A vaccine that prevents pregnancy in women
Proc. Natl. Acad. 米国
第91巻 8532-8536頁 1994年8月 免疫学
国立免疫学研究所（インド、ニューデリー110067）、^インド医学教育・研究大学院（インド、チャンディガル）産科・婦人科、^サフダイジュン病院（インド、ニューデリー）、TA11インド医科学研究所（インド、ニューデリー）、11インド医学研究評議会（インド、ニューデリー）。
インド医学研究評議会（インド、ニューデリー
1994年5月4日、Frederick C. Robbinsより報告（1994年1月3日査読受理）。
要旨
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のPサブユニットとヒツジ黄体形成ホルモンのaサブユニットを非共有結合させ、破傷風およびジフテリアトキソイドをキャリアとして結合させた異種二量体からなり、hCGに対して高い抗体価（Ka〜1010 M_1）を誘導する避妊ワクチンの臨床試験結果を報告する。1224周期にわたって受胎にさらされた妊娠可能な女性は、50ng/mlを超える抗体価（hCG bioneutralization capacity）で1回のみ妊娠を記録した。抗体反応は時間とともに低下し、抗体価が35ng/ml未満に低下すると受胎可能性を回復した。この研究は、ヒトの受胎可能性をコントロールするワクチンの実現可能性を示す証拠である。
多くの避妊法が利用可能である。しかし、それらはすべての潜在的な利用者に適しているわけではない。特に、可逆的で、定期的な摂取が必要なだけで、月経の規則性や出血を妨げない方法を開発する必要がある。生殖能力を調節するワクチンは、これらの仕様を満たす有望な可能性を秘めている。これらのワクチンの理論的根拠は、抗体および／または細胞媒介免疫の形成を誘導し、生殖の成功に重要なプロセスを選択的に阻止することである。多くの抗原候補が研究されている(1-7)。その中で、生殖能の調節に重要な役割を果たすホルモンがある。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）は受胎の初期シグナルであり、初期の妊娠の成立と維持に不可欠であると考えられている。免疫避妊の標的としてhCGを選択する利点は、その不活性化が排卵や性ステロイドホルモンの産生など、女性の他の生理的過程を妨げないことである。
hCGに対する女性の免疫寛容を克服する戦略として、破傷風トキソイド（TT）とのキャリア結合が提案された(8)。この最初のプロトタイプワクチン（ミョウバンに吸着させたJhCG-TT）には限界があった。このワクチンで高い抗体価が得られたのはごく一部の女性だけで、低い抗体価の女性は妊娠から守られなかった(9)。免疫原性を高めるために3つの変更が加えられた。
(z)アジュバント、リポ多糖のナトリウムフタリル誘導体を最初の注射に加えた。この非パイロジェン性アジュバントは水相で使用できる(10)。このアジュバントの使用により、抗hCG力価は平均して2倍になり、高反応者の頻度も増加した。
07) /3hCGの本質的な免疫原性は、これをヒツジの黄体形成ホルモン(LH)のaサブユニットと非共有結合させて異種二量体(HSD)を形成させることによって増強された。この実験室で作られたホルモンは、標的組織上のレセプターを認識するコンフォメーションをとり(単離されたサブユニットは認識しない)、hCGによるものよりさらに優れたステロイド形成反応を起こす(11)。担体と結合したHSDは、ラットとサルにおいて、/3hCGよりも免疫原性が高いことが確認された(12)。さらに、抗体はhCGの生理活性を中和する能力が高かった(11, 13)。
(iii) HSDは、TTまたはジフテリアトキソイド(DT)という2つの異なる担体のいずれかと結合させた。このようなスケジュールが採用されたのは、同じ担体との結合体を繰り返し注射すると、ごく一部の女性で観察された担体誘発性の免疫抑制が、ホルモンサブユニットを別の担体に結合させることで克服できるからである(14)。
