ポップコーン(Zea Mays L. var. Everta)の抗酸化能と総フェノール含量の分析

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Analysis of Popcorn (Zea Mays L. var. Everta) for Antioxidant Capacity and Total Phenolic Content

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6356482/

2019年1月14日にオンライン公開

マイケル・G・ココ・ジュニア、ジョー・A・ヴィンソン※1

要旨

世界で最も人気のあるスナック菓子の一つであるポップコーンは、高繊維質で健康的な食品として知られている。我々の研究によると、市販のポップコーンにはフェノール酸として知られる抗酸化物質も相当量含まれていることがわかった。生ポップコーンおよびポップコーンエキスの総抗酸化能は、Folin-CiocalteuおよびFRAPアッセイを用いて定量化された。ポリフェノールはカーネルの果皮にのみ存在し、オリゴ糖繊維のマトリックスと完全に結合していることが確認された。フェノール酸のバイオアベイラビリティを予測するために、in vitro 消化試験も行われた。平均して、9つの市販ポップコーンサンプルは、アルカリ加水分解後に5.93 ± 0.92 mg/gの総ポリフェノールを含み、Folin-Ciocalteuアッセイで測定した体外消化後には2.66 ± 0.15 mg/gを含んでいる。さらに、ポッピング加工は抗酸化力を著しく低下させないことがわかった。これらの結果は、かなりの量の結合したポリフェノールが生物学的にアクセス可能であることを示している。生物学的に利用可能なポリフェノールが多いことから、ポップコーンは食事性ポリフェノール抗酸化物質の重要な供給源となる可能性がある。

キーワード:ポップコーン、ポリフェノール、抗酸化能、Zea mays L.、果皮、Folin-Ciocalteu、FRAP

1. はじめに

スナック菓子は一般的に脂肪分や糖分を多く含むという点で、栄養士から否定的な見方をされている。しかし、これはほとんどのスナック食品に言えることかもしれないが、中には単に食事と食事の間に食べる以上のものを消費者に提供する可能性を持つものもある。実際、いくつかの研究では、間食は成人の全体的な食事の質および全粒粉の消費量と正の相関があることが示されている[1]。人気のあるスナックの1つであるポップコーンは、ポテトチップスなどの他のスナックに代わる健康的な全粒粉の代替品として知られている。

2015-2020年の「アメリカ人のための食事ガイドライン」によると、1日の総穀物摂取量の少なくとも半分(約3オンス)は全粒粉であるべきとされている[2]。しかし、ほとんどのアメリカ人が1日に食べる穀物の推奨量である9~11皿に達しているか、それを超えている一方で、1日に推奨量の最低3皿の全粒粉を食べるアメリカ人は8%未満である[2,3]。ヨーロッパでは、1日の全粒穀物消費量は国によって大きく異なり、イタリアでは4g/日、デンマークでは58g/日と高い数値を示している[4,5]。ある消費調査によると、スナック菓子は全粒粉の消費量の3分の1を占めている[6]。全粒粉を食べることは、2型糖尿病、冠状動脈性心臓病、高血圧を含む慢性疾患のリスク低減を含むいくつかの健康上の利点と関連している[7,8,9]。

この研究の目的は、いくつかの市販のポップコーンに含まれる抗酸化物質の含有量を測定することであった。植物は、ポリフェノールとして知られる生物活性化合物を大量に含むことが知られており、これらの化合物は抗酸化活性を持つことが研究で示されている[10]。一般的にトウモロコシはフェノール酸を多く含むことが知られており、フェルラ酸が優勢である[11]。アルカリ加水分解により総フェノール量(結合しているものと結合していないものの両方)を測定し、ポップコーン中のポリフェノールがどの程度生物学的に利用可能であるかを予測するために、in vitro消化シミュレーション試験を実施した。総フェノール量と抗酸化力を測定するために、Folin-CiocalteuアッセイとFerric Reducing Ability of Plasma (FRAP) アッセイがそれぞれ使用された。ポップコーンと他のトウモロコシの大きな違いは、ポップコーンの果皮(スキン)が他の種類のトウモロコシの果皮ほど硬く、多孔質でないことだ。この性質により、ポップコーンは加熱されると中の水分が蒸気に変わり、外皮が破裂して弾ける。果物や野菜の皮には、中の果実よりも多くのポリフェノールが含まれていることが知られている[12]。ポップコーンは他のトウモロコシに比べて外皮や果皮の密度が非常に高いため、ポップコーンには相当量のポリフェノールが含まれているはずである。

