アルツハイマー病モデルマウスにおけるオートリソソームの酸性化異常は、神経細胞におけるAβのオートファジー的蓄積を誘発し、老人斑を形成する
Faulty autolysosome acidification in Alzheimer’s disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques

強調オフ

オートファジー

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pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35654956/

オンライン公開 2022年6月2日

概要

アルツハイマー病(AD)ではオートファジーが著しく低下している。我々は、神経細胞特異的なmRFP-eGFP-LC3プローブ、マルチプレックス共焦点イメージング、相関的な光電子顕微鏡を用いて、5つのADマウスモデルの神経細胞内で生体内試験でユニークなオートファジー調節障害を明らかにし、その基礎を明らかにした。神経細胞では、細胞外アミロイドが沈着するかなり前にオートリソソームの酸性化が低下し、vATPase活性が著しく低下して、拡大した脱酸性オートリソーム内に選択的にAβ/APP-βCTFが蓄積していることが明らかになった。さらに悪化した、まだ無傷の神経細胞では、大量のAβ陽性オートファジー空胞(AV)が、花のようなロゼットを形成する大きな膜ブレットに詰め込まれている。このユニークなパターンはPANTHOS(毒のあるアントス(花))と呼ばれ、ADの脳にも存在する。さらにAVは膜管の核周囲のネットワークに合体し、そこに線維性βアミロイドが内部で蓄積する。リソソーム膜の伝染性、カテプシン放出、リソソーム細胞死が起こり、ミクログリアの侵入を伴う。定量的解析により、アミロイド前駆体タンパク質のADモデルにおいて、PANTHOSを示す個々のニューロンが老人斑の主要な発生源であることが確認された。

はじめに

オートファジーは、リソソーム分解の主要な経路であり、不要になったタンパク質やオルガネラを恒常的に排出することで細胞の恒常性を維持する。オートファジーは、疾患や細胞ストレスによってさらに誘導され、異常なタンパク質や凝集体、損傷した小器官を除去する1-4。オートファジーには、基質を隔離し、リソソーム(LY)へ運ぶためのいくつかのメカニズムがある。主要なオートファジー-リソソーム経路(ALP)であるマクロオートファジーでは、伸長する二重膜が細胞質を包むか、アダプタータンパク質を介して特定の標的基質を取り込み、オートファゴソーム(AP)を形成して閉じられる。APはLYあるいはエンドリソソームと融合してオートリソソーム(AL)となり、様々なカテプシンプロテアーゼ、その他の酸加水分解酵素、そしてAL内腔を酸性にして加水分解酵素を活性化するプロトンポンプであるvATPaseが導入され、成熟化する。LYは、ADの原因遺伝子産物や危険因子の標的であり5,その中には、エンドソームやオートファジー経路で活発に生成され、LYによってほとんど除去されない病原性アミロイド前駆体タンパク質(APP)の代謝物APP-βCTFとAβ6が含まれている7。

ADは、細胞内のタウ凝集体(神経原線維変化)と、局所的に膨張した神経突起(ジストロフィー)8,細胞外のβ-アミロイドおよびその他多くのタンパク質からなる神経斑という2つの病変によって神経病理学的に定義されている9。さらに、オートファジーの基質が不完全に消化されたAVは、疾患の初期段階から患部神経細胞内に徐々に蓄積していくる5,10-12。ADにおけるオートファジー機能不全の分子的基盤、APP/アミロイド病理との関係、その病原性については、脳内のALP異常を生体内試験でモニタリングするという技術的課題もあり、明らかではない。そこで、我々は、APおよびAL13に選択的に結合するオートアジーのアダプタータンパク質であるLC3(mRFP-eGFP-LC3またはtfLC3)をニューロン特異的に発現させたトランスジェニックマウス(TRGL)を作製し、そのプローブを用いてADのオートアジーを観察した。このプローブを用いることで、無傷の脳における神経細胞 ALP の個々の小胞構成要素を調べることができ、私たちの知る限り初めて、AD マウスモデルにおいて疾患進行に伴う神経細胞の AL 酸性化をレシオメトリックに評価することが可能となった。

ADに関連するALPの欠損を同定し、モニターするために、TRGLと早期発症または後期発症の病態を持つADモデルマウスを交配させた。5種類のADモデルマウスすべてにおいて、リソソームvATPase活性の早期欠損、脆弱なニューロン集団におけるオートファジー機能不全、細胞外βアミロイド沈着よりもかなり前に貧酸性のAL(pa-AL)内に選択的にAPP-βCTFとAβが蓄積していることが示された。さらに、我々は、ペリカリア内のAVの劇症的な増殖と、Aβ/APP-βCTFで満たされたAVで満たされた大きな膜ブレットの形成によって特徴付けられる、より損なわれたニューロンにおける独自のオートファジー・ストレス反応を同定した。DAPI陽性の核を取り囲む強い蛍光性の花びら状のブレットは、我々が「PANTHOS」(毒花)と呼ぶ花のようなプロフィールを形成している。注目すべきは、AVと小胞体の融合により、核を囲む管状ネットワークにβアミロイド線維が管内形成され、無傷の神経細胞内にコア付きアミロイドプラークの形態的特徴をもたらすことだ。広範なイメージングと組織化学的手法を駆使してPANTHOSニューロンがADマウスモデルにおける老人斑の大部分を形成することを定量的に証明し、ADにおける老人斑形成の従来からの順序に再考を促した。

研究成果

生体内ALP機能異常の検出

THY-1プロモーターによるtandem mRFP-eGFP-LC3トランスジーン(tfLC3)は出生後、神経細胞に特異的に発現する。tfLC3は内因性LC3レベルの約1倍発現し、ALP13には検出可能な影響を及ぼさない。内在性 LC3 と同様に、tfLC3 は AP 膜に結合し、AP-LY 融合後も AL 内で分解される内在性基質として存続し、最終的に無蛍光の LY を生成する。AP上のtfLC3はAPの中性pHでは黄緑色(eGFP/mRFP)に蛍光を発するが、LY14との融合によるAL成熟でALが酸性化し、pH6.0以下でeGFP蛍光が消光し黄色からオレンジ、そして赤へと蛍光シフトする(ref.15)。蛍光性LC3のオートファジックスクリアランス後または新しいLYの生合成後のLYは、第3の蛍光体でタグ付けされたLYマーカー(例えば、カテプシンD(CTSD)またはLAMP 2)で免疫組織蛍光法(IHF)標識により可視化することが可能である。注目すべきは、この第三の蛍光体は、黄色に蛍光するAPと、LYと融合してカテプシン陽性であるが十分に酸性化できず、したがってtfLC3標識のみによって黄色に蛍光するAPを区別することもできる(図1a1a)13,14。後者のプロファイルは、pa-ALに分類される。

図1TRGLマウス脳におけるデュアルタグオートファジーセンサーの設計と発現

a, tfLC3の色調変化の模式図。センサーはpH抵抗性のmRFP、pH感受性のeGFPおよびLC3から構成される。酸性環境はeGFPシグナルの消光を誘発し、その結果、正味の黄色シグナルは赤色のみのシグナルに変換される。LYマーカー(擬似青色)との組み合わせにより、完全酸性化AL(AL)および貧酸性化AL(pa-AL)はそれぞれ紫色または白色を生じる。 b, 一次ニューロンにおけるtfLC3蛍光の変化。AP(二重矢印)は軸索の遠位レベルに、pa-AL(アスタリスク)はより近位レベルに見られたが、完全酸性化AL(矢印)は主にペリカリオン付近または中に位置していた。 c, 細胞骨格マーカーMAP2と共ラベルしたTRGLマウスの新皮質V層神経細胞の代表蛍光画像。矢印は完全に酸性化したAL(エーエル)を示す。スケールバー、10μm。 d、TRGLマウス脳におけるリソソーム酸性化変化条件下(CQ)でのtfLC3蛍光変化の代表的な蛍光画像。矢印はALまたはpa-ALを示す。スケールバー:20μm b-d, 実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。