前臨床毒性学的研究、倫理および医薬品規制当局の承認を経て、インドの5つの施設でHSDワクチンの第1相臨床試験が実施された。被験者は選択的卵管結紮術を受けたことのある女性であった。ワクチンはすべての女性に抗hCG抗体を誘導することができた(15)。この反応は可逆的であった。排卵と月経の規則性は影響を受けず、出血の期間と量は正常であった(16)。免疫された女性の36の血液学的、生化学的、代謝学的、内分泌学的パラメーターを注意深く調べたところ、重大な副作用は認められなかった(17)。同様の結果は、ニューヨークの人口評議会避妊研究国際委員会の後援の下、ヘルシンキ、ウプサラ、バイーア、サンティアゴで16人の女性を対象に行われた3hCG-TTワクチンによる試験でも得られている（18）。
サルおよび女性（第I相臨床試験）において、HSDおよび/3hCGをベースとしたワクチンによって誘導された抗体が体組織と反応するかどうかを調べることが重要であった。免疫病理学的研究では、核、DNA、頭頂細胞、平滑筋、膵島細胞、副腎皮質、甲状腺ミトコンドリア、サイログロブリン、C反応性蛋白、リウマチ因子の反応性がないことが示された(19)。
サルのCGとLHの両方に対する抗体を誘導する類似のワクチンで7年間過剰免疫したサルでも慢性毒性試験が行われた。下垂体や腎臓を含むどの臓器においても、有意な免疫病理は観察されなかった(20, 21)。さらに、1977年から1978年の第1相臨床試験中にこのワクチンで免疫された女性は、自己免疫疾患の症状を示さなかったし、その血清はヒトや霊長類の体組織と反応性を示さなかった。しかしながら、ワクチン開発が進むにつれ、組織交差反応性の可能性を考慮する必要がある。
本試験の目的は、ヒツジLHのaサブユニットと/3hCGの異種二量体をベースとしたワクチンが女性の妊娠を予防できるかどうか、また予防できるとすれば有効性に必要な抗体価のレベルを決定することである。
材料と方法
ワクチン 改良型ワクチンはHSDとTTまたはDTを結合させたものである。HSDは10mMリン酸緩衝液（pH7.2）中、37℃で24時間、等モル濃度の/3hCGとヒツジLHのaサブユニットをインキュベートすることにより作製した(11)。HSDとキャリアの結合は記載(14,15)に従って行った。最初の注射は、ミョウバンに吸着させたHSD-TTとHSD-DTをそれぞれ150 /xg、リポ多糖のナトリウムフタリル誘導体1.0mgとともに行った。その後の注射は、ミョウバンに吸着させたHSD-TTまたはHSD-DTを交互に300 /xgずつ行った。
試験プロトコールと手順 試験はニューデリーのAll India Institute of Medical SciencesとSafdaijung Hospital、ChandigarhのPostgraduate Institute of Medical Education and Researchで行われた。インド医薬品監督局および施設倫理委員会の承認を得た。これらの施設の家族計画クリニックに通院している女性が、インフォームド・コンセントを得た上で研究に登録された。彼女たちは生殖可能な年齢（20〜35歳）で、活発な性生活を送り、定期的な月経周期があると報告された。すべてのボランティアには少なくとも2人の子供がいた。2回の免疫前周期の18日目と24日目に血液サンプルを採取し、排卵を確認するためにプロゲステロン濃度を分析した。妊娠が疑われる女性や授乳中の女性は試験に組み入れられなかった。さらに、反復流産、二次性不妊症、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、内分泌疾患の既往歴のある女性、悪性腫瘍の既知または疑いのある女性も除外された。
予防接種は、6週間間隔で3回のワクチン1次注射を行った。その後、抗体価を50ng/ml（hCGビオネオ中和能）以上に維持するために、必要に応じてブースター注射を行った。被験者は、各サイクルの1週目と3週目に、フォローアップのためにクリニックに来院する必要があった。来院ごとに採血を行い、抗体価を測定するために国立免疫学研究所に送った。