2. 材料と方法

2.1. 試料

この研究では、9つの市販のポップコーンカーネルを選択した。ポップコーンカーネルのサンプルは、地元の食料品店から入手するか、ポップコーン会社から提供された(ブランド3および5)。これらのサンプルは、ブランド間で違いがあるかどうかを確認するために、総ポリフェノール含有量を調査するために選ばれた。個々のバンドには1~5のラベルが貼られている。同じバンド名で異なる製品はアルファベットで表記している。ブランド3のサンプルは「殻なし」と宣伝されているが、これはほとんどの種類のポップコーンと比較して、果皮が柔らかく薄いことを意味する。

2.2. 化学物質

HPLCグレードのメタノール、ヘキサン、無水酢酸ナトリウム、Folin-Ciocalteuのフェノール試薬、98% 2,4,6-トリピリジル-s-トリアジン(TPTZ)、98% (+)-カテキン水和物、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、胆汁エキス(豚)、ペプシン(豚胃粘膜由来)およびパンクレアチン(豚膵臓由来)はSigma Chemical Co.から購入した。(St. Louis, MO, USA)から購入した。ナノ純水は、Milli-Q System (Millipore Corp., Milford, MA, USA)から入手した。

2.3. 試料調製

試料を秤量し、SPEX社製サンプルプレップ6750フリーザー/ミルで微粉末にした。次に、サンプルをガラスバイアルに移し、Labconco FreeZone 12 Plus 凍結乾燥機で、コレクター温度を-80 ℃に設定し、サンプルに存在する水分や粉砕プロセス中に吸収されたかもしれない水分を取り除くために一晩凍結乾燥した。凍結乾燥後のサンプルの重量減少は平均で10%未満であった。サンプルは、さらに処理するまでは-20℃で保存された。

果皮と胚乳+胚芽の間のフェノール含量と抗酸化力の違いを調べるために、生果実の果皮をメスで残りの部分から切り離した。果皮と胚乳+胚芽は、上記のように粉砕した。

ポッピングの効果を調べるために、3つのポップコーンカーネル銘柄を家庭用電子レンジでポッピングした。ポップしたカーネルを微粉末にし、ホールカーネルと同じ方法で処理した。

2.4. 試料処理

2.4.1. 化学的加水分解

粉砕したポップコーン試料を秤量し(0.2 g)、ヘキサンを用いて試料から可溶性油脂を抽出した。サンプルは、Nardini [13]の修正プロトコルを用いて、ポリフェノールに共有結合している糖または繊維を加水分解するために塩基性加水分解に供された。4.0 mL のメタノール、1.0 mL の 0.1% アスコルビン酸溶液、2.0 mL の 2.4 M NaOH をプラスチック製の移し替えチューブに入れた試料に加え、短時間ボルテックスした。その後、定期的に攪拌しながら、37 ℃で4 時間試料を加熱した。その後、室温まで冷却し、3.0 mL の 2.4 M HCl を添加した。その後、サンプルを80℃で2時間加熱し、サンプルに添加されたアスコルビン酸を分解した。サンプルは、さらに分析するまで-20℃で保存した。サンプルは複製を作成した。
2.4.2. In vitro 消化法 Liu [14]が以前に記載した方法を改変して使用した。3 種類の銘柄を分析した。0.5 g の粉砕ポップコーン試料を 18 mL の生理食塩水 (140 mM NaCl、5 mM KCl、150 μM BHT) と混合し、0.1 M HCl で pH 2 まで酸性化した。その後、0.5 mLのペプシン溶液(0.1 M HCl 5 mL中0.2 gのペプシン)と混合し、37℃の振盪水槽で1時間インキュベートした。胃の消化後、消化物のpHは0.1 M NaHCO3で6.9まで上昇させた。さらに、2.5 mLのパンクレアチン-胆汁溶液(0.1 M NaHCO3 20.0 mL中の胆汁抽出物 0.240 gおよびパンクレアチン 0.040 g)を加えて腸内模擬消化を行い、37 ℃で2時間振盪水浴でインキュベートした。重力濾過で固形物を濾過し、消化液はさらなる分析まで-80 ℃で保存した。複製試料を調製した。

