技術報告書：Covid19ワクチンにおけるグラフェンの検出 2021

www.researchgate.net/publication/355979001_DETECTION_OF_GRAPHENE_IN_COVID19_VACCINES

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Covid-19ワクチン中のグラフェンの検出

テクニカルレポート – 2021年11月

著者2名

パブロ・カンプラ　アルメリア大学

44件の論文 1,126件の引用

マイクロラマン分光法によるCovid-19ワクチン中のグラフェンの検出

*

技術報告書　スペイン、アルメリア、2021年11月2日

パブロ・カンプラマドリード准教授

化学博士号生物科学学位

要旨

コビッドワクチン中のグラフェンの存在に関する我々の研究を紹介する。我々は、4つの異なる商標のバイアルから無作為に採取した7つのサンプルについて、光学顕微鏡で見えるグラフェン様ナノ粒子の無作為スクリーニングを行った。

micro-RAMANと呼ばれるこの技術により、光学顕微鏡でグラフェン様に見える110以上の物体を選別した後、これらのサンプル中のグラフェンの存在を決定することができた。このうち、画像とスペクトルの両方がグラフェン誘導体の存在に適合していることから、標準物質や科学文献から得られた信号との対応に基づいて、28の物体群が選択された。酸化グラフェン構造の同定は、標準物質とのスペクトル相関が高いことから、そのうちの8つで決定的なものとみなすことができる。残りの20の対象物では、ラマン信号と結合した画像は、未確定のグラフェン構造と非常に高い互換性を示したが、ここで使用した標準とは異なっていた。

この研究はまだ未解決であり、科学界に公開され議論されている。我々は、利害の対立やいかなる機関からの協力もない独立した研究者が、これらの実験的薬剤の組成や潜在的な健康リスクについてより詳細な知識を得るために、これらの製品についてより広範な反対分析を行うことを呼びかける。

AI解説

 

免責事項

本研究は、パブロ・カンプラ博士が単独で実施したものであり、いかなる民間・公的機関からの報酬もなく、また博士が所属する機関がその結果および結論に関与することも適合することもない。

関連対象物の特性は、分析されたサンプルにのみ対応する。これらの結果が類似商標の他のサンプルに一般化できるかどうかは、相当なサンプリングなしにはわからない。

Dr. Pablo Campraは、電子署名されたこのファイルに記載された記述に対してのみ責任を負い、メディアやソーシャルネットワークでの拡散から引き出される可能性のある意見や結論については責任を負わない：

www.researchgate.net/publication/355684360_Deteccion_de_grafeno_en_va cunas_COVID-19_por_espectroscopia_Micro-RAMAN

1. 分析方法

1.1. マイクロラマン法の基礎

試料の特性と、組成が不確定な複雑なマトリックス中にマイクロメートルサイズのグラフェンの外観を持つ物体が分散しているため、分光学的手法を直接適用しても、元の試料からの顕微鏡的な位置特定や分画を事前に行わなければ、ここで研究したナノ粒子の特性評価はできない。そこで、RAMAN分光法と組み合わせた顕微鏡法（micro- RAMAN）が、光学顕微鏡で見える微小物体の徹底的なスクリーニングに効果的な手法として選択された。

RAMAN赤外分光法は、高速で非破壊的な手法であり、単色レーザーで励起した後に発生する振動モードやフォノンを同定することで、グラフェンやその誘導体の網状構造の特徴である赤外発光のピークに現れる非弾性分散を発生させ、この材料の構造を検証することができる。結合光学顕微鏡では、励起レーザーを特定の対象物や対象物上の点に集光することができるため、材料の性質を特定する信頼度が高まり、グラフェンナノ結晶構造の厚さ、欠陥、熱伝導率、エッジ形状に関する補足的な情報を得ることができる。

一般的な官能基のRAMAN振動モード O-P-O 813 cm-1

C-C 800 (600-1300) cm-1

C-O-C 800-970 cm-1 ラマン平均

C-(NO2) 1340-1380 cm-1 強ラマン; 1530-1590 cm-1 (非対称) 中ラマン

芳香環のC=C振動（グラフェン、グラファイトなど）

1580-1600 cm-1 : 強いラマンシグナル

1450, 1500 cm-1 : 中程度のラマンシグナル

• CH2- 1465 cm-1 面内屈曲 H-C-H (シザリング)