APの成熟と酸性化は、TRGLマウスの初代神経細胞培養における逆行性軸索輸送中にAPからALへの移行が長引いたときに最も容易に理解される(図1b).1b)。無傷の成熟脳では、AV は生体内ではかなり少ない16。完全酸性化したALは、神経細胞内のペリカリアや樹状突起近位部に集中している(図1c,1c,矢印部分)。ALは新皮質ペリカリアの3つの蛍光色素(RGB)分析で紫色に蛍光し(赤と青の組み合わせ)効率的なペリカリア酸性化機構を反映している(図.1d、1d、上)。生体内でのAL/LI酸性化不全をモデル化し、生体内の無傷の脳でtfLC3プローブを検証するために、6ヶ月齢のTRGLマウスに両親媒性の弱塩基クロロキン(CQ)またはビヒクル単独(コントロール)を5日間脳室内注入し、新皮質III-V層のニューロンを画像化した(図.1d)・1d)。小胞のpHが6.0以上に上昇すると、tfLC3陽性の点群が黄色に蛍光を発する。緑/赤のチャンネルマージだけでは、これらの点刻はAPと誤認される。しかし、CTSD抗体とAlexa Fluor 647(擬似青色)二次抗体によるIHFでは、これらの点刻はCTSD陽性であり、したがって、pa-ALと同定された。3チャンネルマージでは、それらは白色(緑、赤、青色蛍光)に蛍光し(図1d,1d、RGBマージ下)正常ニューロンにおける紫色に酸性化したALと対照的である(図1d,1d、RGBマージ上)。LYはCQ後も青色のままであり、IHFによるpH非感受性検出を反映している(図(図1d).1d)。コンピュータアルゴリズム13は、それぞれの小胞について、3つの蛍光色素の相対的な寄与を色相角と彩度に基づき決定する。これは、視覚によって達成されるよりも正確な「色」(および小胞の同一性)の客観的表現である。

AL酸性化不全はβ-アミロイド沈着前に発生する

我々は、TRGLマウス13と、生後10~12ヶ月からβアミロイド斑を発症するADモデルであるTg2576マウス17を交配させた。1.6ヶ月齢のTg2576/TRGL交配体のALPパターンは単一TRGL同腹子と区別がつかなかったが(Extended Data 図1a);1a); 5ヶ月齢までに新皮質第III-V層の90%以上のペリカリアが酸性化ALに加え黄色蛍光AVを獲得した(Extended Data 図1a).1a). CTSD共標識により、黄色のAVは専らCTSD陽性であり、したがってpa-ALであることが明らかになった(図2a,2a、下段)。pa-ALはCTSBとリソソーム膜タンパク質LAMP1にも陽性だった(Extended Data図1b).1b)。新皮質におけるAVサブタイプの色相角ベースの割り当てと定量化13 により、Tg2576/TRGLではTRGL (2.1 ± 0.3) に比べて4倍多くのpa-AL (9.0 ± 0.5/ neuronal cross-section) が、著しく少ない成熟AL (4.4 ± 0.4 vs 6.6 ± 0.3/ neuronal cross-section) (図 2b)、pa-ALとALのサイズが増加した(それぞれ1.3 ± 0.04 対 0.48 ± 0.03 および 1.75 ± 0.09 対 0.74 ± 0.05)(図 (図2c).2c).12ヶ月までに、Tg2576/TRGLではperikaryal pa-ALがさらに増加した(ニューロン断面あたり17.2±0.7)(図2e,f)。Tg2576脳におけるAL酸性化障害をさらに明らかにするため、OptiPrep密度遠心法によりAL/LI濃縮画分を単離し(Extended Data 図 図1c)1c) 、そのATPase活性をアッセイした18. 観察されたpHの欠損と一致して、6ヶ月齢のTg2576のLY/ALにおけるvATPase活性は、年齢を合わせた野生型(WT)同腹子のそれと比較して減少し(65.6±4.1%)Tg2576マウス脳では12ヶ月までにさらに減少した(WTに対して45.3±3.7%)(図 2g)。ATPase活性は、ADの他の2つのマウスモデル(5xFADとAPP51)の脳でも同様に減少した(Extended Data 図1d).1d)。時間経過グラフは、vATPase活性が低下する一方で、pa-ALが年齢依存的に増加することを示している(図2h2h)。

図2 AL酸性化障害はADモデルマウスで早期に発症し、加齢とともに進行する。

 

a, 5ヶ月齢のTRGLおよびTg2576/TRGLマウス脳の新皮質神経細胞におけるCTSDと共標識したtfLC3の代表的な蛍光画像。ALはCTSDの共標識がない場合とある場合でそれぞれ赤色または紫色を示し、pa-ALはCTSDの共標識に依存してそれぞれ黄色または白色のシグナルを示す。b, 5ヶ月齢のTg2576/TRGLにおけるpa-ALsの数は、TRGL同腹子の神経細胞と比較して増加している。d, 6ヶ月齢の雄のTg2576のリソソームvATPase活性は、WT同腹子新皮質と比較して低下している。f, 12ヶ月齢のTg2576/TRGLにおけるpa-ALsの数は、TRGL同腹の新皮質ニューロンおよび5ヶ月齢のTg2576/TRGLと比較して増加している。g, リソソームvATPase活性は、12ヶ月齢の雄Tg2576ではWT同腹子と比較して減少している(6ヶ月齢のTg2576よりも大きい)。vATPase活性:n=3(1.6ヶ月、5ヶ月)n=5(12ヶ月)。pa-AL:n=243(1.6ヶ月)n=245(5ヶ月)n=213(12ヶ月)。定量的データは、平均値±s.e.m.、対応のないt検定、両側P値で示される。 a, e, 実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。Extended Data 図も参照。mo, month; rel., relative.

 


Tg2576/TRGLマウス脳におけるオートリソソーム酸性化障害の早期出現

a. a. 2つの年齢におけるTRGLマウスとTg2576/TRGLマウスの新皮質第V層ニューロンの代表的な蛍光画像。1.6ヶ月齢の神経細胞周囲は両遺伝子型とも正常に見えたが、Tg2576/TRGLでは5ヶ月齢までに黄色のtfLC3点刻が蓄積した(矢印)。スケールバーは20μm(左)または50μm(右)。b. 5ヶ月齢のTRGLおよびTg2576/TRGLマウス脳の新皮質ニューロンにおける、CTSBまたはLAMP1と共標識したtfLC3の代表的蛍光画像。pa-ALは共標識したリソソームマーカーに応じて白いシグナルを示す(矢印)。スケールバー 20 μm c. リソソーム vATPase 活性測定用のリソソーム濃縮画分を 25% OptiPrep 勾配を用いて単離した。リソソーム濃縮画分(グレーのボックス;#15~#18)は、様々なオルガネラマーカーで検証された。d. Tg2576/TRGL, 5xFAD/TRGL, APP51/TRGL マウス皮質のリソソーム vATPase 活性と同胞対照新皮質の比較。WT, M 6mo (100±5.3 %), Tg2576, M 6mo (65.6±4.1 %), WT, F 6mo (100±0.8 %), Tg2576, F 6mo (56.4±1.9 %). 9 %)TRGL、F 6mo(100±4.2 %)Tg2576/TRGL、F 6mo(56.4±5.2 %)WT、M 12mo(100±3.7 %)Tg2576,M 12mo(46.8±2.8 %)TRGL、M 6mo(100±3.5 %)Tg2576/TRGL、M 6mo(100±3.5 8±2.8 %)TRGL、M 2.7mo(100±1.8 %)5xFAD/TRGL、M 2.7mo(68.4±3.2 %)TRGL、F 6mo(100±9.2 %)5xFAD/TRGL, F 6mo(49.8±4.1 %)TRGL、F 12-15mo(100±5.0%)APP51/TRGL, F 12-15mo(54.5±10.3 %). 数値は平均値を示す。定量的データは、平均値±S.E.M. unpaired t-test, two-tailed P value as indicatedで示される。