抗体の中和能は、先に述べた受容体結合阻害アッセイを改良して推定した(13)。簡単に述べると、2～3ヶ月齢のWistar系近交系ラットの精巣を脱嚢し、5mM MgCh、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%アジ化ナトリウムを含む50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.4）中、ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートをナイロンメッシュで濾過し、500 x g、4℃で10分間遠心した。得られたペレットを、1対の精巣につき8mlのTris緩衝液に再懸濁した；50/xlの精巣ホモジネートを、100/xlの各種希釈ヒト血清および1ngの125I標識hCG（125I-hCG）（8-12/xCi//xg；1Ci＝37GBq）と共に、37℃で2時間インキュベートした。アッセイは、1mlの冷Tris緩衝液を加えて終了した。チューブを2000 x gで遠心し、得られたペレットをTris緩衝液で洗浄し、放射能を測定した。125I-hCGの結合を50％阻害する血清の希釈率を回帰分析によって計算した。ビオネ中和能は血清1mlあたりngで表した。hCGに対する抗体のアビディティは、基本的に記載されているようにコールドディスプレイスメント法で決定した(15)。12.5％PEG8000で沈殿させた結合画分を1500×g、20分間の遠心分離で分離し、LKBマルチ-/カウンターでアッセイした。結合定数は非線形回帰分析により計算した。ヒト甲状腺刺激ホルモン、ヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト LH との抗血清の交差反応性は直接結合アッセイにより決定した(15)。黄体期血液検体中のプロゲステロン濃度は、世界保健機関（WHO）のマッチド試薬プログラム（Matched Reagents Program）から供給された試薬を用いて、RIAにより推定した。月経記録とフォローアップ用紙は毎月、国立免疫学研究所とインド医学研究評議会に送られた。
抗体レベル50ng/ml（hCGビオネ中和能）を有効性試験の推定閾値とした。95％の信頼性を得るためには、少なくとも750周期の観察が必要であった。代替避妊法（子宮内避妊具またはコンドーム）は、閾値以上の抗体価が得られるまで処方され、その後はすべての代替避妊法が中止された。結果は1週間以内に各センターに報告された。抗体価が50ng/ml以下に低下した場合、被験者にはブースター注射を受けるか、試験から離脱するかの選択肢があった。後者の場合、抗体価が0に近いレベルまで低下するまで追跡調査が行われた。周期が遅れた場合は妊娠検査が行われ、妊娠が確認された場合は、クリニックから無料で医療的中絶が提供されたが、妊娠を継続するか中絶するかの選択肢は女性に委ねられた。
結果
インタビューした162人の女性のうち、148人が3回の1次注射のスケジュールを完了した。すべての女性がhCGに対する抗体を産生したが、119人（80％）が明らかに50ng/mlを超える力価を産生した。1992年3月31日、750周期の観察が終了した時点で登録は中止され、ブースター注射は被験者からの特別な要求がない限り、施設の倫理委員会で承認された試験条件に従って差し控えられた。抗体が検出された女性の追跡調査は継続された。1993年8月1日現在、1224周期の観察が記録されている。抗体価が50ng/mlを超える女性で妊娠が1例発生した（この妊娠は被験者の希望により真空吸引により中止された）。図1に代表的な4人の女性における抗体反応の動態と防御期間を示す。試験の継続を希望する女性には、平均3ヵ月後にブースター注射を行った。8人の女性が妊娠することなく30サイクル以上を完了し、9人が24-29サイクル、18-23サイクル、15人が12-17サイクル、21人が6-11サイクルを完了し、妊娠のリスクにさらされ続けた。26例の妊娠は、力価が50ng/ml未満で、代替避妊薬（下記参照）を効果的に使用していなかった参加者の間で起こった。