C=N 1610-1680 cm-1

C=0 カルボニル 1640, 1680-1820 cm-1

C-H 3000 cm-1

O-H 3100-3650 cm-1

1.2. マイクロラマン分光に使用した装置

ラマンレーザー分光装置 JASCO NRS-5100

分光器付き共焦点ラマンマイクロスコープ：

• 5倍から100倍までのさまざまな倍率と作動距離
• UVからNIRまでの最大8つのレーザー
• SRI（空間分解能画像）により、サンプル画像とレーザーポイントを同時に見ることができる。
• 対物レンズによって生成される画像の共焦点焦点を最適化するDSF（Dual Spatial Filtration）により、収差を低減し、空間分解能を向上させ、マトリックス蛍光の影響を低減する。

スペクトルの解析には、SPECTRA MANAGER ソフトウェア、バージョン 2を使用した。ジャスコ株式会社。

以前、装置は520cm-1のケイ素標準物質で校正された。

スクリーニングに適用したRAMAN分光法のパラメータ

横軸 Raman Shift [cm-1] 縦軸 Int.

開始 1200 cm-1

終了 1800 cm-1 データ間隔 1 cm-1 データポイント 601

[機種名 NRS-5100 露光時間 30 秒

蓄積量 3

中心波数 1470.59 cm-1

Z 位置 27041.5 µm ビニング Upper 143

ビニング下段 202

有効チャンネル 1 – 1024 CCD DV420_OE

レーザー波長 532.09 nm モノクロメーター シングルグレーティング 1800 l/mm

100 x 1000 アパーチャー d-4000 um ノッチフィルター 532.0 nm

分解能 3.69 cm-1,0.96 cm-1/ピクセル対物レンズ MPLFLN 100 x

BS/DMBS 30/70

1/2板偏光板なしレーザー出力 4.0 mW アッテネーター オープン

CCD温度 -60.0 ºC シフト-3.00 cm-1

1.3. グラファイトとグラフェンの顕微ラマン分光

1. ナノ結晶構造バンド

• Gバンド（～1580-1600 cm-1）： グラファイトとグラフェンの結晶構造に特徴的な、芳香環（sp2混成）面内の許容フォノン振動（ネットの素振動）を示す。この振動は、赤方偏移（周波数が低い、単位はcm-1）を示し、層数が多いほど強度が高くなる。一方、ドープされたグラフェンでは、1580-1600 cm-1の範囲で、より高いエネルギーがブルーシフト（高い周波数、cm-1）として現れる（Ferrari et al, 2007）。
• 2次元バンド（～2690 cm）（またはG’）： 積層順を示す。層数に依存し、欠陥の程度には依存しないが、その周波数はピークDの2倍に近い。単層グラフェン（SLG）の存在は、孤立した鋭い2Dピークの存在と関連しており、その幅は層数に応じて増加する（Ni et al., 2008）。
• I2D/IGの比は、グラファイトネットワークの層数に比例する。
• グラファイトのGと2Dは、グラフェンよりもシャープで狭い。

2. グラファイト構造の異常によって活性化されるバンド

これらのバンドは、荷重の弾性分散（同じエネルギー）とフォノンの閉じ込め（フォノンの分散におけるKohnの異常）によって生成される。

グラフェン酸化物（GO）では、水酸基（-OH）とエポキシド基（-O-）の挿入によって無秩序が生じる。

• Dバンド（～1340 cm-1）。これは、官能基化、ドーピング、または正孔や新しいsp3（C-C）中心を生成する構造異常による結晶ネットワーク内の欠陥密度を示す。D-バンドの強度は、グラファイト構造における層の配列とともに減少する。
• D’バンド（～1620cm-1）。ネットワーク欠陥による二重共鳴挙動を示す。後者のブルーシフトにより、Gバンドと融合することもある。
• D+Gバンド (~2940 cm-1)