APP-βCTF/Aβは疾患の初期段階でpa-ALに蓄積される

APP-βCTFとAβは、ADにおいてβアミロイドが細胞外に沈着する前に細胞内に蓄積し、エンドソーム・リソソーム系がそれらの生成の主要な細胞内部位である19-21。Tg2576マウスにおけるAPP-βCTF/Aβの細胞内蓄積と初期のAL酸性化障害とを関連づけるために、APP-βCTFおよびAβを検出するモノクローナル抗体(JRF/AβN/25)を用いてAVサブタイプ内のAPP代謝物の局在を確認した22。5ヶ月までに、Tg2576/TRGLマウスのIII-V層新皮質周囲の40%にAβ/APP-βCTF陽性の点刻が見られ(図3a)これはCTSD共免疫標識と4つの蛍光色素のイメージングからほぼpa-ALのみであった(図3a,3a、矢印、図3b)。Tg2576脳からの細胞内画分に対するイムノブロット解析により、LC3-IIに富むAV画分には、豊富なAPP-βCTFのほか、γセクレターゼ成分(プレセニリン1およびニカストリン)(図3c)とAβ(拡張データ図2a)・2a)も含まれていることが確認された。AVにおけるAβの局在は、Aβ1-42抗体(JRF/cAβ42/26)によりさらに検証された(Extended Data 図2b,2b、矢頭)。また、AVにおけるAPP-βCTFの局在は、APP-βCTF上の異なるエピトープ(N末端またはC末端)に対する2つの一次抗体を含む修正Duolink技術(方法)を用いたin situ近接ライゲーションアッセイ(PLA)によりさらに検証した(3d)。PLA蛍光(赤)は、APPswe過剰発現N2A細胞およびTg2576ニューロンにおいて、コントロールに比べてかなり高いレベルでAPP-βCTFを検出した(図3e,3e,矢頭,および拡張データ図2c,d)。特に、PLAシグナル(青色)により、APP-βCTFはTg2576/TRGLペリカリアにおいて酸性化が不十分なALに選択的に集積することが明らかになった(92.9 ± 1.3%, n = 50 neurons)(図3f3fおよびExtended Data 図 2e-g))。

図3 ADマウスのpa-AL内に選択的に蓄積する神経細胞内APP-βCTF/Aβ

 

a, 5ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳神経細胞を、APP-βCTF/Aβに対するCTSD抗体とJRF/AβN/25抗体で共蛍光標識したもの。APP-βCTF/Aβは拡大したpa-ALsに蓄積して白いシグナルを発するが(矢印)LYsには存在しない(矢頭)。b、5ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳のニューロンにおけるJRF/AβN/25免疫反応に陽性なALおよびpa-ALサブタイプの割合。バイオリンプロットの色は穿刺の色に対応する(白:pa-AL;紫:AL)。定量的データは平均値±s.e.m.、unpaired t-test、両側P値で示した。 c, 10ヶ月齢Tg2576マウスのAV分画。5匹のマウスの脳をプールして分画を得た。d, APP-βCTF N-末端をJRF/AβN/25,APP-βC-末端をAPPcを用いて行ったPLAの模式図。 e, N2A-APPswe細胞および10ヶ月齢Tg2576マウス脳からのPLA蛍光の代表画像をWTコントロールと比較した。矢印は、APP-βCTFのPLAシグナルを示す。f、Tg2576/TRGLマウス脳からの代表的なPLA蛍光画像。PLAシグナルはpa-ALと共局在化し、白い点刻を生じた。スケールバー、20μm。a, c, e, f, 実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。Extended Data 図も参照。図22. IHC, immunohistochemistry; mo, month.

 

ADマウスのpa-AL内に選択的に蓄積する神経細胞内APP-βCTF/Aβ

 

a. 10ヶ月齢のTg2576マウスから得られたAV分画。分画はオルガネラマーカー(リソソーム:CTSD、ミトコンドリア:Tom20,ER:SEC61B、AV:p62)および抗Aβ抗体4G8で検証した。b. 5ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳神経細胞をAβ1-42に対する抗体(JRF/cAβ42/26)と共に免疫蛍光法で標識したもの。Aβは肥大したpa-ALに蓄積し、白いシグナルを発する(矢頭)。実験は独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。スケールバー20μm。(c) N2A-APPswe細胞(N2a (0.9±0.2), N2a APPswe (19.6±1.1)) および (d) 10ヶ月齢Tg2576マウス脳からのニューロンあたりのPLA蛍光をWT対照と比較した定量化グラフ。WT (1.4±0.1), Tg2576 (6.9±0.5). n=50 cells per each. e-g, 10ヶ月齢のTg2576/TRGLのニューロンあたりのPLA蛍光の定量化グラフ. TRGL(1.2±0.1)Tg2576/TRGL(6.2±0.3)。(f)1ニューロンあたりのpa-ALにおけるPLAシグナルの数。TRGL-pa-AL(0.1±0.0)Tg2576/TRGL-pa-AL(5.8±0.2)。(g) WTコントロールと比較したニューロン内のpa-ALにおけるPLAシグナルのパーセンテージ。TRGL-pa-AL (6.7±3.4 %), Tg2576/TRGL-pa-AL (92.9±1.3 %). n=50 cells. 定量的データは、平均値±S.E.M. unpaired t-test、両側P値で示した。 a-d:実験は独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。

 

進行性の神経細胞はpa-ALを大量に蓄積する

10ヶ月齢のTg2576/TRGLマウスでは、新皮質神経細胞(第III-V層)の亜集団が、細胞膜を外側に膨らませたpa-ALを大幅に蓄積し始めた(図4a,4a、拡大右パネル、矢頭)。LC3陽性小胞のさらなる大量増殖は、細胞膜から突出した大きな強い蛍光を発する膜ブ レブの形成を伴い、核周囲を拡大した。LC3蛍光のない中心核領域(図4a)4aは、DAPI、ヒストンH3またはラミンA/Cなどの核マーカーで標識できた(図4b,c)。この核領域で自家蛍光がないことから、DAPIシグナルがアミロイドによる非特異的自家蛍光である可能性は排除された(Extended Data 図3a).3a)。患部近傍のAVの多くはIHFによりLY-marker陽性であり、pa-ALであることがわかった(図4d4d、Extended Data 3b)これはAL成熟と酸性化の深刻な欠損を反映していると考えられる。

