Timeline (Bioavailability) of Magnesium Compounds in Hours: Which Magnesium Compound Works Best?

生物学的微量元素の研究

要旨

マグネシウムは、多くの細胞の生理機能と関連しているため、重要な働きをする元素である。食品加工により食品中のマグネシウム含有量は徐々に減少しており、健康的な生活のためのマグネシウム補給はますます盛んになってきている。しかし、各種マグネシウム製剤のバイオアベイラビリティに関するデータは非常に限られている。本研究の目的は、5種類のマグネシウム化合物（硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、アセチルタウリン酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リンゴ酸マグネシウム）の異なる組織におけるバイオアベイラビリティを調査することである。スプラague Dawleyラットに400mg/70kgのマグネシウムを単回投与した後、時間依存性の吸収、組織への浸透性、動物の行動への影響を調べることにより、バイオアベイラビリティを評価した。

薬物動態学的には、曲線下面積の計算ではリンゴ酸マグネシウムが最も高い。マグネシウムアセチルタウレートは、曲線下面積の計算で2番目に高いことがわかった。

マグネシウムアセチルタウリン酸塩は、急速に吸収され、脳に容易に通過することができ、脳内で最も高い組織濃度レベルを有し、不安指標の減少と関連していることが判明した。また、リンゴ酸マグネシウムの血清中濃度は長時間高値を維持していた。一般的に処方されている栄養補助食品である酸化マグネシウムとクエン酸マグネシウムは、対照群と比較してバイオアベイラビリティが最も低かった。

リンゴ酸マグネシウムとタウリン酸アセチル化合物のバイオアベイラビリティーと特定の組織や行動への影響を調べるためには、さらなる研究が必要である。

キーワード タウリン酸アセチルマグネシウム . リンゴ酸マグネシウム . クエン酸マグネシウム . 酸化マグネシウム . 硫酸マグネシウム . 不安 . 脳 . 筋肉.

序論

マグネシウムは、私たちの地球上で発見された8つの最も一般的な元素である[1]。また、脊椎動物では4番目に多く、細胞内では真核細胞のカリウムに次いで2番目に多い元素である。ナザン・ウイサルのマグネシウムは平均0.4g/kg（70kgの成人の場合、合計24g）である nazan.uysal@deu.edu.tr

人体に存在する[2]。全身のマグネシウムの約99%は骨、筋肉、およびそれらを取り囲む軟部組織に局在しており、そのうち50～60%は骨に存在している[3]。骨組織に含まれるマグネシウムの3分の1はリザーバーとして機能し、正常な血中マグネシウム濃度を維持するように調節されている[4]。骨のマグネシウム含有量は加齢とともに減少し、骨の貯蔵機能の低下につながる[1]。細胞外マグネシウムは全身のマグネシウムの1%を占め、そのほとんどが血清や赤血球に含まれている。血清中のマグネシウムの70%はイオン化され、20%はタンパク質と結合し、10%はリン酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、硫酸塩などの陰イオンと結合している[3,4]。

マグネシウムは細胞の重要な構成要素であり、多くの生理機能に関与している[2]。マグネシウムは、DNA/RNAポリメラーゼやATP代謝で機能するすべての酵素を含む酵素系で最も頻繁に発見された金属イオンの補酵素である。細胞内では、マグネシウムの存在はポリリン酸化合物の安定性に重要である。通常の状況下では、生物学的に活性なATPは、マグネシウムイオン[2]に結合されている。

ATP代謝は、筋の収縮・弛緩、正常な神経機能、神経伝達物質の放出に不可欠である。Mgは、筋肉の収縮・弛緩とエネルギー代謝におけるその基本的な役割を通じて、筋肉のパフォーマンスに影響を与える[5]。マグネシウム欠乏症の最も一般的な症状は筋痙攣である。また、血管緊張、心拍数、血小板活性化血栓症、骨形成の調節にも不可欠である[6]。マグネシウムの欠乏は、不安障害や抑うつ障害との関連性が示唆されている。マグネシウムの抗不安作用は、齧歯類モデルとヒトの両方で実証された研究もある[7]。