D+Gバンド（～2940cm-1） ラマンバンドの周波数変動（cm-1）、強度、形状を決定するパラメータこれらのパラメータは、本報告書では詳しく研究していないが、今後、バンドを振動モードに割り当てるために考慮する必要がある。

• フォノン寿命（分子振動）を減少させることにより、G、D、2Dピークの幅を広げる原因となる無秩序の程度と種類（ドーピング、切断など）。
• Gバンドは無秩序による強度の違いは見られないが、Dバンドの変化によって比（ID/IG）が変化する。
• ドーピングによるネットワークの圧縮と伸張。すべてのバンドでブルーシフト（>cm）が起こり（Gで最大15cm-1,2Dで最大25cm-1）、バンドが狭くなる（最大10cm-1）。
• シートベンディングによって2Dバンドも増加し、Gは変化しないが、4～12cm-1のブルーシフトが起こりうる。
• 積層レベルまたは層数
• 746cm-1（C-S伸縮）、524,1062,1102,1130cm-1（骨格振動、CCCCトランスとゴーシュ）、1294（ねじれ）、1440,1461（C-H変形、シザリング）、2848,2884cm-1（C-H伸縮）。
• 同じ物体でも、入射角や影響を受ける層によってスペクトルが異なることがある。エッジは内部の結晶構造よりも乱れを示す（Ni et al, 2008）。
• ブルーシフトは、グラフェン層の成長に使用した基板に依存する（Chen et al, 2008）。
• 結晶ネットワークに関連する入射角に対する構造のばらつきにより、同じ対象物でもレーザーの集光点によってピークの強度が変化する（Barros et al.）

1.4. マイクロラマンでスクリーニングされたバイアル瓶と対象物のサンプルリスト（付録1および2を参照のこと）

1.5. 試料の処理

• 1. サンプルは、付属書1に概説されているように、COVID-19 mRNA ワクチンの密封バイアルから得た。すべてのバイアルは処理時に密封されたが、MODとJANはアルミシールがなかった。
• 2. 各10μlのバイアルあたり4種類のアリコートを50μlのマイクロシリンジで抽出し、光学顕微鏡用スライドに付着させ、無菌層流チャンバー内で室温で乾燥させた。その後、密閉したスライドケースに入れ、マイクロラマン分析まで冷蔵保存した。
• 3. 光学顕微鏡（OLIMPUS CX43）を用いて、グラファイト構造またはグラフェンに適合する物体を探すため、ドリップの広範な目視スクリーニングを行った。

対象物の選択基準は以下の通り：

• 1. 飛沫の残部、または乾燥によって引きずられた外側の領域に位置する。
• 2. 2種類のグラフェン様外観：2次元の半透明な物体、または暗黒の炭素様不透明体。
• 4. 選択した物体のRAMANスペクトルを得る。
• 5. スペクトルデータの処理

本レポートで取り上げた天体のリストとキーは、付録2に記載されている。

3. 結果と考察

(選択した対象物の画像とスペクトルは付録3「結果」を参照のこと)

今回適用したマイクロラマン分光法は、複雑な試料中に分散したグラフェン微細構造の検出において、多数の微視的物体の迅速なスクリーニングに非常に有効であることが証明された。水分散液全体のマクロラマン分光と比較して、マイクロラマンにおける顕微鏡観察との組み合わせは、光学顕微鏡下で見えるナノ粒子へのスペクトル指紋の関連付けを可能にするという利点がある。この手法により、グラフェン様の外観を持つ特定の物体に焦点を当て、結合画像による分光学的特性評価を強化することができた。この研究では、超音波処理後の標準物質や酸化グラフェン分散液で観察される類似の形状と視覚的に類似していることから、半透明のシートと不透明の炭素質物体という2つの類型に焦点を絞って物体を予備的に選択した（付属資料3の結果を参照）。両タイプの違いは化学組成によるものではなく、どちらもグラファイトに由来するものであるが、出発黒鉛材料の剥離の程度と、グラファイト（3D）材料とみなすための基準値として約10層を仮定した場合の重ね合わせ層の数によるものである（Ramos-Fernandez, 2017）。いずれにせよ、これらの構造をさらに特徴付けることは、我々の仕事の範囲外であった。