図4 tfLC3プローブは、5つの異なるADマウスモデルにおいて、オートファジックスレス、AL pH欠損、細胞膜漂白(’PANTHOS’)のユニークなパターンを明らかにする。

a, 10ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳の代表的なtfLC3蛍光画像で、PANTHOSの3段階の神経細胞を示す(i:ALにおける初期のpH変化、ii:pa-ALが拡大・増殖することによる局所的な細胞質膨張(矢じり)iii:完全PANTHOSパターン(矢印))。(これらのステージのグラフィック表現はExtended Data 図図8を参照)8)。コントロールのTRGLニューロン(aの5番目のパネル)は、完全に酸性化したALを示す。b, 10ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳における核マーカー(DAPI)を用いたPANTHOSニューロンの染色(Scale bar, 20 μm). c、10ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳における核マーカー(ヒストンH3およびラミンA/C)を用いたPANTHOSニューロンのIHF染色。スケールバー、10μm。Extended Data 図22も参照。d, 10ヶ月齢のTg2576/TRGLマウス脳におけるLYマーカー(CTSD)のIHF染色. e, PANTHOSパターンは4つのADマウスモデルで保存されている。雄の5xFAD/TRGL(2.7ヶ月)雄のTgCRND8/TRGL(1.9ヶ月)雌のPSAPP/TRGL(3.1ヶ月)雌のAPP51/TRGL(20ヶ月)を画像化した。スケールバー、10μm。a-e, 実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。Extended Data 図も参照。図33. PM、細胞膜。

 

5xFAD/TRGLマウスの脳におけるPANTHOSの神経細胞特異的起源と年齢・性別によるPANTHOSニューロンの増殖

 

a. PANTHOSニューロンは、神経細胞集団、特に細胞体を検出するニューロン特異的エノラーゼ(NSE)で免疫標識され、DAPIで対比染色された。NSE IHCは、PANTHOSニューロンがNSE陽性であることを示す。2.7ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳でDAPIカウンター染色を行わない場合、UVチャネルはPANTHOSニューロンからの自家蛍光を生じさせなかった。b. 2.7ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳で、PANTHOSニューロンをリソソームマーカーCTSBとLIMP2で免疫標識した。c. 5xFAD/TRGL雌雄マウスの3つの年齢における大脳皮質でのtfLC3シグナルは、PANTHOSニューロンの年齢および性別による増殖を示した。 d. 5xFAD/TRGL雄マウスの2.7ヶ月齢の大脳皮質におけるPANTHOSニューロン分布の概観(上)およびデュアルチャネル高倍率(下)。e. 各種ADマウスモデルにおけるPANTHOSプロファイルの年齢依存的な有病率の増加。5xFAD/TRGL:1.6カ月(0±0)2.7カ月(2340±33.8)6カ月(767±62.3);Tg2576/TRGL:5カ月(0±0)9カ月(700±2.1)12.6カ月(24.3±3.2);APP51/TRGL:13カ月(0±0)20カ月(300±0.4)25-26カ月(48.3±12.2)。データポイントはマウス番号を示し、mo.は月齢を示す。定量的データは、平均値±S.E.M.として示される。


我々は、神経病理学的発症が加速したモデル(5xFAD、TgCRND8およびPSAPP)または発症が遅れたモデル(Tg2576およびAPP51-hAPPwtを発現する例外的に遅発性のモデル)23を含む5種類のADのマウスモデルにおいて同一のオートファジー神経変性パターンを観察した(4e).4e)。5xFAD/TRGLマウスは、Tg2576やAPP51マウスよりも早期に(性別により2ヶ月以降から)24-26で強固なALP破壊と神経細胞変性を起こし(Extended Data 図3c-e)再現性の高いパターンで発症する(Extended Data 図3e.3e.)。我々は、このモデルを用いて、LC3陽性膜ブレットの発生と定量的アミロイドプラーク病理を含む疾患進行との関係についてさらに検討を行った。我々の知る限り、神経変性状態において、さらに超微細構造的に定義された同様の巨大なAV-filled perikaryal membrane protrusion(図5),5)は、これまで報告されていない27)。中央のDAPI陽性核を囲む大きな蛍光斑のロゼットが花びらのように見えることから、このユニークな変性過程をPANTHOSと名付け、罹患細胞をPANTHOSニューロンと呼んでいる。

図5 ADマウスモデルにおけるPANTHOSニューロンの超微細構造的特徴。

 

PANTHOSニューロンの共焦点画像で、ペリカリオンから生じるテーパーネックを持つ多数のtfLC3陽性(AVで満たされた)ブレットを示す。Nは核の領域を示す。Extended Data 図も参照。図44. b, PANTHOSニューロンの代表的なEM画像。AVで満たされたブレットがperikaryal細胞膜からperikaryal細胞質(矢印)と連続したネックを介して突き出ている。2.7ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウスの脳。c、5ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳のPANTHOSニューロンのEM画像。スケールバー、5μm。Box i: AVで満たされた末梢の形質膜の出血(出血膜の境界:矢頭)。スケールバーは2μm。Box ii:組み込まれたAV(黄色矢印)を含む放射状の膜結合性管状伸長部(赤色矢印)の中心部に位置する電子密度の高いネットワーク。スケールバー、1μm。 d、AVと管状伸長部の間の空間的関係のEM画像で、その中に細い繊維束が見える(水色の矢頭:AV/管状伸長部)。スケールバー:500 nm。cとdの全解像度画像はExtended Data 図として掲載。図55 e, PANTHOSニューロンの細胞膜から伸展する代表的なperikaryal blebs。PS/APPマウス脳、AL/LYのマーカーである酸性フォスファターゼ(ACPase)細胞化学による標識で、劇症型オートファジー病理(主にAL)がブレットに分離されていることがわかる。スケールバー、5μm。Box i: ROI領域(箱)の拡大EM像。bleb(白矢印)と長い細胞質ネック(黄色矢印で囲む)を示す。f、2.7ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳のシリアルSEMイメージングに使用したROI(ボックス)の免疫組織化学画像である。スケールバー、40μm。 g、ROI領域のz-スタックシリアルSEM画像、370-430。スケールバー、40μm。矢印は関心のあるPANTHOSを示し、矢頭は調整された基準PANTHOSを示す。IMODモデリングを用いたブレーブトレース(h)およびPANTHOSの3D再構成(i)。実験は独立して3回(a-e)または2回(f-i)繰り返され、同様の結果が得られた。補足図1およびビデオ1も参照。

PANTHOS-ADにおける神経変性のユニークなパターン

tfLC3プローブによるオートファジックスプロファイルの高い解像度により、PANTHOSニューロンのペリカリオン細胞質からペリカリオンの中心に向かって細くなるネックを介して直接伸びるAV充填ブレットを共焦点イメージングで可視化できた(図5a5aおよび拡張データ図4))4. 5xFAD/TRGLマウスの脳を用いた電子顕微鏡(EM)解析により、blebとperikaryal細胞質の連続性を確認し、bleb内の主要構成要素としてAVを特定した(図5b).5b)。ブリーブはPANTHOSニューロンのソーマから伸びる長い膜結合ネックを示す(図5c,5c, box i, outline with arrowheads)。より高いEM分解能でのPANTHOSニューロンのその他の特徴として、部分的に融合したAVと完全に組み込まれたAVを含む放射状の膜結合性チューブ状伸長部の中心部にある電子密度の高いネットワークがある(図5c,5c、ボックスii:黄色の矢印、および拡張データ図))。図5a,5a, inset: yellow arrowheads)と共に、強いAβ免疫反応を示す6nm線維の束(図5c,5c, box ii, and Extended Data 図 他のEM画像では、AVとAβ陽性の繊維を含む管状伸展部が融合する過程にあることが見られる(図.5d5dおよびExtended Data 図5b,5b、水色の矢頭)。