食事中のマグネシウムの約30～40%は消化管から吸収されるが、生理的な必要性に応じて10～65%の間で変動する。吸収は主に小腸で起こるが、大腸でも続く。ヒトでは、マグネシウムの吸収は小腸の遠位セグメントで特異的に起こる;どのようにしても、放射性同位体標識マグネシウムが摂取後1時間後に血漿中に検出されており、十二指腸や空腸などの小腸の上部領域で吸収が始まることを示している[8]。腸内細菌が発酵させることができる食物繊維の存在は、大腸からの Mg 吸収を増加させる[9]。消化管からの吸収後、マグネシウムは血流に入る。しかし、細胞膜を横切るマグネシウムの輸送速度は人体のすべての組織で同じではなく、心臓、肝臓、腎臓では高く、骨格、赤血球、脳では低くなる[10]。マグネシウムは血液脳関門を容易に通過する[2]。

マグネシウムの1日の推奨量は、19～30歳の女性で310mg、31歳以上の女性で320mg、19～30歳の男性で400mg、31歳以上の男性で420mgである[11]。マグネシウムの主な摂取源は食品と水である。マグネシウムは緑葉野菜、穀類、ナッツ類、豆類に豊富に含まれている。それにもかかわらず、食品のマグネシウム含有量は前世紀には減少している[12,13]。加工食品や精製食品はこの栄養素の供給源としては不十分であり、その含有量は最大85%まで減少している。調理（特に茹で）もまた、食品中のマグネシウム含有量を減少させる [14]。マグネシウム不足の食事に加えて、慢性的な飲酒、長期入院、または2型糖尿病、肥満、メタボリックシンドロームなどの慢性疾患の二次的な欠乏が起こる可能性がある。マグネシウムの摂取量は、マグネシウムを豊富に含む食事またはマグネシウムの補給によって増加させることができる。マグネシウムの摂取量や吸収量が減少したり、慢性的な病気になるとマグネシウム不足になり、サプリメントの摂取が必要になる。

マグネシウム元素は、有機分子や無機分子と化合物を形成し、自然界にはほとんどがマグネシウム塩として存在している。有機化合物と無機化合物は、化合物の2つの主要なクラスである。いくつかの例外を除いて、有機化合物は、C-H結合を含むものとして定義され、生物や生命のプロセスに関連付けられている。無機化合物には、炭素を含まず、生体と関連しない塩、金属、鉱物、その他の元素化合物が含まれる。無機化合物の生産は安価であり、消化管内で非常に簡単に分解される。しかし、有機物に比べて吸収率が低いのが特徴である。マグネシウムミネラルが消費されると、それらはすぐに放出され、そのようなナッツ、穀物、およびいくつかの野菜に見られるフィテートなどの他の化合物を結合するために自由になる。したがって、結果として生じる新しい化合物は吸収されることなく排泄される。未結合のマグネシウムミネラルは、消化器系を刺激し、下剤効果や下痢を引き起こす可能性がある[15-17]。

異なるマグネシウム化合物のバイオアベイラビリティと有効性に関する情報は限られている。本研究の目的は、異なる有機化合物（クエン酸マグネシウム、タウリン酸アセチルマグネシウム、リンゴ酸マグネシウム）と無機化合物（酸化マグネシウム、硫酸マグネシウム）のバイオアベイラビリティを調査することである。マグネシウム化合物としては、クエン酸マグネシウムと酸化マグネシウムが最も多く処方されている。マグネシウムアセチルタウリン酸塩は、白内障の実験モデルに効果があることが示されており、片頭痛の治療にも推奨されている。リンゴ酸マグネシウムは線維筋痛症の治療に使用されている。これらの広く使用されているマグネシウム化合物のバイオアベイラビリティーと非経口摂取量を経口摂取量と比較した。

材料と方法

動物

本研究では、スプラッグ・ドーリーラット（Dokuz Eylul University School of Medicine, Experimental Animal Laboratory, Izmir, Turkey）の外交系雄成体49匹を使用した。すべてのラットは、水と実験用飼料への自由なアクセスを持つ個々のケージに収容された。ラットは、一定の室温（22±1℃）と湿度（60%）で12時間明暗サイクルで飼育された。ドクズ・アイルル大学医学部動物管理委員会は、すべての実験手順を承認した。

