www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433066/
J Biol Chem. 2019 Mar 22; 294(12): 4596-4607.
2019年1月15日オンライン公開
要旨
プレグネノロンは、ステロイドホルモン前駆体であり、様々なステロイド生成組織、脳、リンパ球で合成される。プレグネノロンは、他のステロイドホルモンの前駆体として機能するだけでなく、それ自体が抗炎症分子として、様々な炎症状態における免疫恒常性の維持に効果を発揮している。
プレグネノロンとその代謝誘導体は、記憶と学習の強化、うつ病性障害の回復、認知機能の調節など、脳において有益な効果を発揮することが示されている。神経炎症性疾患ではプレグネノロンレベルの低下が観察され、神経保護および神経再生における役割が強調されている。
プレグネノロンの抗炎症作用は数十年前に認識されていたが、その作用機序は未だ不明である。ここでは、プレグネノロンがマクロファージやミクログリア細胞において、TLR2/4アダプタータンパク質TIRAPとTLR2のユビキチン化および分解を促進することを報告する。
プレグネノロンとその代謝物は、TLR2およびTLR4シグナルを介した腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン-6の分泌を抑制した。プレグネノロンは、細胞質リンカータンパク質170の活性化を誘導することが報告されており、このタンパク質はTIRAPの標的分解を促進することが最近示された。
我々は、プレグネノロン存在下で、TIRAPの分解が促進され、細胞質リンカータンパク質170によってTLR4が抑制されることを観察した。我々の実験データは、プレグネノロンの新しい非ゲノム標的を明らかにし、様々な炎症状態における免疫恒常性の回復におけるプレグネノロンの役割を理解するための重要な手がかりを提供する。
キーワード 自然免疫、Toll様受容体（TLR)免疫抑制、炎症、ユビキチン化（ユビキチン化）
はじめに
プレグネノロンは、副腎、生殖腺、胎盤などのステロイド生成組織において、ミトコンドリア酵素CYP11A1によってコレステロールから合成される(1, 2)。また、中枢神経系や末梢神経系では、主にグリア細胞や神経細胞で神経ステロイドとして合成される(3)。
脳内では、プレグネノロンおよびその代謝誘導体であるプレグネノロン硫酸、アロプレグナノロン、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）などが、学習・記憶の増強、うつ状態の緩和、脳の認知機能の調節を行うことが知られている(4)。
プレグネノロンとその代謝物は、アルツハイマー病（AD）4や多発性硬化症（MS）などの様々な神経炎症性疾患や、統合失調症、うつ病、自閉症などの神経精神疾患において、神経保護的な役割を果たす（5,-7）。
また、プレグネノロンは、カンナビノイド受容体による細胞内シグナル伝達経路を阻害することにより、大麻中毒を抑制することが可能だ(8)。脳や古典的なステロイド生成組織に加えて、リンパ球もプレグネノロンを合成し、免疫抑制を誘導することが報告されている(9)。
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プレグネノロンは、従来、他のステロイドホルモンの前駆体としての役割以外に、それ自体では生物学的機能を持たない不活性なステロイドと考えられてきた。しかし、その抗炎症作用や抗肥満作用は、1930年代にはすでに認められていた（10, 11）。
プレグネノロンは、数十年前から抗炎症剤および幸福のためのステロイドとして使用されている（12, 13）。しかし、プレグネノロンがどのようなメカニズムで抗炎症作用を発揮するのかについては、まだ不明である。一般に、ステロイドは細胞内の受容体に結合することで抗炎症作用を発揮する。
その後、これらの受容体は核に移行し、炎症性サイトカインの分泌に関連する遺伝子を負に制御する(14)。プレグネノロンの代謝性誘導体であるプロゲステロンは、プロゲステロン受容体を介してその作用を発揮することが報告されている（15, 16）。
しかし、プレグネノロンのゲノム作用に特異的な受容体は、今のところ同定されていない。研究により、プレグネノロンの非ゲノム的な標的として、微小管関連タンパク質2 (MAP-2) や細胞質リンカータンパク質170 (CLIP170) などが明らかになっている (17, 18)。
プレグネノロンは、MAP-2と相互作用し、微小管の重合を促進し、神経の成長や可塑性を促進する(17)。CLIP170は、微小管プラス端追跡タンパク質で、微小管ダイナミクスの制御、細胞移動、有糸分裂、細胞内輸送など様々な細胞内プロセスに関与している。プレグネノロンは、自己抑制されたCLIP170を活性化し、ゼブラフィッシュ胚や哺乳類細胞において微小管の重合と細胞移動を促進することが報告されている(18)。