グラフェン様の外観を持つ合計110個の物体が選ばれ、そのほとんどは、元の水相を室温で乾燥させることにより、脱水後のサンプル飛沫の端、ドラッグエリアの内側または外側に位置していた。このうち、文献で報告されているグラフェン材料とのスペクトルの適合性が高いものを、スペクトルと画像の両方を考慮して合計28個選んだ。これらの対象物の画像とRAMANスペクトルを本報告書の付属資料3に示す。興味深いことに、サンプルは室温では完全に乾燥せず、常にゲル状の残渣が残る。この媒体の組成は、低倍率（40～600倍）で試料中に繰り返し観察されるマイクロメートルサイズの物体の他の類型と同様、本研究の対象ではないため、今のところ不明である。これらの物体のラマンスペクトルも得られたが、グラフェンやグラファイトと視覚的に類似していなかったため、本研究では示していない。

この手法で明確なスペクトルパターンを得る上での限界は、多くの選択された物体から放出される蛍光の強度であった。グラフェンのような外観を持つ多数の半透明のシートでは、蛍光ノイズのないラマンスペクトルを得ることができなかったため、この手法では、その多くで明確なピークを持つ特定のRAMANシグナルを得ることができなかった。したがって、これらの対象物において、グラフェン構造の存在を肯定することも否定することもできない。マイクロRAMAN技術のもう1つの限界は、装置の光学像の質が低いことである。このため、透明度の高いグラフェン様シートを検出できないことが多い。このような対象物の特性評価には、分光法と組み合わせた他の補完的な顕微鏡技術を用いるのが効果的であろう。例えば、良好な光学系を用いたXPSや、電子顕微鏡（TEM）によるグラフェンの電子回折パターンの取得などである。

これらの選択基準を考慮し、グラフェンである可能性のある28個の物体を、使用した還元型酸化グラフェンパターン（rGO、TMSIGMA ALDRICH）のRAMANスペクトルとの相関度に応じて2つのグループに分けた。グループ1には、スペクトルパターンがrGOパターンのスペクトルと類似しており、酸化グラフェンの存在を確信できる8つの対象物（nº 1-8）が含まれる。このスペクトルの一致は明白であり、スキャンされた範囲（1200～1800 cm-1の間）に2つの支配的なピーク、グラフェン酸化物に特徴的なG（～1584 cm-1）とD（～1344 cm-1）と呼ばれるピークによって特徴付けられる。これらのナノ粒子のシグナルとrGOパターンとの間のスペクトル対応によるこの特徴付けは、これらの物体の顕微鏡的外観によって補強された。したがって、グループ1のすべての分析試料にグラフェン物質が含まれていることは、高い信頼性をもって断定でき、高い確率で酸化グラフェン構造をこれらのナノ粒子に割り当てることができる。これらのグループ1の物体は、数十ミクロンの範囲のマイクロメートルの大きさを示した（いくつかの写真では青い線で示されている）。

グラフェンまたはグラファイト構造の存在に適合するRAMANシグナルが検出された。これは、グラフェンまたはグラファイトのナノ結晶構造のGピークに適合するGバンド（1585-1600 cm-1）周辺のRAMAN振動のピークを示している。この振動モードは、芳香環（sp2）の面内でのフォノンの許容振動によって生じる。1600cm-1（ブルーシフト）に向かうこの振動モードは、グラフェン層の数、官能基や重金属のドーピングなど、文献で広く言及されているさまざまな修飾に起因している（Ferrari et al, 2007）。視覚的には、このグループには、標準物質で観察される2種類の外観が含まれる。炭素質の外観を持つ不透明な微小物体（9,11,16,21,22,23,24,25,26,27,28番）と、グラフェン様の外観を持つ半透明のシート（10,12,13,14,18,19,20番）である。

