Contents
12/15 Lipoxygenase as a Therapeutic Target in Brain Disorders
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6927084/
要旨
リポキシゲナーゼは、アラキドン酸や他の多価不飽和脂肪酸からエイコサノイドや関連化合物を生成する脂質酸化酵素の一族である。これらの代謝物は、宿主防御機構、心血管疾患、癌、炎症性疾患、アレルギー性疾患、神経変性疾患などの生理・病態形成に重要な役割を果たしている。
12/15-リポキシゲナーゼ（LOX）は、ホスホリパーゼの先行作用を伴わずに、多価不飽和脂肪酸を含む脂質膜を直接酸化し、ミトコンドリアなどの膜性小器官への直接攻撃につながるという点で特殊である。
ヒト12/15-LOXの細胞毒性活性は、特に脳卒中後に神経細胞や内皮細胞で上昇し、神経細胞死と血液脳関門の漏れの両方に関与していると考えられている。組換え12/15-LOXを試験管内試験で選択的に標的とする阻害剤の発見、およびex vivoでのマウス正体に対する活性を有する阻害剤の発見は、脳卒中や12/15-LOXに関連する他の脳障害の治療のための新しい治療戦略をサポートする可能性がある。
ここでは、12/15-LOXの化学を手短にレビューし、12/15-LOXがその病態生理に関与する疾患と、神経疾患の治療オプションとしての12/15-LOX阻害剤の最近の進歩について述べた。
キーワード
リポキシゲナーゼ、脳卒中、出血性変態、12/15-LOX阻害剤
はじめに
リポキシゲナーゼ（LOX）は多価不飽和脂肪酸（PUFA）を酸化し、脂肪酸代謝物を生成する（1）。これらの代謝物は、宿主防御機構、心血管疾患、癌、炎症性疾患、アレルギー性疾患、神経変性疾患などの生理・病態形成に重要な役割を果たしている。
哺乳類のリポキシゲナーゼは40年前から実用化されているが、その生理・病態生理作用は完全には解明されていない。ここでは、リポキシゲナーゼ生化学のショートビューに焦点を当て、次に脳疾患の動物モデルと利用可能なヒトのデータにおける12/15-LOXの貢献、最後に神経疾患における12/15-LOX阻害剤の治療オプションとして。
リポキシゲナーゼ生化学の概要
リポキシゲナーゼは、膜脂質、ATP、ジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトール生成物、ホスホリラーゼ、細胞内カルシウムレベル、および多数のリポキシゲナーゼ関連タンパク質によって緊密に制御されている非ヘム鉄含有酵素ファミリーに関与している(2)。これらは高等植物や哺乳類で一般的に発現している(1, 2)。最初の LOX は 60 年前に乾燥大豆の種子から発見され、研究者たちはこの酵素の触媒機能の分子的側面を定義しようとした。最初に定義された動物性LOXはアラキドン酸12-リポキシゲナーゼ（ALOX12）と命名され、1974年にヒトの血小板から発見された（3）。その後、しばらくして、未熟なウサギ赤血球溶解液中に新しいLOX-イソ酵素が発見された(4)。支配的なLOX基質は哺乳類細胞ではリノール酸とアラキドン酸である。6 つの異なる人間の LOX のアイソフォームがあるそれらの間で最高の研究のものはおそらく ALOX5 と ALOX15 (5, 6) である。最近特徴づけられたLOXアイソフォームは、ヒトLOXアイソフォームのいずれかとの配列類似性によって分類されている。この分類モデルは、ほとんどの哺乳類のLOXに適合する。6つのLOX遺伝子（ALOX15,ALOX15B、ALOX12,ALOX12B、ALOXE3,ALOX5）があり、その発現は6つの機能的に異なるLOX-アイソフォームにつながる。そのうちの 1 つは、アラキドン酸を酸素化する ALOX15 です、この反応は 15S-HpETE (90%) と 12S-HpETE (10%) (1) の混合物に特異的である。ALOX15は、この二重反応特異性のため、以前は12/15-LOXと命名されていた。ヒトゲノムとは対照的に、マウスゲノムには7つの機能的LOOX遺伝子が存在する（7）。