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プレグネノロンが微小管の動態をどのように調節するかについては、限られた実験データしかないが、その抗炎症作用の標的は依然として不明である。Toll-like receptor (TLR) は自然免疫の重要な構成要素であり、その異常な活性化は様々な炎症性疾患を引き起こす。
TLR2 と TLR4 は、病原体に関連した幅広い分子パターンと内因性リガンドを検出し、様々な炎症性疾患において重要な役割を担っている。本論文では、プレグネノロンがTLRシグナル伝達経路の主要なタンパク質の分解を促進することを報告する。
プレグネノロンは、TLR2/4アダプタータンパク質であるTIRAPとTLR2の標的ユビキチン化と分解を誘導した。TIRAPは、MyD88をTLR2/4受容体にリクルートする橋渡しアダプターとして機能する。プレグネノロンによるTIRAPとTLR2の分解は、マクロファージとミクログリア細胞におけるLPSまたはPam3CysSerLys4（Pam3CSK4）を介したTNF-αの分泌を抑制する結果となった。
CLIP170がTIRAPのユビキチン化と分解を誘導することを我々は以前に報告した(19)。プレグネノロンはCLIP170の活性化を誘導し、TIRAPに対するユビキチンリガーゼ様機能を強化し、LPSによるTLR4シグナルを抑制することを見出した。この結果は、プレグネノロンが活性化したマクロファージを抑制し、様々な条件下での異常な炎症反応を抑制するメカニズムについて、新たな知見を提供するものである。
研究成果
省略
考察
プレグネノロンは、他のホルモンの前駆体として働くだけでなく、それ自身の生物学的作用を有している。プレグネノロンは、抗炎症作用を示すことが示されており、神経炎症の予防や神経保護作用の増強に関与することはよく知られている（4, 7）。
プレグネノロンの代謝物であるプレグネノロン硫酸やアロプレグナノロンもまた、神経炎症を調節し、神経保護を促進することが報告されている。
前臨床試験において、プレグネノロンは抗うつ作用を示し、記憶や認知機能を改善し、痛みやストレスを制御し、気分障害の症状を緩和することが示されている。
しかし、プレグネノロンの抗炎症作用や神経保護作用の分子機構は、まだほとんど分かっていない。グルココルチコイドは、グルココルチコイド受容体に結合することで免疫抑制作用を発揮する(23)。しかし、グルココルチコイド受容体に拮抗するミフェプリストンはプレグネノロンの免疫抑制性に影響を与えなかったことから、プレグネノロンはグルココルチコイド受容体に依存しないメカニズムで炎症反応を抑制していると考えられている(24)。一方、同じくプロゲステロン受容体を遮断するミフェプリストンは、BV2ミクログリア細胞においてプロゲステロンの抗炎症性を中和することが示されている(16)。
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CLIP170はプレグネノロンの細胞内標的の一つとして同定されている(18)。CLIP170は、N末端の細胞骨格関連タンパク質-グリシンリッチ（CAP-Gly）ドメインとC末端のジンクフィンガードメインの分子内相互作用により、円形の自己抑制状態で存在している(22)。
この構造状態により、非生産的なタンパク質間相互作用が防止される。CLIP170と相互作用するタンパク質は、CLIP170の開いた拡張構造を誘導し、微小管への結合を促進する。PregnenoloneはCLIP170に結合し、CLIP170のopen extended構造変化を誘導し、微小管への結合に続いて微小管の重合を促進し、細胞の移動を促すことが報告されている(18)。
また、CLIP170はTLR2/4アダプタータンパク質TIRAPの分解を促進し、TLR2やTLR4を介した炎症反応を抑制することが明らかにされている(19)。プレグネノロンは、マクロファージやミクログリア細胞において、LPSやPam3CSK4によって誘導される炎症性サイトカインを抑制することができる。
プレグネノロンの神経保護的役割は、主にその抗炎症性に起因している。我々は、プレグネノロンがTIRAPとTLR2のユビキチン化と分解を誘導し、TLR2とTLR4を介したTNF-αとIL-6の分泌を減弱させることを証明する。プレグネノロンによるCLIP170の活性化により、TIRAPの分解が促進され、CLIP170によるTLR4の抑制がもたらされた。
これらの知見から、プレグネノロンの神経保護的役割は、CLIP170を介してTLRシグナル伝達経路の主要タンパク質を排除する能力に起因することが想定される。CLIP170は、神経細胞の発生に関与することが報告されており、常染色体劣性遺伝の知的障害ではCLIP170の欠損が報告されている(25)。