ラットは6つのグループに分けた。(1)対照群(n = 7)、(2)硫酸マグネシウム(n = 7)、(3)酸化マグネシウム(n = 7)の6群に分けた。

7（4）クエン酸マグネシウム（n=7（5）タウリン酸アセチルマグネシウム（n=7（6）リンゴ酸マグネシウム（n=7）。

実験計画 実験の詳細を図1にまとめた。マグネシウム投与6時間後（男性には1日400mg/70kg推奨量）にマグネシウムの体内への影響を調べた[18]。全化合物の初等マグネシウム量を算出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて溶解した。また，非経口投与と経口投与の比較を目的としたため，硫酸マグネシウムは腹腔内投与とし，他のマグネシウム化合物は経口投与とした。硫酸マグネシウムマグネシウム群は、実験の2時間後に

図1 実験のタイムライン

マグネシウムの投与。すべてのマグネシウム化合物を1mlの量／ラットに投与した。コントロール動物には、同じ量のPBSを経口投与した。

マグネシウムのバイオアベイラビリティを評価するために、異なる組織を調べた。我々は、脳組織におけるマグネシウムの効果を評価するために2つの確立された動物の不安モデルを利用した：オープンフィールドアリーナと高架プラス迷路装置。再記録と分析は、4.1.106バージョンのNoldus Ethovision XTビデオトラッキングシステムによって完了した。筋組織におけるマグネシウムの効果を評価するために、運動量、筋力レベル、運動協調性を評価した。マグネシウム投与の 8 時間後に炭酸ガス麻酔下で採血を行い、その後、小脳から脳を分離し、脳全体の マグネシウム量を測定した[19]。筋組織中の Mg を測定する際には、腓腹筋は 1 型と 2 型の筋線維を含んでいるため除去した。

オープンフィールド試験

この試験は、自発的な運動量や不安感を評価するために一般的に使用されている。本研究では、一連の実験の一環として、オープンフィールド試験を実施し、ネズミの探索行動を評価した。オープンフィールドは、高さ50cmの壁で囲まれた1×1mのエリアと、装置の上2.5mに設置されたビデオカメラで構成されている。各ラットをオープンフィールドの中央に配置し、制御された光（100 lx）で照らされた防音観察室で5分間運動量（アンビレーション）を測定した[20]。

高架プラス迷路

これもネズミの不安のための確立されたモデルである。この試験は動物に不安を引き起こすので、不安の評価にはより正確である。高架プラス迷路アパラタスは、地上から50cmの高さに上昇した2つの開放腕（長さ50cm、幅10cm、高さ0.5cmの境界）と2つの閉鎖腕（長さ50cm、幅10cm、高さ40cmの壁）を有する中央のプラットフォーム（5cm×5cm）から構成されている。ラットは、以下の通りであった。

開放アームに面したプラットフォーム上に設置し、5分間観察した。開放腕と閉鎖腕への総入室回数と各腕での滞在時間を測定した[21]。

前肢握力の測定

被験者の筋力を筋力計を用いて測定した。ラットを尾から持ち上げて前腕でデバイスバーを保持し、その後、尾から静かに引っ張った。棒を離す前のデジタル力指示器によって与えられた値を把持力と定義した。この試験を連続して3回繰り返し、最も高い値を保持力とした[22]。

ロタロッド 運動協調性の評価

ロータロッド試験装置は、動物同士が見えないようにパネルで区切られた直径3cmの円柱で構成されている。5匹の動物を同時に試験することができる。バーの速度を4から 20rpmまで180秒間直線的に増加させ、動物を加速するロータロッド上を歩くように訓練した。動物がバランスを崩して転倒するまで、ローターロッド上での各歩行性能をカウンターで計時した[23]。

血液、脳、および筋組織のマグネシウムレベル

血液、脳、筋肉のサンプルは分析するまで-85℃で保存した。脳、血漿、および筋肉組織中のマグネシウムレベルは、投与後8時間後に原子吸光光度法（電子レンジ消化-210 VGPモデル、イーストノーウォーク、コネチカット州、米国）で測定した。マグネシウム濃度は、Beckman Coulter AU 5800アナライザー（Beckman Coulter, Brea, CA）を用いて、異なる時点で測定した。組織マグネシウム濃度は、湿潤重量あたりで計算した。タンパク質分析は、BCAタンパク質アッセイキット（Cat No E BP-500,Elabscience、武漢、中国）の製造者の説明に従って実施した。赤血球マグネシウム濃度は、タンパク質（ヘモグロビン）あたりで計算した。