マウスにおけるヒトALOX15の機能的等価性については、数年前から研究が行われてきた。これらの研究のうち、ゲノム配列の関連付け、染色体の局在、酵素の特徴の比較から、マウス白血球型12-LOX（旧命名）とヒト網状細胞型12/15-LOX（旧命名）は直交する酵素であることが提案されている。アラキドン酸の酸素化とは反応の特異性が異なるが、マウスの Alox15 は、異なる生物において類似の機能を持つ酵素であることから、ヒトの ALOX15 と機能的に同等のものを構成している可能性がある（1）。
リポキシゲナーゼ活性は、遊離脂肪酸のモノ酸素化、脂肪酸の二重・三重酸素化（リポキシン合成酵素反応)細胞内のリン脂質、コレステロールエステル、生体膜、リポ蛋白質の酸素化を担っている（8）。ヒト血栓細胞では12(S)-LOXが12-HETEの主な供給源となり、プロ炎症性分子として血管拡張、好中球の化学走化性、単球の接着、細胞増殖を引き起こす(9,10)。
12/15 脳障害におけるリポキシジェナーゼ
12/15リポキシゲナーゼに関連して最も研究されている脳障害は、げっ歯類脳卒中モデルである。脳卒中は、米国における罹患率の第一位の疾患であり、死亡率の第五位の原因である(9)。人間は4分ごとに脳卒中で死亡している(9,11)。脳卒中の経済的負担は、心血管疾患とともに、がんを含む他の疾患よりも大きい。脳卒中と他の心血管疾患の年間費用は、米国では3,166億ドルと推定されている(9)。脳卒中には2つのタイプがあり、1つは虚血性脳卒中で全脳卒中症例の約85%を占め、もう1つは出血性脳卒中で脳卒中患者の約15%を占めている。このような悲惨な結果をもたらす脳卒中であるが、組織プラスミノーゲン活性化剤（tPA）は、急性期の脳卒中に対してFDAが承認している唯一の治療法である。しかし、tPAには、治療窓が狭く、症例数が少ないこと、出血などの生命を脅かす副作用があることなど、多くの欠点がある(12-15)。そのため、出血性脳卒中にtPAを投与することはできない。このように、tPA単独またはtPAとの併用による新しい治療法は、脳卒中管理において大きな関心を集めている。
虚血性脳卒中の後には、血液供給が急激に大量に低下して細胞死を引き起こす梗塞の中核領域が存在する。このコア領域は、ペナンブラと呼ばれるサルベージ可能な組織に囲まれており、その中で組織の血液供給が低下し、死の危険にさらされている。死の組織と脱分極したニューロンからは大量のグルタミン酸の放出があり、これが興奮毒性を引き起こし、血液脳関門の透過性を増加させる(16)。酸化ストレスは脳卒中後の脳損傷のもう一つの原因であり、12/15-LOX（15-LOX-1または白血球型12-LOXとしても知られている）はこれらの病態生理学的プロセスに関与している。
虚血性脳卒中における12／15-LOXの重要性を示すデータは文献に多く存在する。Bazanグループは、虚血後の脳内でアラキドン酸のレベルが増加していることを示した(17)。その後、2つの別のグループが、アラキドン酸を脳内に注入すると浮腫が生じることを示した(18,19)。最後に、5-LOX由来のロイコトリエンと12/15-LOX代謝物12-HETEの両方を含むリポキシゲナーゼ代謝物の増加は、虚血後のネズミの前脳でMoskowitzらによって示された(20)。しばらくして、培養ニューロンにおける酸化ストレスをトリガーとした細胞死過程における12/15-LOXの機能が文献に提示された(21)。しかし、齧歯類を用いた実験的脳卒中モデルにおける12/15-LOXの特異的な関与は 2004年まで解明されなかった(22, 23)。12/15-LOXを用いた脳虚血研究のほとんどは、げっ歯類を用いて行われてきた。フィラメントモデル（一過性MCAO）で脳梗塞を実験的に誘発したマウスでは、12/15-LOXが免疫組織化学的に大脳皮質の梗塞周囲領域に発現していることが確認された（23）。また、12/15-LOX陽性細胞ではアポトーシス誘導因子（AIF）が増加し、非特異的な12/15-LOX阻害剤であるバイカレインが梗塞容積を減少させることも示された（24）。このデータは、12/15-LOXとアポトーシス細胞死のメカニズムを結びつけている。重要なことに、12/15-LOXは神経細胞と内皮細胞の両方で上昇しており、これが神経細胞の死と血管障害の両方につながる可能性があることを示唆している(25)。