図6 ADモデルマウスの脳内PANTHOSニューロンにおけるニューロン内βアミロイドの付加と分布の進化。

 

a, 2.7ヶ月齢の雄の5xFAD/TRGLマウスの脳神経細胞をAPP-βCTF/Aβに対するJRF/AβN/25モノクローナル抗体でIHF共標識したもの。スケールバー、10μm。 b、Aβ(4G8)のIHF標識とDAPI染色。PANTHOSニューロン内の可視DAPI陽性核を囲む核内Aβ蓄積。挿入図は、PANTHOSニューロンのブリード内のAβを示す。スケールバー、10μm。4G8抗体を用いたDAPI標識PANTHOSニューロンの免疫蛍光染色と蛍光強度解析。PANTHOSニューロン内に蓄積された核周囲のAβ。統合画像の白線はPANTHOSニューロンのスキャン経路を示し、そこから各蛍光色素の蛍光強度を空間的に決定している。d, 代表的なAβ IEM (3D6)画像は、PANTHOSニューロン(薄いピンクに着色)のPMの広範なAV充填ブリービングを示し、比較として、5ヶ月齢5xFAD/TRGLマウス脳のDNと暫定的に同定された2つのプロファイル(青色に着色)である。スケールバー:10μm。Box iは、血球内のAβ免疫反応性AVを示す。Box iiは、Aβ免疫反応と中央の核領域との重なりを示す。この領域には、強いAβ免疫反応を示す放射状の膜結合性管状伸展の電子密度の高いネットワークも表示される。黄色の矢印は、中央のアミロイド陽性ネットワークに取り込まれたAVを示す。e、代表的なアミロイド(3D6)IEM画像。水色の矢印は小胞とアミロイド束の接触部位を示す。a-d, 実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。スケールバー、1μm。Extended Data 図も参照。図66. PM、細胞膜。

図4で示した5xFAD/TRGLマウス脳のPANTHOSニューロンのトモグラフィレンダリング。図5a5a.

PANTHOSニューロンの花形構造を示すシリアルzスタック画像(厚さ1μm、番号z1-z6)。この神経細胞は、2.7ヶ月齢の雄の5xFAD/TRGLマウスの大脳皮質V層からのものである。スケールバー10μm。実験は独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。

 図5 の高分解能EM画像。図55のパネルから、強いAβ/APP-βCTF IRのチューブ状の中央核周辺ネットワークを持つAL融合の寄与が明らかになった。

 

a. 図5c-iiの拡大EM画像。繊維束(赤矢印)を含む膜状管状ネットワークと連続する黄色の矢印で示されたAV。スケールバー1μm。 b. 図5d5dの全解像度画像。b. 図5d5dの全解像度画像。AV(黄色の矢頭)と管状ネットワーク(水色の矢頭)の連続性がより詳細に示されている。c. 2.7ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳における神経細胞骨格タンパク質NFLおよびリソソーム(CTSB、LAMP2)に対する抗体を用いたIHF標識。PANTHOSニューロンから末梢に突出したNFL陽性の膨潤突起は、NFLの信号が検出されない灌流斑と対照的であり、NFL突起はジストロフィー軸索であることがわかる(矢印)。d. 6ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳における神経細胞骨格タンパク質NFLを用いたIHF標識。NFL陽性の膨潤したDN様プロファイルは、PANTHOSニューロンの周辺に特徴的に存在する。e. PANTHOSニューロンの形態学的に識別できなくなった核の領域で、核マーカー(KDMA/LSD1)に対する強い免疫標識のIEM検出(ボックス挿入の青矢印)。スケールバーは5μmと1μm(拡大ROI)。実験は独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。

リソソーム酵素である酸性フォスファターゼ(ACPase)を組織化学的に標識した脳切片のEM分析により、ブレブ内のほとんどのAVが、ブレブと変性したペリカリオンの細胞質をつなぐテーパーブレブネック内のものを含め、強くACPase陽性のALであることがさらに確かめられた(5e,5e,挿入図:黄色の矢頭))。ブリーブの非対称な形態とその明らかな細胞質由来により、ブリーブはDNと区別されるが、ブリーブはさらに、ニューロフィラメントに富み、IHFで示すようにリソソームマーカー(CTSDとLAMP2)の弱いシグナルを示し(拡張データ図5c、5c、矢印)PANTHOSニューロン周囲のブリードと比較して頻度は少ない(拡張データ図5d、5d)。

AVで満たされた多くのブリービングプロファイルのperikaryal起源をさらに確立するために、Apreo走査型電子顕微鏡を用いた連続ブロック面走査EMイメージングとともに相関光電子顕微鏡法(CLEM)を実施した。500枚以上のz平面画像を再構成したところ、PANTHOSニューロン全体が3次元で再現された(補足図1および動画1)。関心領域(ROI)面積の370から430までのEM画像シーケンスを積み重ねると(図5f)初期段階のPANTHOSプロファイルの大きさは正常神経細胞と近似しているが(図5g)これらのプロファイルは神経周囲出血がより広範囲になると周囲が拡大する(図5h)ことが確認された(図.5f)。PANTHOSニューロンのDAPI陽性中央部は、積層EM像の電子密度の高い中央部のサイズに近似している(図(図5g).5g)。核マーカーKDM1/LSD1を用いた免疫EM解析では、核の完全性が広範囲に破壊された後でも、同じ中心領域に強い免疫反応性が検出され、中心領域に核の残骸が存在することが確認された(拡張データ図5e).5e)。これらの連続切片を通した動画では、フルセットからの着色した切片に示すように、ペリカリオンから大きな球根状の突起(bleb)に広がる先細りの首から細胞質内に生じる数十のAV充填膜のblebが明確に可視化された(補足動画1)(図5h).5h)。3D再構成モデリングでは、ペリカリオンの広範なブリービングが示されている(図(図5i5i))。

PANTHOSニューロンはアミロイド斑の主要な起源である

5xFAD/TRGLマウスでは、Tg2576マウスと同様に、βアミロイド斑が出現する前にAβとAPP-βCTFがpa-ALs内に選択的に蓄積する(図6a,6a、矢頭)(図3)。神経細胞のPANTHOSパターンへの移行は、核周囲のAβ/APP-βCTF免疫反応の強固な付加を伴っている。これらのPANTHOSニューロンをDAPIと抗β-アミロイド抗体(4G8)で共標識すると、最も影響を受けたペリカリアの中心でDAPI陽性の核の残骸を囲む4G8陽性のコロナが確認できた(6b.6b)。βアミロイドの付加に関するPANTHOS形成の進行は、晩発性ADマウスモデルAPP51でさらに確認された(Extended Data 図6a-c)。