2.5. 分析方法

ポリフェノール含有量はFolin-Ciocalteu法により、抗酸化力はFerric Reducing Ability of Plasma (FRAP) assayにより測定された。(+)-カテキン水和物を用いて標準曲線を作成し、各化学加水分解サンプルの抗酸化能と総フェノール含量を測定した。すべての吸光度の測定には、Genysis 20 spectrophotometer (Thermo Scientific)を使用した。Folin-Ciocalteuアッセイは、Folin-Ciocalteuのフェノール試薬5×をナノ純水で希釈することによって行った。200 µLの抽出物を2000 µLの作業用試薬と混合した。キュベット内のアッセイ混合物を室温で20分間反応させた後、750 nmで吸光度を測定した。総フェノール量は、ポップコーン1gあたりのmgカテキン相当量として報告される。

使用したFRAPアッセイ手順は、BenzieとStrainによって記述された手順を修正したものである[15]。3つの試薬を用意した;pH3.6の酢酸バッファー、40 mM HCl中の10 mM TPTZ、水中の20 mM FeCl3である。緩衝液、TPTZ、FeCl3 の比率が 10:1:1 となるように 3 種類の試薬を混合し、作業試薬を調製した。20 µLの抽出物と2000 µLの作業用試薬をピペットでキュベットに入れ、37 °Cのオーブンに10分間置いた後、593 nmで吸光度を測定した。抗酸化能は、ポップコーン1gあたりのmgカテキン換算値として報告されている。

2.6. 干渉試験

使用したアッセイと相互作用する可能性のあるサンプル中の干渉物を測定するために、化学的加水分解抽出物をPolyclar VTカラム(GAF Chemicals、400μm)に通し、溶出液中に水溶性の干渉化合物を残してポリフェノールを除去した。手順はAgbor [16]から採用した。5 mLプラスチックシリンジに約20 mgのコットンと300 mgのPolyclarを充填し、カラムを調製した。3 mLのメタノールを流し、2.4 M HClを2 mL流してカラムを平衡化した。その後、抽出液3 mLをカラムに通し、溶出液3 mLを10 mLのスクリューキャップ付きプラスチックチューブに採取した。溶出液は、Folin-Ciocalteu法およびFRAP法により、ポリフェノール以外の妨害物質について試験した。干渉物は見つからなかった。

2.7. 統計解析

統計解析にはSigma Stat 3.0(Jandel Scientific)を使用した。すべてのサンプルは、各アッセイについて二重に調製し、各サンプルについて3回の読み取りから平均と標準偏差を決定した。対の学生のt検定は、2つのデータセット(すなわち、同じサンプルのポップコーン対生カーネル)が互いに有意に異なるかどうかを判定するために使用された。Pearson および Spearman プロダクトモーメント相関係数は、2つの異なるアッセイ間の一致を分析するために使用された。p < 0.05の結果はすべて有意とみなされた。線形回帰は、データの傾向を特定するために使用された。

