細胞タイプにレーザーを照射すると、これらの細胞が著しく活性化され、ADマウスの脳内に蓄積したAbタンパク質を特異的に取り込む能力が高まることを示唆している。実際、LLLTが免疫系に影響を及ぼす可能性が示唆されている27。さらに、LLLTは、リポ多糖処理したマクロファージにおいて、一酸化窒素をアップレギュレートする一方で、炎症性サイトカインを減少させることが示された28。
マクロファージが食細胞として働く能力も、LLLTの適用下で変調をきたすことが判明した27,28。このように、我々の最近の研究25では、LLLT後、MSCのCD11bによって検出される免疫細胞の活性化が有意に上昇することが示された。さらに、可溶性神経毒性Abを貪食するMSCの反応性が増加した。これらの細胞はBMで活性化され、循環血液に移行し、脳に浸潤してアミロイドの負担を軽減するという仮説が成り立つ。実際、末梢由来の単核球の遊走が、ADマウスモデルにおいてアミロイド負荷のクリアランスをもたらし、認知機能を改善することが以前に示唆されている12。さらに、いくつかの研究では、末梢単球由来マクロファージ、骨髄由来細胞、ミクログリアの活性化が、ADマウスモデルにおいて脳アミロイドのクリアランスに関与することが示唆されている12,29。 -31 in vitroで、脳髄のレーザー誘導CD11b陽性細胞が神経毒性の可溶性Abを貪食する能力が増強されたことを受けて、ADモデルマウスを用いたin vivo研究を行った。このモデルマウスには、5XFADトランスジェニック雄性マウス（Tg6799）世代を用いた。5XFADマウスは生後2ヵ月からアミロイド負荷を示す。生後4ヵ月までに、このモデルマウスは高いアミロイド負荷を示し、大脳皮質から始まり海馬へと拡大する。生後6ヵ月になると、このマウスは大脳皮質と海馬の両方で強固なアミロイド負荷を示す。
本研究では、病気の進行段階におけるLLLTの効果を調べようとした。そこで、生後4ヵ月のADマウスに、10日ごとにLLLTを2ヵ月間（計6回）BMに照射した。最大出力400mWの波長可変レーザー（Ga-Al-Asレーザー、波長808nM）を用いた。BMへのLLLTは既報22と同様に行った。レーザー光のパワー密度はBM上で10mW/cm2、照射時間はエネルギー密度が1.0J/cm2となるように100秒とした。コントロールマウスはレーザー照射群と同じ操作を行ったが、レーザーは照射しなかった。マウスは3群に分けられた： 10日ごとにLLLTを照射したADマウス、偽手術を施したADマウス、ADマウスと同じ系統の無傷のWTマウスである。6ヵ月齢になると、マウスは行動テストと認知テストを受けた後、犠牲となり、脳は固定され、脳内のb-アミロイド負荷について処理された。物体認識テスト（ORT）と文脈恐怖条件付けテスト（FCT）の2つの神経行動学的テストが用いられた。ORTは、新奇な物体との相互作用により多くの時間を費やすことで区別される。記憶は、マウスが見慣れた物体と比較して見慣れた物体を調べるのに費やした時間の割合として、見慣れた物体に対する弁別指数によって操作的に定義された。
FCTテストでは、雄マウスにプレセッション訓練で無条件電気刺激を与えた。24時間後、フリーズフレーム自動採点システムを用いて、180秒間の凍りつき行動（呼吸運動以外を行わない）を採点し、FCTを測定した。神経行動検査後、脳（左半球）を-20℃の凍結台で矢状切片に切り出し、組織学的検査に用いた。切片はCongored染色と抗Abで染色し、蛍光顕微鏡で可視化してアミロイド沈着を定量化した。海馬のAb負荷は、海馬領域全体における不溶性の総Abとコンゴーレッド陽性領域の割合で示した。