曲線下面積の計算

バイオアベイラビリティとは、薬物が全身的に吸収される割合のことであり、血清濃度の曲線下面積（AUC）を時間プロットに対して定量化することで測定することができる。異なる時点で決定された血清マグネシウム濃度のプロットのAUCを計算した。AUC=（C1+C2）／（t2-t1）+（C2+C3）／（t3-t4）+（C3+C4）／（t5-t4））。

統計的評価

すべての統計的手続きは、Windows用のSPSSソフトウェア、バージョン11.0（SPSS、シカゴ、イリノイ州）を使用して実施した。群間の差は、群間で統計的に有意な差が見つかった場合に、ボンフェローニのポストホック検定を用いた一方向ANOVAを用いて分析した。グループ間の相関は、ピアソン相関分析を用いて計算した。結果は、平均値±S.E.Mで示され、ここでp < 0.05は統計的に有意であると考えられた。

結果

すべての結果を表1にまとめた。オープンフィールド試験において、アセチルタウリン酸マグネシウム群は、硫酸マグネシウム群、酸化マグネシウム群、クエン酸マグネシウム群、および対照群と比較して、オープンフィールドアリーナの中央部でより多くの活性を示した（硫酸マグネシウムはp＜0.05,他の実験群はp＜0.001）（図2a）。

アセチルタウリン酸マグネシウム群は、リンゴ酸マグネシウム群、クエン酸マグネシウム群、酸化マグネシウム群、対照群のラットと比較して、高架下プラス迷路試験の開放腕において、より高い活性を示した（リンゴ酸マグネシウム、クエン酸マグネシウムはp＜0.05;酸化マグネシウム群、対照群はp＜0.001）（図2b）。

実験群と対照群との間では、筋力やロタロド性能に差は認められなかった（図2c、d）。

投与後4時間目の時点で、リンゴ酸マグネシウム投与ラットでは血中マグネシウム濃度が高値を示した（腸管吸収が速いことを示す）が、リンゴ酸マグネシウム群とアセチルタウリン酸マグネシウム群との間には統計的な差は認められなかった。8時間目には、他のすべての群と比較して、リンゴ酸マグネシウム群で血中マグネシウ ム濃度が有意に高かった（p＜0.001）（図3a）。赤血球マグネシウム値には、実験群と対照群との間で差は認められなかった（図3b）。

マグネシウム曲線の下の面積は、すべてのマグネシウム化合物の間の差である。リンゴ酸マグネシウムのAUCは、他のすべてのグループよりもはるかに高い（p < 0.0001）。マグネシウムアセチルタウリン酸塩と硫酸マグネシウムのAUCは、酸化マグネシウムとクエン酸マグネシウムよりも高い（いずれもp＜0.0001）（図3c）。

脳マグネシウム量は、他の群と比較して、アセチルタウリン酸マグネシウム群が最も高かった（クエン酸マグネシウムとの比較 p＜0.05,他の群はp＜0.0001）（図4a）。一方、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、対照群と比較した場合、アセチルタウリン酸マグネシウム群では筋肉マグネシウム濃度が低かった（いずれもp＜0.001）（図4b）。

脳内マグネシウム濃度と高架プラス迷路のオープンアームでの滞在時間との間には強い正の相関が見られた（r = 0.541,p = 0.0001）。また、筋肉のマグネシウムレベルとオープンフィールドのアリーナで、また、elevat-edプラス迷路のオープンアームでのディステンションとの間には、中間的な負の相関が見られた（r = ・0.446,p = 0.005,およびr = ・0.468,p = 0.003,それぞれ）。

議論

本研究では、3 種類の有機 Mg 化合物と 2 種類の無機 Mg 化合物（腹腔内および口腔内）のバイオアベイラビリティーを比較した。バイオアベイラビリティーは、組織のマグネシウム濃度を調査することで評価し、行動的効果も評価した。