 図6 ADマウスモデル脳におけるアミロイドに関連したPANTHOS形成の進行とアミロイド繊維ネットワークIEM特性評価。

a. 28ヶ月齢のAPP51/TRGL皮質V層ニューロンのLYマーカー(CTSB)とAPP-βCTF/Aβに対する3D6モノクローナル抗体によるIHF標識。初期のZ-スタック(拡張データ図7a)7aの代表面:正常な外観の細胞(pa-AL、黄色矢印)のCTSB陽性ペリカリーpa-ALおよびブリード形成細胞(ブリード、白色矢印)のそれらに3D6が蓄積している。) b. LY膜マーカー(LAMP2)CTSBおよび3D6を用いた30ヶ月齢のAPP51皮質V層ニューロンのIHFラベル化。中間段階の代表的な単面(上段)およびZスタックシリーズ(1mm厚のz1-z3,2~4段目):正常な神経細胞周囲の形態を持つ3D6陰性の神経細胞(矢印および各シリーズ)とは対照的に、変性した神経細胞の周囲突起から生じたLAMP2およびCTSB2陽性のブレットに3D6が蓄積している(矢頭および各シリーズ)。c. 28ヶ月齢のAPP51/TRGL皮質V層ニューロンのCTSBと3D6によるIHF標識。成熟したPANTHOSニューロンのpa-ALを含むブレットにおいて3D6がCTSBと共局在化し(矢頭)初期段階(pa-AL)で見られたような3D6とCTSB免疫反応性の空間分離が維持される。フィラメント状/繊維状の3D6シグナルもPANTHOSの中心から発せられる。d. 5ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳におけるAPP-βCTF/Aβ(4G8)のIHF標識。後期PANTHOSニューロンの代表的なIHF画像で、核内DAPI蛍光が薄れたり消えたりしている中心部を占めるニューロン内Aβを有する。e. 5ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳の代表的なアミロイド(3D6)(つまり、図6f),6fに示したものの全景画像)アミロイド(4G8)AV(LC3)AL/LY(CTSD)IEM画像。黄色の矢印はAVを、赤色の矢印はアミロイド束を示す。スケールバーは1μm(3D6,CTSD)500nm(LC3)。実験は独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。

5xFAD/TRGLマウスでは、PANTHOSニューロンの中心部の定量的なスペクトル解析により、DAPI蛍光と4G8免疫標識による蛍光を識別した(図6c).6c)。PANTHOSのさらに進行した段階では、より多くのβ-アミロイドが中心部に蓄積するため、DAPI蛍光は徐々に消失する(Extended Data 図6d).6d)。超微細構造および3D6免疫電子顕微鏡(IEM)分析により、このAβ免疫反応(図6d)6d)の中心部への集積は、神経細胞内の膜状管状プロファイル(図6d、6d、ボックスi))に局在していた。これらの同じプロファイルの多くで、幅が約10 nmの3D6陽性の線維の束が、線維性βアミロイド28の既知の直径に近似していた(図6d,6d, box ii)。のPANTHOS形態に類似している。図5b,5b, PANTHOSニューロンの3D6によるAβ IEMでは、さらに3D6陽性のAVがperikaryal blebsに詰まっていることが検出された。また、細胞周囲のAVは、膜管構造の中央のAβ陽性ネットワークと連続し、そこに組み込まれていることが示された(図6e6eおよびExtended Data 図 図6e6e (3D6 and 4G8 IEM))。LC3またはCTSDのいずれかの抗体を用いたIEMにより、これらの液胞がAVであることが確認された(Extended Data 図図6e).6e). AD脳ではオートファジーの誘導が高いままであるため、AP膜成分の重要な供給源であるERは、新しいAPに膜を供給するためにますます動員される29。しかし、AVの蓄積により利用可能な膜源が枯渇すると、APP-βCTF/Aβの生成の主要な源として、APPに富むERおよびゴルジ膜がエンドソームに加わることになる。したがって、ERとゴルジ体はアミロイド線維ネットワークの拡大に重要な役割を果たし、膜とβ-アミロイド前駆体の両方を提供することでAP/AL形成を支えていると思われる。

PANTHOSがアミロイド斑の主要な供給源であることと矛盾しないように、5xFAD/TRGLマウスでβ-アミロイドを3D6で免疫標識すると、個々のPANTHOSニューロンと個々のアミロイド斑の間に排他的共起と一対一の量的関係が見られた(図7a).7a)。すべてのPANTHOSニューロンが3D6陽性であり、脳内の全3D6シグナルの91.7±0.01%がPANTHOS病変で検出された(n = 3マウス、105ニューロンおよび94病変をカウント)(図 (図7b).7b).さらに、2.7ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウスの大脳皮質におけるPANTHOS病変の91.4 ± 1.29% (n = 6, マウスあたり2切片)で、核周囲中心部の凝縮または断片化/拡散シグナルを含むDAPI陽性の核シグナルが検出された(図 (図7d,7d, top graph))。6ヶ月齢のマウスでは、グリアが侵入し神経変性が進行しているにもかかわらず、PANTHOSニューロンの67.8%が依然としてDAPI核シグナルを示した(図7d、7d、下グラフ)。核マーカーであるKDM1/LSD1を用いた免疫電子顕微鏡解析では、核の完全性が失われた後でも核の残存が認められたため(拡張データ図5e)この割合は過小評価であると考えられる(同図5e)。したがって、PANTHOS、細胞内核周辺へのAβ蓄積、アミロイド斑形成の間の時間的および1:1の空間的関係は、アミロイド斑の大部分が対応する個々のPANTHOSニューロンから発生することを示している。無傷の有核PANTHOSニューロンから、グリア細胞の侵入に伴うDAPIの消失というより進んだ段階への移行は、おそらく細胞の完全性の喪失と細胞外プラークへの転換を表していると思われる。

図7 PANTHOSの神経変性は、β-アミロイドプラークの形成とそれに続くリソソーム神経細胞死と一致している。

a, 5xFADマウス(2.7ヶ月齢の雄)におけるアミロイド斑の出現を検出するAβ抗体3D6は、PANTHOSニューロンの存在と一致していることを実証している。b, 3D6陽性PANTHOSニューロンの定量的割合(上)およびPANTHOSと関連する3D6陽性プラーク中のPANTHOSの割合(下)-PANTHOSあり(91.7 ± 0.5%), PANTHOSなし( 8.3 ± 0.5%)-3D6あり(100%)。 5%)3D6あり(100±0%)3D6なし(0±0%)。c、DAPI染色は、PANTHOS発生の様々な段階と検出可能なDAPIの最終的消失(必ずしも核マーカーIRではないが;拡張データ図5参照)を描いている。 e).5e)を参照。正常なDAPI標識核(二重矢印)凝縮したDAPIシグナル(一重矢印)非常に進行したPANTHOSニューロンにおける検出不能なDAPI(矢頭)。スケールバー、10μm。 d, 2.7ヶ月齢または6ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウス脳におけるDAPIラベルが検出可能なPANTHOSニューロンの割合。2.7 ヶ月:DAPI あり(91.4 ± 1.3%)DAPI なし(8.6 ± 1.3%);6 ヶ月:DAPI あり(67.8 ± 4.5%)DAPI なし(32.2 ± 4.5%) n = 6(1マウス2セクション、3マウス;皮質領域の94ニューロンをカウントした)。e, 2.7ヶ月齢および6ヶ月齢の5xFADおよびWT雄マウス大脳皮質における細胞質および膜・小胞画分でのリソソーム酵素の分布. 細胞質 CTSD: 2.7 ヶ月 (99.8 ± 1.9%) および 6 ヶ月 (260.4 ± 3.1%); 細胞質 CTSB: 2.7 ヶ月 (103.8 ± 1.6%) および 6 ヶ月 (238.5 ± 5.9%) n = 3 マウス/それぞれの遺伝子型。 f, 2.7 ヶ月齢 5xFAD/TRGL マウス脳神経細胞に CTSD 抗体で免疫蛍光標識。矢印は健常神経細胞における正常なCTSD陽性点刻を示す。この実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。矢印は、PANTHOSニューロンにおけるCTSDシグナルの拡散を示す。スケールバー、20μm。定量的データは、平均値±s.e.m.、unpaired t-test、両側P値で示した。