このグループ2のスペクトルでは、Gピークの極大値が、他の支配的なピークを伴っている。サブグループ(2.1.)は、酸化グラフェンの2つの主要な振動モードであるG (1569-1599 cm-1)とD (1342-1376 cm-1)に割り当てられる2つの支配的なピークを持つ物体から構成される（物体番号11, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26）。顕微鏡画像とRAMANシグナルの両方を合わせて考慮すると、このグループ2.1のスペクトルをグラフェン構造に割り当てることは、高い信頼性をもって行うことができる。しかし、標準的なrGOとは異なるスペクトルシグナルを生成するネットワークの構造的修飾は、まだ決定されていない。

グループ 2の第2のサブグループ（2.2）からのシグナル（nº 9, 10, 12, 13, 18, 19, 25, 27, 28）は、G バンドに極大が存在することから、グラフェン構造の存在に適合すると考えられるが、標準 rGOの 1344 cm-1 付近にある振動モード Dに割り当てられる明確なピークが明確に観測されなかったため、より詳細なスペクトル分析アルゴリズムの使用が必要となる。しかし、ピークDの存在は、グラフェン構造をスペクトルに割り当てるための必須条件ではない。結果として、Gバンド（範囲1569-1600cm-1）近傍に適合する振動極大を示すこれらの物体が、本報告の対象として選ばれた。このDバンドとその可変周波数と形状の解釈については、まだ未解決の議論がある（Ferrari and Robertson, 2004）。方法論序論で概説したように、Dピークの強度は、一般に1355 cm-1付近にあり、Gピークとの強度比（ID / IG）は、ドーピング、非常に異なる官能基の導入、ネットワークの連続性の断絶など、さまざまな要因によって導入されたグラフェンネットワークの無秩序の程度を示している。秩序グラファイト材料では、このピークDは見られない。このサブグループ2.2.のいくつかのスペクトルでは、標準よりも高い周波数（ブルーシフト）を持つ他のピークが現れ、振動モードDへの帰属が可能である。したがって、現時点では、これらのスペクトルについて、rGOパターンの位置に対するDピークの不在またはドリフト（シフト）については、利用可能なモデルに従って構造的解釈を行う必要があると述べるしかない。文献によると、GピークとDピークのシフトの変化、幅と強度の変化、およびこれらのスペクトルに見られる他のピークの存在は、異なる程度の無秩序、酸化、ドーピング、官能基化、構造破壊など、まだ決定されていない非常に多様な修飾によるものである可能性がある。これらの修飾の研究は、この報告書の範囲外である。

1200-1800cm-1の範囲に加え、RAMANスペクトロスコピーを2800cm-1まで拡張した対象物（n.3,8、11）では、低強度・低振幅の2次元ピークが検出された。しかし、rGO標準試料でも、Gピークを最大に持ついくつかの試料でも、このピークの強度は、スペクトルのGピークやDピークに比べて常に非常に低かった。これは、グラフェン酸化物では、GおよびDピークに対する2Dピーク（～2700 cm-1）の相対強度が大幅に低下していることに起因している可能性がある。したがって、本研究では、限られた時間内にできるだけ多くの対象物をスキャンするために必要な、より高い効率性と限られたリソースの利用という理由から、2Dピークの分析は一般的に見送った。将来的には、すべての対象物についてこのピークを調べ、この振動モードが最小に現れる対象物におけるI2D/2G強度の比を推定し、構造の層数を推定することができれば興味深い。

この研究で示された物体は、明視野光学顕微鏡（100倍）の低倍率で見える微小物体のごく一部である。これらの物体は、G振動モードのピークに割り当てられるバンドがないため、グラフェン構造とは一致しない。これらの物体の多くが、1439-1457cm-1バンドにRAMAN極大を示すことは非常に興味深い。同様に、グループ2.2の対象物でも、1450cm-1付近に顕著なピークが、GとDのピーク（11,12,14,15,16,17,20,21,23,24,25,26,28）と組み合わさって、このバンドに頻繁に見られる。1450cm-1付近のこのバンドは、グラフェンの特定のピークに対応していないため、その帰属はまだ未定であるが、この振動モードが頻繁に現れることから、試料の組成を知る上で非常に重要であると考えている。作業仮説として、このバンドは通常、一対の水素を曲げる（シザリング）ことによって有機メチレン基-CH2-に割り当てられる。しかし、このバンドは芳香環に関連する中程度の強度のバンドとも言われており、そうであればグラフェンにも関連する可能性がある（Ferrari and Robertson, 2004）。前述したように、このバンドの別の可能性としては、グラフェン以外の化合物の振動モードが重畳したもの、あるいは、乾燥後に残るハイドロゲル媒体の振動モードである可能性が高い。この残渣は、多くの場合、その中に埋め込まれたままの物体に重なるRAMAN振動を示す可能性があるが、乾燥ドラッグゾーンの限界でゲルの外側に現れるものには現れない。この意味で、この媒質の振動モードは、サブグループのスペクトルにおいてグラフェンのGおよびDのピークと重なって現れる可能性がある。