12/15-LOXの関与については、一過性のMCAOモデルだけでなく、マウスの永久脳虚血モデルでも検討されている(26)。最近の研究では、C57Bl6マウスとCD1マウスを用いたtPAモデルでFeCl3誘発性持続性遠位MCAOとFeCl3誘発性虚血/再灌流を行ったところ、12/15-LOXの免疫反応性が梗塞周囲領域で増加していることが示された(27)。
また、大脳虚血後の脳損傷における12/15-LOXの寄与についても検討した。van Leyenグループは、大脳皮質、線条体、海馬に広範囲の損傷をもたらす一過性の大脳虚血をマウスの両側閉鎖モデルで解析し、12/15-LOXを増加させた(28)が、12/15-LOXは大脳虚血からの保護効果は認められなかった。しかし、12/15-LOXノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して大脳虚血からの保護があり、ノックアウトマウスは神経学的欠損が低かった(28)。リポキシゲナーゼ阻害剤であるLOXBlock-1も同様に、脳虚血発症前の投与でも、発症1時間後の投与でも神経細胞死を減少させた(28)。
また、バイカレインは12/15-LOXとGSK3βの作用を阻害し、β-セクレターゼ酵素（BACE1）を減少させ、総Aβ濃度を低下させ、APP/PS1マウスのタウリン酸化を停止させた（29）。このことは、アルツハイマー病モデルにおける12/15-LOXの関与の役割を示唆している。したがって、脳障害における12/15-LOXの寄与を調査する際には、異なる種の異なるモデルが研究された。
12/15-リポキシゲナーゼの脳障害への関与に関するヒトデータ
12/15-LOX の脳障害への関与に関連するヒトのデータは、文献では限られている。ある研究では、くも膜下出血患者における 12-HETE の脳脊髄液 (脳脊髄液) レベルの上昇を示し、12-HETE のレベルの上昇も外傷性脳損傷 (30, 31) に続く 脳脊髄液 で発見された。虚血性脳卒中患者での同様の測定値は、今日までに報告されていない。しかし、Yigitkanliらは、2人の脳卒中患者の脳梗塞周囲皮質で12/15-LOXの上昇を示しており、12/15-LOXがヒトでも脳卒中傷害に関与している可能性を示唆している(32)。ある研究では、華北漢人集団の虚血性脳卒中症例におけるALOX15遺伝子の多型を調査した。この研究によると、この遺伝子のrs7217186とrs2619112の多型は、男性の虚血性脳卒中症例とアテローム性動脈硬化症関連の虚血性脳卒中症例に関連していた(33)。
もう一つのデータは、大動脈、頸動脈、大腿動脈を含む動脈で12/15-LOX発現の有意な上昇が認められたヒトアテローム性プラーク研究から得られたものである(34-36)。しかし、ヒトの臨床サンプルでは、12/15-LOXの発現が高く、病変の重症度が低いことを明らかにした研究は少ない(37, 38)。特に、12/15-LOXプロモーターの位置292の多型におけるCからTへの置換は、アテローム性動脈硬化の確率の低下に関連していた。このプロモーター領域は、その増加した発現および活性を調節している（35,36）。まとめると、ヒトのデータと同様に、いくつかの細胞培養および動物モデル研究により、12/15-LOXが動脈硬化に対して二重の役割を持っていることが明らかにされている(39)。
発達中のヒト脳における12/15-LOXの関与を、20〜43週齢の受胎後症例から得られた脳室周囲白斑症のヒトパラフィン包埋組織を用いて免疫組織化学的に検討した。脳室周囲白質の局所的な壊死性病変のマクロファージ、反応性グリア症を有する周囲白質のグリア細胞、CD68陽性の活性化ミクログリア、未熟・成熟オリゴデンドロサイトで12/15-LOXの発現が認められた。この研究は、脳室周囲白斑症における損傷の炎症性メディエーターとしての12/15-LOX活性の関与、およびオリゴデンドロサイトの損傷または死を示している(40)。