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様々な微生物や内因性のリガンドを検出するTLR2やTLR4は、中枢神経系の炎症に大きな役割を担っている。脳の居住マクロファージであるミクログリア細胞は、TLR2およびTLR4を発現し、様々な病原体に関連した分子パターンや内因性リガンドに反応し、M1またはM2表現型に極性化する。
M1表現型は破壊的であり、様々な炎症性サイトカインの分泌、神経細胞のアポトーシスの誘導、神経新生の抑制が特徴である(26)。M2極化ミクログリア細胞は抗炎症性であり、組織破片の除去や組織の修復・再構築など、様々な神経保護反応を発揮する(27)。
TLR4 を介したミクログリア細胞の活性化は神経毒性を持ち、β-アミロイドペプチド (Aβ) の沈着とその後の神経細胞の損傷によって引き起こされる AD など、多くの神経変性疾患の病態生理に寄与している (28,-30)．TLR4の欠損はAβによるミクログリアの活性化を強く抑制し、結果として炎症性サイトカインのレベルを低下させる(31)。
TIRAPはTLR4シグナルのMyD88依存性経路に必要であり、LPS/IFN-γで処理したミクログリア細胞のM1分極を正に制御する(32)。ミクログリア細胞のTIRAPをサイレンシングすると、M1関連炎症性サイトカインの発現が減弱される。
我々の実験データは、プレグネノロンによるTIRAPのユビキチン化と分解の促進が、ミクログリア細胞におけるTLR4誘導性の炎症反応を抑制することを示唆している。
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他の TLR と比較して、TLR2 は様々な細胞種に遍在しており、様々な微生物成分や内因性リガンドを検出し、炎症性サイトカインやケモカインを分泌させることができる (33, 34)。TLR2はAβペプチドを検出し、ミクログリア細胞のM1偏光を引き起こし、その結果生じる神経毒性がADの病態に寄与していることが研究で示されている(35)。
TLR2の欠損は、ミクログリア細胞の代替的なM2型活性化をもたらし、炎症を抑制し、Aβ凝集体を貪食することで神経保護を向上させる(29)。CD4+T細胞上のTLR2の刺激は、そのTH17細胞への分化を誘導し、様々な炎症性サイトカインを分泌し、MSの病態に寄与することが示されている(34)。
これと一致して、TLR2を欠損したC57BL6マウスは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発から保護される(36)。また、MSの脳病変ではTLR2のアップレギュレーションが報告されている(37)。プレグネノロンがTLR2とそのアダプター分子TIRAPの分解を誘導することを考えると、ミクログリア細胞の破壊的なM1タイプの活性化を防ぎ、神経保護と神経再生を促進できる可能性がある。
プレグネノロンは、ADにおいて保護的な役割を果たすことが報告されており、アルツハイマー病患者ではプレグネノロン硫酸のレベルが低いことが報告されている(5)。
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最近の研究では、プレグネノロンはリンパ組織の作用を調節するリンパステロイドであることが明らかにされている(9)。プレグネノロンはヘルパーT細胞2細胞で活発に合成され、蠕虫感染モデルにおいてヘルパーT細胞細胞の増殖やB細胞のクラススイッチングを抑制し、免疫恒常性を回復させることが報告されている(9)。
IL-4で分化したCD4+およびCD8+T細胞では、コレステロールからプレグネノロンを合成するCyp11Aの発現が上昇することが報告されている。Cyp11A1は、アレルギー性肺疾患において、IFN-γ産生CD8+ T細胞のIL-13産生細胞への転換を促進する(38)。しかし、プレグネノロンまたはその代謝物がCD8+ T細胞の極性を制御するメカニズムは、まだ不明である。
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以上のように、我々はプレグネノロンの抗炎症作用や神経保護作用に寄与すると思われる新しい非ゲノム標的を同定した。プレグネノロンがCLIP170の活性化を介してTLR2とTIRAPの標的ユビキチン化と分解を誘導していると推測される。
プレグネノロンとその代謝誘導体は、神経変性疾患や精神疾患において多くの有益な役割を担っている。今回の発見は、プレグネノロンを介した神経保護および免疫抑制の基本的なメカニズムを理解するための重要な手がかりとなり、最終的には様々な免疫・炎症性疾患に対する新しい治療戦略の開発につながると期待される。