3. 結果

3.1. 遊離型ポリフェノール

ポップコーンの遊離(結合していない)抗酸化物質含有量は、粉砕したポップコーン試料0.2gを10mLの50/50メタノール/水溶液で一晩撹拌して分析した。この方法では、いずれの比色分析法でも抽出されたポリフェノールや抗酸化力を検出することはできなかった。これは、ポリフェノールが共役(結合)して不溶性食物繊維を形成しているためと思われる。トウモロコシの主要なフェノール酸の1つであるフェルラ酸は、アラビノキシランやペクチンと架橋を形成している[17]。したがって、体内に吸収されるためには、ポリフェノールはGI管で加水分解される必要がある。

3.2. 化学的加水分解後のFolin-CiocalteuおよびFRAPアッセイ

プレーン、アンポップカーネルの総平均フェノール含量と抗酸化力は、Folin-Ciocalteu法で5.93 ± 0.92 mg catechin equiv/g corn、FRAP法で11.2 ± 1.5 mg catechin equiv/g cornとなった(表 1)。このアッセイは、図1に示すように、この一連のデータについてピアソン相関係数 r = 0.720 の正の相関を示し、総フェノール含量が抽出物の抗酸化能と有意に相関する(p < 0.05) ことが示された。FRAPとFolin-Ciocalteuアッセイとの間のこの相関は、以前に植物抽出物で観察されたものである[18]。この結果は、ポップコーンのフリーラジカル還元能が、穀粒に含まれるフェノール化合物の存在によるものであることを示している。

図1

FRAPアッセイとFolin-Ciocalteuアッセイの間には正の相関が存在し、抗酸化力が総フェノール量と密接に関連していることを示す、r = 0.720 (p < 0.05).

表1 化学的塩基性加水分解によって見出された生の穀粒サンプルの総フェノール量と抗酸化力

量は1グラムあたりのmgカテキン換算値で報告されている。結果は平均±標準偏差、n = 2。

サンプル フォリンアッセイ(mgカテキン/ g) FRAPアッセイ(mgカテキン/ g)
ブランド1 4.66±0.31 10.5±0.4
ブランド2 5.23±0.27 11.1±0.5
ブランド3A 5.49±0.10 9.76±0.15
ブランド3B 6.01±0.04 11.6±0.2
ブランド3C 5.29±0.19 8.73±0.12
ブランド3D 6.02±0.10 12.0±0.2
ブランド4 6.07±0.02 12.8±0.5
ブランド5A 7.20±0.04 11.1±0.9
ブランド5B 7.47±0.05 13.4±0.1
平均 5.93±0.92 11.2±1.5

さらに、果皮と胚乳+胚芽の総フェノール量と抗酸化力の違いについて検討した。平均して、生のポップコーンカーネルの果皮は、カーネル全体の総フェノール含量の98.3%と抗酸化力の97.8%を含んでいる。図2は、Folin-CiocalteuとFRAPアッセイの両方について、カーネルと胚乳+胚芽の比較を示している。果皮は、調査したすべての銘柄の平均で、総フェノール量が53.1 ± 8.8 mg catechin equiv/g pericarp、抗酸化力が72.8 ± 3.4 mg catechin equiv/g pericarpであることが分かった。胚乳+胚芽の平均総フェノール量は0.9 ± 0.4 mg カテキンequiv/g胚乳、抗酸化力は1.7 ± 0.4 mg カテキンequiv/g胚乳であった。

図2 ポップコーン果皮と胚乳+胚芽の平均総フェノール量(Folin)および抗酸化能(FRAP)

* 果皮と胚乳を比較すると、果皮の方が有意に多くのフェノール酸を含んでいる(n = 9, p < 0.05)。 ポップコーンは生のカーネルとしてではなく、ポップして消費されるため、ポップがフェノール含量と抗酸化力に何らかの影響を与えるかどうかを調べる研究が行われた。この実験では、3つの異なる市販のカーネルから3つのカーネルサンプルを選んだ。これらのサンプルは、電子レンジを使用してポップされ、その後、サンプル調製と化学的加水分解の手順で調製された。Folin-CiocalteuとFRAPアッセイは、両方のサンプルのセットで実施された。その結果は、図3にまとめられている。カーネルとポップしたサンプルの間の有意差の検定には、対の平均値に対するStudentのt-testが使用された。 図3 加水分解した生ポップコーンカーネルとポップコーンカーネルのFolinによる平均総フェノール量とFRAPによる抗酸化力(mgカテキン/g)。ポップしたカーネルと生のカーネルの間に有意差はない。(n = 3, p > 0.05)。