脳内での Mg のバイオアベイラビリティーを理解するために、我々は齧歯類を対象とした 2 つの確立された実験的不安モデルを実施したが、Mg は齧歯類の不安を軽減するためにこれらのモデルで以前に成功して使用されていた。試験したマグネシウム製剤の中で、マグネシウムアセチルタウリン酸塩群は、オープンフィールドテストと高 度プラス迷路テストのマーカー（オープンフィールドアリーナの中央細胞への進入頻度が高く、高 度プラス迷路テストのオープンアームでの滞在時間が長い）として最も低い不安指標を示し、マグネシウムアセチルタウリン酸塩群はまた、8 時間後の脳組織中の Mg 濃度が最も高く、血液脳関門が効率的に通過していることを強く示唆した。しかし、アセチルタウリン酸マグネシウム群では、他の実験群と比較して血中および筋肉のマグネシウム濃度が低かった。血清レベルはリンゴ酸マグネシウム群で最も高かった。

様々なMg化合物のバイオアベイラビリティに関する文献は限られている。我々の知る限りでは、様々なマグネシウム製剤の即時の生理学的・行動的効果とそれに対応する血中・組織マグネシウムレベルを調査・比較した先行研究は存在しない。これまでのほとんどの研究では、最大3種類のマグネシウム化合物のバイオアベイラビリティーを比較しており、バイオアベイラビリティーは尿検査で測定されている[24-26]。経口投与後、マグネシウムは腸から吸収され、血中濃度が上昇しても十分ではなく、通常の生理機能に参加するためには細胞膜を通過して細胞内に入る必要がある。そのため、我々は無機マグネシウムサプリメントの経口投与と非経口投与の両方を行ってきた。私たちの経験では、対照群と非経口群との間に違いは観察されないであった。

表1 行動検査の結果と8時間後の組織および血中マグネシウムレベル

コントロールと比較して*p <0.05; **コントロールとMgOと比較して*p <0.001

と無機マグネシウム基（酸化マグネシウムと硫酸マグネシウム）があり、これらの化合物のバイオアベイラビリティが低いと解釈される[15, 17]。我々は、アセチルタウリン酸マグネシウム（有機化合物）群が最も高い脳内マグネシウム濃度を示し、次いでリンゴ酸マグネシウムがこれに近い値を示した。マグネシウムは、すべての生体細胞の恒常性維持に不可欠なミネラルである。それは300以上の生化学反応の補酵素であり、核酸とタンパク質の合成、ATP合成、神経と筋肉の細胞機能、体温[2,27]を調整する。マグネシウムは、ストレスホルモンの放出を減衰させ、視床下部-下垂体-副腎皮質軸の活動を調節する精神神経内分泌系においても重要である[7,28]。

マグネシウムの枯渇は、情動性気分障害、不安、およびうつ病と関連している。以前、脳内のマグネシウムレベルの上昇が、マウスの不安関連行動と関連していることが示された[29]。マグネシウム治療は他のげっ歯類の研究でも不安を軽減することが示されている[30, 31]。Poleszaskの研究では、有機および無機マグネシウム化合物を比較し、硫酸マグネシウムがc(g)14 2測定610力を行った一方で

図2 行動試験の結果

a オープンフィールド試験の結果、オープンフィールド試験における移動時間の割合。アスタリスクは他群と比較してp＜0.05を示す。 b 高架プラス迷路試験の結果、高架プラス迷路のオープンアームへの総進入数。単一のアスタリスクは、コントロール、MgC、MgO、およびMgMと比較してp < 0.001を示す。二重のアスタリスクは、コントロールおよびMgOと比較してp＜0.001を示す。 c 前肢の握力測定結果。MgSO4硫酸マグネシウム、MgTアセチルタウリン酸マグネシウム、MgO酸化マグネシウム、MgCクエン酸マグネシウム、MgMリンゴ酸マグネシウム Uysal er al)。

図3 a 血清マグネシウムレベル。 a 血清マグネシウムレベルのタイムポイント測定

単一のアスタリスクは対照と比較してp < 0.001を示し、二重のアスタリスクはMgTと比較してp < 0.01を示す。 b 赤血球マグネシウムレベルのタイムポイント測定値。シングルアスタリスクは他の群と比較してp＜0.001を示し、ダブルアスタリスクはコントロール、MgO、MgC、MgT、MgMと比較してp＜0.001を示す。AUCは曲線下面積、MgSO4硫酸マグネシウム、MgTアセチルタウリン酸マグネシウム、MgO酸化マグネシウム、MgCクエン酸マグネシウム、MgMリンゴ酸マグネシウムabcは不安に影響を与えないが、ハイドロアスパラギン酸マグネシウム（有機化合物）はマウスの不安レベルを減少させることが示されている[30]。これらの結果と一致するように、我々の研究では、有機化合物であるアセチルタウリン酸マグネシウムが不安を減少させたのに対し、無機化合物は不安に影響を与えなかった。その他の有機マグネシウム化合物（クエン酸マグネシウム