2.1. この媒質および試料の全成分の特性を調べることは、この研究の範囲を超えている。しかし、ポリビニルアルコール（PVA）、メチルアクリルアミド、ポリマーPQT-12など、RAMANシグナルがこのバンド周辺で顕著な振動モードを示すハイドロゲルマトリックスを形成できる物質がいくつか存在する（Mik Andersen, corona2inspect.blogspot.com/ pers. com）。また、これらの物質の一部は、PQT-12の人工シナプス（Chen and Huang, 2020）、メチルアクリルアミドとグラフェンを組み合わせた神経細胞再生用ゼラチン（Zhu et al, 2016）、PVA/GOエレクトロスパン繊維（Tan et al, 2016）など、科学文献に見られる実験的な生物医学デザインにおいてグラフェンと組み合わされていることも事実である。現在、1450cm-1近傍のピークの帰属に関するこれらの仮説はすべて未解決のままである。

結論として、合計110個のスキャン対象物のうち、酸化グラフェンの存在を示す明確なシグナルが8個、グラファイトまたはグラフェン構造の存在に適合するシグナルが20個見つかった。グラフェンのような外観を持つ110個のナノ粒子のうち、今回スキャンした残りの物体では、グラフェンに適合するシグナルは検出されなかった。

この研究の続きとして、micro-RAMAN 分析はグラフェン構造を持つ物体の存在を示す決定的な兆候を示したが、同定の確実性を高め、構造的な特徴付けを深めるためには、XPS 分光法や TEM 電子回折法などの顕微鏡と分光学の連成技術を用いた補完的な分析を実施するのが便利であろう。

今回の調査では、ほとんどの試料を密封バイアルから採取した。また、試料の抽出とラマン顕微鏡用のスライドへの移し替えは、層流チャンバー下の無菌条件下で行った。しかしながら、製造、流通、加工過程におけるサンプル汚染の可能性、およびこれらの知見の同等サンプルへの一般的な適用可能性については、これらの製品の類似バッチの日常的かつより広範なモニタリングによって評価する必要がある。

このサンプリングの結果は、分析されたいくつかのサンプルにおけるグラフェン構造の存在に関して決定的なものであるが、この研究は継続の余地があると考えられ、再現と最適化のために科学コミュニティに提供される。分析されたサンプルは厳重に保管され、将来の科学的共同研究のために利用可能である。

結論

分子構造に特徴的な分光学的フィンガープリントを用いてグラフェン様の微視的物体を特徴付けるために、結合型micro-RAMAN技術を用いてCOVID-19ワクチンバイアルのランダムサンプリングを行った。

micro-RAMAN技術では、イメージングとスペクトル分析を一緒に考慮すべき観察的証拠として結合させることで、材料の同定の信頼度を強化することができる。

標準物質との類似性によって、RAMANシグナルが明確にグラフェンオキシドに対応する物体が検出された。

また、グラフェン誘導体と一致する可変スペクトルシグナルを示す物体もある。これは、この物質の芳香族構造に関連付けることができる特異的なRAMANシグナル（Gバンド）が、その可視的な外観とともに多数存在するためである。

この研究はまだ継続、対比、再現の余地がある。この技法や他の補完的な技法を用いて、有意なサンプリングに基づく分析をさらに進めれば、これらの薬物中のグラフェン物質の存在レベルや、その詳細な化学的・構造的特性について、十分な統計的有意性をもって評価することができるだろう。