3.3. 体外消化後のFolinおよびFRAPアッセイ

ポップコーンに結合したポリフェノールが胃の消化によってどれだけ効率的に遊離されるかを理解するために、in vitro消化シミュレーションを実施した。ポップコーンに含まれるポリフェノールが、胃の中でどの程度消化されるのかを調べるため、生のカーネルとポップコーンの両方が分析された。この研究の結果は、Figure 4にまとめられている。消化されたサンプルのうち、対のt検定では、抗酸化能力についてポップしたカーネルと生のカーネルのサンプルの間に有意差があり(p < 0.05)、ポップした消化サンプルはより高い抗酸化能力を持つことが示された。平均抗酸化力は生カーネルで0.76 ± 0.33 mg カテキンequiv/gコーン、ポップで1.25 ± 0.12 mg カテキンequiv/gコーンであった。総フェノール量については、ポップしたカーネルと生のカーネルサンプルの間に有意な差はないようである(p > 0.05)。平均的な総フェノール含量は、生カーネルで2.57 ± 0.91 mg カテキンequiv/g、ポップで2.66 ± 0.15 mg カテキンequiv/gであった。

図4 試験管内消化を行ったサンプルのFolinによる総フェノール量とFRAPによる抗酸化力の平均値(mgカテキン/g)

* 抗酸化力については、鉄還元力(n = 3、p < 0.05)で有意な増加が見られる。

4. 考察

4.1. 酸化防止剤の量

異なる穀物(オーツ、小麦、米)の中で、トウモロコシはフェノール酸による抗酸化活性を最も多く含むことが示されている[11]。しかし、フェノール酸のほとんどは不溶性食物繊維に結合している。Dewantoらは、生のスイートコーンの遊離総フェノール含量を0.250 ± 2.0 mg/gと報告する一方、塩基性加水分解で抽出したコーン試料では総フェノール含量2.64 ± 0.10 mg gallic acid equiv/gと報告している(乾燥重量ベース) [11,19].これは、塩基性加水分解の平均値 5.93 ± 0.92 mg カテキン equiv/g および試験管内消化の平均値 2.66 ± 0.15 mg カテキン equiv/g と比較して良好で、フリーフェノール含量の値が低いことが裏付けられた。ポップコーンに使用されるトウモロコシの品種は、他の研究対象のトウモロコシの品種と比較して、乾燥フェノール総量がわずかに大きいとは言えないまでも、同等であるようである。ポップコーンはほとんど加工や準備をせずに消費することができる。最近のレビューによると、調理や乾燥などの熱処理は、調理方法や種によって食品のフェノール含量に様々な結果をもたらす可能性がある[20]。熱処理に関して、穀物のフェノール含量は焼成によってほとんど影響を受けないようで、調理したスイートコーンのフェノール含量は焼成後に54%増加する[19,21]。この研究では、フェノール類を化学的加水分解で抽出した場合、抗酸化能と総フェノール含量は電子レンジでのポップによって有意な影響を受けないことが示された(p > 0.05) したがって、ポップ工程はカーネルにもともと存在するフェノール化合物を劣化させないように思われる。しかし、試験管内消化で抽出した場合、ポップしたカーネルは生のカーネルと比較して、有意に抗酸化力が高かった。

試験管内消化は、調理済み食品の総フェノール含量を増加させることが示されている。例えば、最近Tiらは、試験管内消化後に調理した玄米の総フェノール含量と抗酸化能が増加することを示した[22]。一般的に、調理や熱処理によって細胞壁が破壊され、結合しているフェノール化合物が遊離すると考えられている[19,22]。これは、特に我々が観察したような酵素消化の場合、抽出量の増加につながると思われる。