図4 組織マグネシウムレベル。アスタリスクは他のグループと比較してp＜0.05を示す。MgSO4硫酸マグネシウム、MgTアセチルタウリン酸マグネシウム、MgO酸化マグネシウム、MgCクエン酸マグネシウム、MgMリンゴ酸マグネシウム、リンゴ酸マグネシウム）は不安指標に影響を与えなかった。我々の研究とPoleszaskらの研究[30]のマグネシウム投与方法には違いがあった。Poleszaskらでは、すべての有機マグネシウム化合物を腹腔内投与した。我々の研究では、主に経口投与を用いた。脳組織中のレベルは、アセチルタウリン酸マグネシウム群でのみ増加することが示された。

急性期のマグネシウム補給後の筋肉組織への影響は観察されなかった。線維筋痛症患者へのマグネシウム補給については、いくつかの報告がある。線維筋痛症患者の筋細胞にマグネシウムを補給すると、マグネシウムが減少することが以前に報告されている[32]。AbrahamとFlechasは、線維筋痛症患者にリンゴ酸マグネシウムを1日300～600mgのサプリメントを8週間投与して治療し、患者の線維筋痛症状の改善を報告した[33]。我々の研究では、急性マグネシウム投与は、我々のリンゴ酸マグネシウム群の筋チスースーマグネシウムレベルに影響を与えなかった。また、マレイン酸マグネシウム群では、対照群と比較して筋力に差は見られなかった。私たちの結果は、血清マグネシウム レベルと筋力 [34] の間の相関関係を実証した前の研究データをサポートする。マグネシウムは、消化管[35]を介して血流に入った後、骨、筋肉、脳組織に分布している。したがって、我々は特に、筋肉組織では直接、脳組織では推定される行動の発現を通じて、そのバイオアベイラビリティを調査することを選択した。

我々の研究の1つの限界は、マグネシウムの排泄を測定するために尿を採取できなかったことである。これを行うためには、尿を採取するための代謝ケージでラットを単独で飼育しなければならなかった。そうすると隔離ストレスがかかり、行動検査の結果にも悪影響を及ぼす可能性があった。尿中のマグネシウムを測定できれば、マグネシウム代謝全体を計算することができたはずである。

今回の研究では、医師が一般的に処方する酸化マグネシウムとクエン酸マグネシウムの化合物が最もバイオアベイラビリティが低く、ほとんどの場合、対照群との有意差が観察されなかったことに驚いた。これらのマグネシウムの両方の形態の化合物からマグネシウムが急速に分離され、遊離したマグネシウムが食物のような多くの腸内内容物に迅速に結合することが知られている。我々の実験中、我々のラットは食物に自由にアクセスしていた;したがって、我々の所見は、マグネシウム化合物のより低いバイオアベイラビリティを示している可能性があると。

結論

今日では、食品に含まれる栄養素が減少しているため、微量栄養素の強化が必要となっている。マグネシウムは、体内で不足するとサプリメントとして摂取しなければならない微量栄養素の一つである。本研究では、脳内で検出された経口投与されたマグネシウムアセチルタウリン酸塩が迅速に吸収され、簡単に脳に通過することができ、脳のマグネシウムレベルと高架プラス迷路のオープンアームで過ごした時間との間の強い正の相関関係によって明確に証明されたように不安指標に測定可能な効果を持っていたことを実証した。また、血清中のタウリン酸マグネシウム濃度が長時間高値を維持したことも注目すべき結果であった。本研究では単回投与（1日の推奨投与量）を用いたが、これらのマグネシウム化合物の用量依存的な反応については、さらなる調査が必要であろう。さらに、これらのマグネシウム化合物の長期投与による人体への影響を説明するためには、さらなる研究が必要である。