リソソーム伝染性が神経細胞死を促進する

リソソームのアルカリ化は、リソソーム膜の伝染とサイトゾルへのカテプシン放出を促進することが報告されている30。細胞質および膜・小胞分画分析により、6ヶ月齢の5xFADマウスの脳の細胞質におけるリソソーム酵素のレベルがWT同腹子の脳と比較して著しく上昇した(図7e).7e)。リソソーム酵素の漏出は、多くの神経細胞が影響を受ける若い(2.7ヶ月)脳ではなく、6ヶ月の脳で検出可能であった。さらにCTSD IHFを用いて、PANTHOSとリソソーム膜の伝染性との関連を検討した。調整した正常ニューロン(図7f,7f、矢印)と比較して、PANTHOSニューロン(図7f,7f、矢印)は、CTSDと共ラベルした5xFAD/TRGLマウス脳でびまん性のCTSD免疫活性を示した。PANTHOSニューロンはカスパーゼ3陰性であったため、カスパーゼ3を介したアポトーシス細胞死の関与を否定した(Extended Data 図7a7a)。

 図7 5xFAD/TRGL ADマウスモデルにおいて、PANTHOSニューロンはチオ-S陽性濃厚老人斑に進化している

a. 2.7ヶ月齢の雄の5xFAD/TRGLマウスの脳では、PANTHOSニューロンは抗活性カスパーゼ3抗体で陽性にならない。活性型カスパーゼ-3陽性細胞は極めて稀で、PANTHOSと重ならないが、矢頭は陽性対照として稀な非神経系カスパーゼ-3陽性細胞を同定している。6ヶ月齢、雄の5xFAD/TRGLマウス脳におけるGFP/RFPフィルターセットによるPANTHOSの代表画像(左)とGFP/RFP/DAPIフィルターによるチオS染色を追加した画像。PANTHOSのeGFP信号は減少したが、チオS染色した組織(右)では未染色の組織(左)と比較してmRFP信号は維持されている。c. ROIのデジタルオーバーレイ(図b、ボックス)により、PANTHOSプロファイルはmRFP信号のみを用いて検出可能であることが強調されている(Thio-Sの固定によりGFPは消光されるため)。6ヶ月齢、雄の5xFAD/TRGLマウスの大脳皮質では、ごく一部のPANTHOSがチオ-S陰性(矢頭)であるのに対し、大多数はチオ-S陽性(矢印)であった。実験は独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。


ADモデルにおけるPANTHOS神経細胞の老人斑への進化

PANTHOSニューロン病変が成熟プラークに進化する様子を明らかにするため、PANTHOSをチオフラビンS(Thio-S)で免疫標識し、高密度の老人斑を検出した(図8a8aおよび拡張データ図7b、c)。2.2ヶ月齢の5xFAD/TRGLの定量分析では、PANTHOSプロファイルの半分がチオ-S陽性であったが、6ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウスでは、95%以上がチオ-S陽性となった(図.8a、8a,graph)。PANTHOSニューロン病変から成熟プラークへの進化をさらに特徴づけるために、反応性アストロサイトとミクログリアを免疫標識した。どちらのグリア細胞タイプもPANTHOSニューロンと初期に頻繁に関連していなかったので、これらの細胞はPANTHOS発症の主要な引き金になるとは考えにくかった。生後2.7ヶ月の5xFAD/TRGLの定量分析では、ほとんどのPANTHOSニューロンはミクログリアやアストロサイトに関与していなかった(図8b).8b)。より高齢の5xFAD/TRGLマウス(6ヶ月)では、より多数のPANTHOSニューロンが構造的完全性の高度な喪失を示したが、比較的少数の患部ニューロンがミクログリアやアストロサイトによって係留されなかった(図8b.8b))。

図8 ADモデルにおいて、PANTHOSニューロンは古典的な密生した老人斑に進化する

a, 2.2ヶ月齢または6ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウスにおけるチオ-Sを用いた濃厚老人斑の標識。PANTHOSニューロン内のThio-Sの存在を定量化した(n = 3マウス)。2.7ヶ月(58.1±11.2%)および6ヶ月(95.2±2.4%)。スケールバー、50μm。Extended Data 図も参照。b, 2.7ヶ月齢または6ヶ月齢の5xFAD/TRGLマウスのアストロサイト(GFAP)またはミクログリア(Iba I)のマーカーを用いたIHF標識。PANTHOSニューロン内のミクログリアまたはアストロサイトの存在を定量化。2.7ヶ月:GFAPなし(67.2 ± 4.8%)GFAPあり(32.8 ± 0.8%)IbaIなし(64.2 ± 3.1 %)IbaIあり(35.8 ± 3.1% )6ヶ月:GFAPなし(29. 3 ± 3.2%),GFAP あり(70.7 ± 3.2%),IbaI なし(12.6 ± 7.7%),IbaI あり(87.4 ± 7.7%). n = 6(1マウス2セクション,3マウス). c、老人斑の成長は、一般に、1つまたは複数の隣接するPANTHOSニューロンの合体によって起こり、中心に位置する細胞が変性した後に細胞破片の除去が進行し、これらのニューロンから発生する分解性の低いアミロイドが残された。A1-A3:12ヶ月齢のTg2576/TRGL、A4:25.5ヶ月齢のAPP51/TRGLマウスの脳。スケールバー、50μm。Extended Data 図も参照。d, チオ-S陽性の濃厚コア老人斑の成長は、通常、1つまたは複数の隣接するPANTHOSニューロンの合体によって起こる。スケールバー、50μm。c、d、この実験は独立して3回繰り返され、同様の結果が得られた。定量的データは、平均値±s.e.m.、不対t検定、両側P値として示した。


高齢の5xFADマウスでは、PANTHOS病変は、隣接するPANTHOSニューロンが、複数のチオS陽性密なコア(図8c).8c、A1およびA2,それぞれ)からなる単一の大きな構造へと合流したときに、より大きな老人斑へと頻繁に拡大した。これらの成長する病変内では、新しく採用されたPANTHOSニューロンがまだ認識できた(Extended Data 図 a,8a、矢頭)。しかし、元のPANTHOSニューロンとその隣接する隣人の完全性が失われると、他の細胞破片が除去されるにつれて、持続するβ-アミロイドの拡大した中心コアが生じ、最終的に、拡大した細胞外濃厚コア老人斑が得られる(図8b、8b、A3およびA4,それぞれ)が、Zスタック共焦点画像で確認された(Extended Data 図8b8b)。

図8 老齢APP51マウスにおける変性細胞のリクルートと個体PANTHOSの合体

a. 28ヶ月齢のAPP51/TRGLマウス脳V層皮質ニューロンのLYマーカー(CTSB)とAPP-βCTF/Aβに対する3D6モノクローナル抗体によるIHF共ラベル化。Z-stackシリーズ(1μm厚、z1-z3)は、アミロイドに侵されたPANTHOSニューロン(4,矢頭)の周りに、様々な細胞(1-3)が異なる程度のペリカリアルのpa-ALおよび3D6の蓄積を伴って動員されていることを示す。スケールバー10μm。 b. 複数の単一PANTHOSが1つの大きな構造に統合される様子を示す連続z-スタック画像(厚さ1μm、番号z1-z5)。* 個々のPANTHOSの痕跡を示す。スケールバー 50 μm a-b: 独立に3回実験を繰り返し、同様の結果を得た。