4.2. 食事性抗酸化物質の供給源としてのポップコーン

ポップコーンは人気のある全粒粉のスナック食品であるため、アメリカの食生活において重要な植物化学物質の供給源となる可能性がある[6]。実際、アメリカ人が消費する全粒穀物の総量のうち、17%がポップコーンに由来している[23]。ポップコーン消費者はまた、ポップコーン非消費者に比べて250%高い全粒穀物摂取量と22%高い食物繊維摂取量を持っている[6]。アメリカの平均的な食事における一人当たりの総ポリフェノール摂取量は、アメリカの食品と飲料に関する我々のデータでは約2000mgである(Vinson、未発表の結果)。平均的なポップコーンの消費者が1日に39gのポップコーンを消費すると考えると [6]、Folin-Ciocalteu法で測定した総ポリフェノールの値に基づき、この消費者は食事で摂取する総ポリフェノールの平均約240mg(12%)をポップコーンから摂取していると考えられる。

この研究により、ポップコーンは相当量のポリフェノールを含んでいることが判明した。さらに、in vitro消化試験により、摂取されたポップコーンに含まれる総ポリフェノールのうち、最大50%が生物学的に利用できる可能性があることが示されている。食物繊維に結合したフェルラ酸は、エステル結合したヒドロキシシンナメートに対して活性を持つエステラーゼを介して哺乳類で生物学的に利用できることが既に知られている[24]。さらに、ヒトにおいては、フェルラ酸は消化過程において全粒穀物から遊離し、体内に入ることが示されている[25]。動物におけるフェルラ酸の摂取は、酸化ストレスの低下、インスリンの増加、脂質や動脈硬化の減少、血圧の低下などに作用することが示されている[26]。したがって、糖尿病、心臓病、高血圧のリスクの低減は、ポップコーンなどの全粒穀物に含まれるフェルラ酸を消費することによって得られる可能性がある。しかし、穀粒全体を消費することが非常に重要だ。果皮はポップコーンの全重量の15-20%に過ぎないにもかかわらず、フェノール含有量と抗酸化物質の約98%が果皮に含まれている。スイートコーンも同様の重量分布をしており、カーネル重量の20%が果皮である[11]。これは、トウモロコシとその抗酸化能力に関する以前の研究 [19,27]と一致する。トウモロコシのふすまは、現存する食品の中で最も高い抗酸化力を持つものの一つである。

ポップコーンは、加工されていない穀物やポリフェノールの理想的な供給源となっているため、ポッピング工程はフェノール含有量に実質的な影響を与えない。実際、プレーンとエアポップで食べるポップコーンは、重量で100%全粒粉の唯一の食品である。しかし、それはしばしば脂肪と塩を添加して消費されており、過剰に食べるとダイエットと健康に悪影響を及ぼす可能性のある成分である[28,29]。ポップコーンの人気と入手のしやすさは、果物や飲料などの他の供給源とともに、1日の抗酸化物質摂取量の大部分を供給する可能性がある。ポップコーンはまた、スナックやデザートの中で最も満腹感を得られる食品である[30]。例えば、ヒトの酸化ストレスと炎症を増加させることが示されているアクリルアミドを多く含むポテトチップスより1.6倍も満腹感がある[31,32]。したがって、全粒粉ポップコーンは、エネルギー摂取量、ひいては体重を管理しながら空腹感を軽減したい人にとって賢明な選択である。参考までに、カップ1杯のエアポップコーンは約30キロカロリーしかない。さらに、ナッツやスパイスには大量の抗酸化物質が含まれているため、スパイスやナッツなどの調味料と組み合わせると、ポップコーンはさらに理想的なスナックになる [33]。したがって、利用可能なスナック食品の中で、ポップコーンはバランスの取れた食事の一部として最も健康上の利点を提供する可能性があることは確かである。

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