ORTの結果から、ADマウスのBMにLLLTを適用すると、Abの沈着が有意に抑制されることが明らかになった。をADマウスのBMに適用したところ、新しい物体の近くにいる時間の割合がWTマウスとほぼ同じレベルまで有意に増加した。WTマウスの6ヶ月齢では、新しい物体の周囲で過ごした時間の平均は73％-4.11％であった。この値は、6ヵ月齢の非レーザー治療ADマウス群では47.3%-5.58%と有意に減少し（p < 0.01）、後者では有意な記憶喪失が認められた。しかし、レーザーを照射したマウスでは、新しい物体の近くにいた時間の平均割合は68.7％-3％であり、ADマウスのBMにLLLTを複数回照射することで、記憶喪失が回復したことが示唆された。WTマウスとLLLTを受けたADマウスの間で、新しい物体の近くにいる時間に統計的な差はなかった。
FCT非レーザー処理ADマウスは、WTマウス（71.1 – 4.6秒）よりも低い認知能力（11.6 – 4.6秒）を示した。レーザー処理ADマウスは、非レーザー処理マウスと比較して、40.4 – 5.28秒と有意に増加した凍結時間を示した。これらの結果は、レーザーを照射したBMマウスでは、対照マウスに比べて認知能力と記憶力が有意に向上したことを示している。LLLT治療2ヵ月後のADマウスの脳におけるアミロイド負荷は、in vitroおよび行動試験とも相関することがわかった。非レーザー処理マウスの海馬領域の組織学から明らかになったAb負荷の割合は180-15であったのに対し、レーザー処理マウスでは、対照マウスに比べてAb負荷が68％（p＜0.05）と有意に減少した。
この研究25により、自己BMにLLLTを適用することで、有毒なAbを貪食するMSCの活性化が誘導され、ADマウスモデルの認知機能改善につながることが実証された。LLLT治療により、疾患進行後期から短期間の治療で脳アミロイド負荷が有意に減少することが判明した。さらに、LLLT治療により、AD病期が進行したマウスでは、非治療のマウスと比較して、認知行動が改善された。
これらの結果は、ADマウスに経頭蓋的にLLLTを適用した場合の一般的な有益効果とも相関している18。しかし、今回の研究では、De Taboadaらによる研究18に比べて、レーザーの照射時間が短く、照射回数も少なかった。
ADモデルマウスのアミロイド負荷（6ヵ月時）は、対照マウスと比較して、LLLT治療マウスで有意に減少していることがわかった。この研究の行動テストの結果は、脳内のアミロイド負荷の軽減と一致している。この結果から、レーザー治療マウスでは、非レーザー治療マウスに比べて認知能力と記憶力が有意に改善したことがわかる。ORTに関しては、生後4ヶ月から6ヶ月の間にBMにLLLTを複数回照射したマウスは、WTマウスの認知能力のレベルに達する有意な改善を示した。
本研究は臨床的意義もある。LLLTの安全性は、実験動物やヒトの急性脳卒中後の二重盲検試験で報告されている15,32。さらに、我々は最近、マウスのBMに高い出力密度でLLLTを適用しても、マウスのほぼ全生存期間にわたって様々な臓器に組織学的変化が生じないことを証明した。BMへのLLLT適用が、ADマウスの認知脳機能を改善し、進行段階で治療を開始した場合でも、脳内のプラーク濃度を減少させることを実証できたことは重要である。これは、LLLTをヒトのADに適用できる可能性を示唆している。ADは通常、すでに進行期に入って初めて診断される。
今回発表された、梗塞した心臓への細胞治療に幹細胞を用いるという新しいアプローチは、幹細胞を分離し、試験管内で増殖させ、再び患者に注入する必要性を回避する。また、細胞の播種が不十分であったり、移植直後に細胞が死滅したりするために、細胞の移植や注入に伴って細胞が大量に失われることもない。また、本研究のアプローチは、自家幹細胞培養液の培養、最適な移植細胞量の決定、最適な移植時期の決定といった問題も克服している。
結論として、ADマウスの自己BMにLLLTを適用するという新しいアプローチは、幹細胞と免疫細胞の産生を誘導し、それが脳に動員されることを示し、患者自身の能力が臓器における再生反応を開始し、顕著な有益な効果をもたらす可能性を示している。このようにLLLTは、ADやおそらく他の神経変性疾患の症状を治療するための潜在的な治療戦略を提供するものである。
謝辞
編集協力をしていただいたNaomi Paz氏に感謝する。
著者開示声明
利害関係はない。