方法

省略

考察

我々の遺伝子組み換え二重蛍光プローブは、生体内のオートファジー領域とそのpHの変化を同定し、5種類のAPP-ADマウスモデルにおけるオートファジー不全がAL/LI酸性化の早期低下に由来することを立証した。さらに、個々の神経細胞では、これまで知られていなかったPANTHOSと呼ばれる極度のオートファジー・ストレスのパターンを発見した。このパターンは、APP-β CTF/Aβを含む貧酸性のAVが神経細胞周囲に大量に蓄積することによって特徴づけられる。PANTHOSが進むと、膜管内にβ-アミロイドの神経細胞周囲の「コア」が生成される。ヒトAD脳の予備的解析(Extended Data 図 9)により、選択された新皮質ニューロンにも同様のPANTHOSが認められ、これは最初のβ-アミロイド斑が形成されるBraak II病態の段階で免疫細胞化学的に最も容易に理解されることがわかった。神経細胞における最初の神経保護的なオートファジー反応の進行性失敗29は、リソソーム膜の伝染性化、カテプシン放出、そして最終的にはグリア侵入と細胞外プラークの形成と拡大を伴う神経細胞死へのPANTHOSの進展を伴う(拡張データ図10,図)。

Tg2576マウスのAL酸性化障害は、βアミロイドが細胞外に沈着する4ヶ月以上前の生後5ヶ月までに検出可能であった。ALのpH欠損の出現は、脳LYのvATPase活性の低下と一致しており、これが酸性化欠損の分子的基盤であると思われる。ALの酸性化の低下は、拡大したpa-AL内でAPP-βCTFとAβの選択的な蓄積に伴って生じた。これらのAPP代謝産物はALS12,31とアンフィソーム32で生成と分解の両方が行われることが知られている。また、マイクロオートファジーやシャペロンを介したオートファジーによって、APP-βCTFやAβがAL/LYに追加的に運ばれることも排除できない33。

我々のtfLC3オートファジープローブの優れた分解能は、高度な超微細構造および多重共焦点画像法と相まって、脆弱な細胞集団内の無傷のニューロンにおけるユニークな病理生物学的プロセス(「PANTHOS」)を認識することを可能にした。この形態学的パターンは、これまで報告されていないが、AVの蓄積(「オートファジー・ストレス」)が非常に極端で、AVで満たされた巨大な細胞膜ブレットを誘発し、AVの融合によって部分的に作られた管-小胞構造内のAβおよびβ-アミロイド線維の核周辺付加を加速させたものである。CLEMおよび3次元連続超微細構造解析により、大きなAV充填ブレットは、細胞膜の蒸発によって形成され、perikaryal細胞質に由来することが示された。その非対称な形態、高いヒドロラーゼ含量、影響を受けたペリカリオンを取り囲む広範囲な分布は、DNをはるかにしのぐ数であった。DNはperikaryal blebsとは異なり、ニューロフィラメントに富み、弱いカテプシン免疫反応とLAMP2免疫反応のみを示し、しばしば有髄であった。

多くの先天性リソソーム蓄積性障害(LSD)では、オートファジー・ストレスが生じる。これらの疾患のうち、Niemann-Pick type C (NPC1)34 とMucopolysaccharidosis type III (MPS-III) では、pHが上昇することが示されている35。LSDの中でもNPC1はADと表現型がかなり重複しており(例えば、対をなすヘリカルフィラメント、コリン作動性神経変性、エンドソーム異常、ApoE4による疾患促進、細胞内Aβ/βCTF上昇、適度なアミロイド沈着36-38)MPS-IIIモデルマウスではタウオパシーが、MPS-III脳では細胞内のシニューリン、Aβ集積が報告されている39。これらの疾患の患者は通常、成人中期まで生存できないことが、アミロイド斑の発生頻度が低いことの一因と考えられる。PSEN1変異によるアルツハイマー病患者でも、一般にアミロイドプラーク病変は生後4年目まで現れず、この時期には加齢要因が寄与している可能性がある10,40。また、神経細胞のALP誘導は、基質クリアランスが低下してもAD脳では増加し続け29,41,オートファジックのストレスを増幅させ、βCTF/Aβの生成を増加させると考えられている12。

PANTHOSニューロンは、調査した年齢で5つの異なるADモデルで発生したプラークの圧倒的多数を量的に占めている。若い5xFADマウスでは、βアミロイド抗体で検出されたβアミロイドコアプラークは、中心核を示す単一のPANTHOSニューロンとほぼ1:1の一致を示した。細胞内Aβ抗体陽性線維は、核周辺を形成し、主にAβ陽性ALが融合してできた膜結合型管状構造体内部に存在する。この段階は、瀕死の神経細胞からの「食べてくれ」シグナルを反映するような微小グリアやアストロサイトの侵襲がなくとも到達できる42,43。したがって、PANTHOSがかなり進行しても、神経細胞の構造統合性は維持されることが示唆される。PANTHOS神経細胞へのミクログリアとアストロサイトの侵入は、無傷の神経細胞内のこのアミロイド病変を細胞外のアミロイドプラークに変える最終的な細胞死の前触れである。

ADにおけるβアミロイド斑の形成は、分泌されたAβに由来するβアミロイドの細胞外への沈着に起因すると考えられ、それが二次的に神経突起のジストロフィーと神経細胞死を引き起こすと考えられてきた。すなわち、細胞外プラークは主として膜管内のβ-アミロイドの神経細胞内蓄積から進展し、単一の無傷のPANTHOSニューロン内に集中したアミロイド「コア」を形成し、その後変性して古典的な老人斑を生じさせるというものである。この「インサイドアウト」プロセスは、多くの研究者による仮説と一致し、立証されている44,45。この仮説のバージョンでは、ALPコンパートメント内で細胞内に生成されたAβとそのオリゴマー種は、神経変性、局所膜損傷または非従来型分泌(エキソサイトーシス)により細胞外スペースに到達することができる。重要なことは、少数の研究者がADマウスモデルにおいて細胞内膜に包まれたアミロイド線維を報告していること46,AD脳においてDAPI陽性核の周囲にアミロイドが頻繁に存在すること47,48,細胞外のβアミロイドに神経細胞リソソームヒドロラーゼが多く存在すること49である。

我々の発見は、リソソームの酸性化とvATPase複合体の調節異常が、神経変性疾患50に関連する遺伝的および代謝的障害の共通の標的であるという証拠の積み重ねに追加された。これまでの証拠10,20と合わせると、今回の発見は、ADにおけるAPPメタボライトとLY機能不全の間の病原性の関連性を強く支持するものである。特に、PSEN1に関連するリソソームのpH障害を様々な方法で改善すると、ADモデルにおけるオートファジーの失敗や他のAD関連病理が改善される7,24。さらに私たちのグループは、この報告で述べたAPPベースのADモデルにおけるPANTHOSカスケードが、リソソームのpH欠損を薬理学的に標的とすることで有意に緩和されることを裏付ける証拠を示している。本報告で明らかになったことの重要性に加え、私たちは、この遺伝子組み換え二重蛍光tfLC3オートファジープローブが、他の神経変性疾患モデルにおけるALPの経時変化を敏感に捉え、治療薬としてのオートファジー/リソソーム調節剤の評価を促進する幅広い可能性を期待している。

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