12/15-LOXに関連して研究されているもう一つの疾患はアルツハイマー病（AD）である。この酵素は酸化ストレスの主要な供給源であるため、病理組織学的に明らかなアルツハイマー病患者と対照者の多様な脳領域で12/15-LOX活性とタンパク質レベルを調査した(41)。ウェスタンブロット分析と免疫組織化学的研究により、12/15 LOX の量は、対照群と比較して AD 脳の影響を受けた前頭部と側頭部で高いことが確認されたが、2 群の小脳では差がなかった(41)。AD脳では、対照群と比較して12/15-LOX（12/15-hydroxyeicosatetraenoic acids）生成物のレベルが上昇していた（41）。また、12/15-LOXの遺伝子欠失は、H2O2またはアミロイドβ試験管内試験でインキュベーション後の細胞の酸化ストレス応答の減少をもたらした。全体として、これらの結果は、12/15-LOXの代謝経路が上昇し、AD脳の酸化的不一致と関連していることを示し、この神経変性疾患の病態における12/15-LOXの関与を示唆している（41）。
12/15-LOX阻害剤
これらのヒトおよび動物モデルの生体内試験および試験管内試験研究により、多数の12/15-LOX阻害剤が検出された。多くの研究室が最近、強力で選択的なヒト12/15-LOX阻害剤を発見したが、これらの阻害剤の多くは、ノルジヒドログアイアレーチン酸、バイカレイン、トコトリエノール、およびクルクミンを含むLOXの活性部位鉄を減少させる抗酸化物質を代表する(42-46)。製薬会社の中には、最近の研究に先立って、ナノモルの低活性を持つ、最も薬物に近い12/15-LOX阻害剤を製造している会社もある(47)。これらの阻害剤は、低溶解度やLogpなどの物理的特性は控えめであったが、生体内試験での使用には薬物動態的特性も控えめであった。また、これらの阻害剤はマウス12/15-LOXとの比較評価が行われていないため、いずれの阻害剤も潜在的な創薬標的として受け入れられず、げっ歯類実験で有用なものであるかどうかは疑問である。組換えヒト12/15-LOXを試験管内試験で標的とした選択的阻害剤は、マウス12/15-LOXに対してex vivoで活性であることが示されており、急性期脳卒中の新たな治療法の選択肢と考えられている。したがって、12/15-LOX阻害薬は急性期脳卒中の第一選択薬として救急車の中でも使用可能であり、安全性を高めるためにtPAと併用することも考えられる。また、12/15-LOX阻害薬は、抗凝固関連の出血性転換（HT）モデルにおいて非常に有用な選択肢となる可能性がある。最近の研究では、C57BL6Jマウスまたは12/15-LOXノックアウトマウスに、飲料水を介して経口ワルファリンで抗凝固を行い、その後、12/15-LOX阻害剤ML351の有無にかかわらず、3時間の重度虚血または2時間の虚血とtPAの注入で一過性MCAOに曝露した(49)。本研究では、ワルファリン投与群は、両モデルにおいて、再現性のある国際正常化比レベルの上昇と意味のあるHTを発現した。しかし、12/15-LOXノックアウトマウスは重度の虚血後のHTが少なく、ML351は野生型マウスのHTを減少させた(49)。ML351は梗塞サイズを正常化した後も独立して出血を減少させた。tPA治療後のHTはML351によっても同様に減少した(49)。
合成の12/15-LOX阻害剤だけでなく、12/15-LOXを介して作用する内因性物質も脳卒中モデルで研究されている。最近の研究では、ラットの急性永久中大脳動脈閉塞モデルにおけるタウリンの神経保護効果は、12/15-LOXのダウンレギュレーションに起因する可能性があることが示された（50）。
結論
12/15-LOXは、心血管疾患、癌、炎症性疾患、アレルギー性疾患、神経変性疾患など、多くの疾患の発症に多くの影響を与える。組換えヒト12/15-LOXを試験管内試験および生体内試験で標的とし、ex vivoでマウス正体に対して活性であることが示された選択的阻害剤は、12/15-LOXに関連した急性脳卒中およびその他の脳障害に対する新たな治療選択肢と考えられる。12/15-LOX阻害剤は、急性期脳卒中の第一選択治療薬として救急車の中でも使用することができ、現在唯一の急性期虚血性脳卒中治療薬であるtPAと併用することで安全性を高めることができる。また、12/15-LOX阻害薬は、抗凝固療法に関連した出血性転化症において非常に有用な選択肢となる可能性がある。臨床研究により、神経疾患における12/15-LOX阻害薬の重要性が明らかになると思われる。