抗体はhCGに対して高い親和性（K& 1010 M_1）を有し、in vitroおよびin vivoでhCGの生理活性を不活化することができた。ヒト LH に対する抗体の交差反応性は 10％から 75％であったが、ヒト卵胞刺激ホルモ ンおよびヒト甲状腺刺激ホルモンとの交差反応性は全く認められなかった。85％の月経周期は正常範囲内（22-35日）であった。抗体価が50ng/ml以上の女性と35ng/ml未満の女性では、周期が長くなったり短くなったりする頻度が同程度であった（図2）。このことは、ヒト LH との交差反応性の程度と月経期間との間に関係が認められなかった以前の研究と一致する(16)。黄体プロゲステロンは単回第3週血清検体で推定され、-80％の周期で14～44nMの範囲であった。これらのレベルは排卵を示す。
可逆性。ワクチンに対する反応は可逆的であった；抗体価はすべての症例において、ブースター注射がない場合には低下した。代替避妊薬が提供されたが、抗体価が35ng/ml未満になった時点で妊娠した女性もいた。図3は、12周期避妊した後、抗体価が5ng/ml未満で妊娠した女性の例である。他の4人の女性は、それぞれ抗体価が5、5、10、20ng/ml未満で妊娠し、正常な子供を出産した。残りの妊娠のうち、抗体価が低い時期に妊娠したもの、あるいはブースター注射をしなかったために妊娠したもののうち、12例は抗体価が20ng/ml以下、9例は21～35ng/mlであった（表1）。後期流産は観察されなかった。
考察
本研究は、循環抗hCG抗体による女性の妊娠予防の証拠を提供するものである。抗体は、ホルモンの塩基中和を確実にする決定因子に対するものでなければならない。50ng/mlを超えると有効であるが、35ng/ml未満では妊娠を予防するには不十分である。有効な抗体はhCGに対して高い活性（K& ” IO10 M_1）を持つ。これらの抗体はヒト LH と部分的に交差反応性を示すが、この反応性は排卵を損なったり黄体機能不全を引き起こしたりすることはない。非中和 LH は抗体で部分的に中和された後でも排卵を誘発するのに十分であると思われる。これはヒツジ LH の p サブユニットを免疫したアカゲザルでも観察されている(22)。月経周期は規則正しく保たれているため、LH の交差反応によって黄体の機能が十分に低下することはない。
図3. 抗体低下による妊孕性の回復。30歳の被験者（STS）は、ワクチン接種後、2回の妊娠と1回の選択的流産（P2+1）を経験し、12周期にわたって妊娠から守られていた。ブースター注射を行わなかった場合、抗体価は低下し、彼女は417日目からの周期で妊娠した。点線で示した受胎可能月の中周期における外挿抗体価は5ng/ml未満であった。
これらの観察結果は、避妊ワクチンの可能性の基礎となるものである。しかし、このワクチンを一般的な家族計画法として実用化するには、さらなる研究が必要である。一次予防接種で抗体価が防御レベルまで上昇するまでの約3ヵ月間は、適合するコンパニオン・アプローチでカバーしなければならない。
免疫応答は遺伝的要因と栄養的要因に左右される。今回のワクチンで使用した免疫原にはいくつかの決定因子があるが、ワクチンを接種したすべての患者がhCGに対して十分高い抗体反応を示すわけではない。今回の研究では、80％の女性が50ng/ml以上の抗体価を示した。免疫反応を高めるためには、より優れたアジュバントの使用など、さらなる最適化が必要かもしれない。複数回の注射を伴う現在のスケジュールは一般的な使用には実用的ではないため、注射回数を減らすためにワクチンをミクロスフェアに封入することも望ましい。このようなマイクロスフェアは、実験動物において1回の投与で長期間持続する抗体反応を起こすことが確認されている(23,24)。ワクシニアをベクターとし、/3hCGを膜貫通断片とアライメントされた形で発現させた生組換えワクチンも作られており、サルにおいて高い抗体応答が長期間持続する(25)。このカセットは、挿入された遺伝子を発現するがヒトでは複製されない家禽痘ベクターに移植されている。この方法による免疫で、抗体反応がさらに改善されるかどうかはまだわからない。
本研究は、女性が任意に選択できる避妊ワクチンの実現可能性を示している。防御のための抗体価も定義された。抗体価はブースター注射をしない限り自然に低下するため、有効な予防接種期間は女性自身によってコントロールできる。
ここで報告した研究と臨床試験は、インド政府バイオテクノロジー省の科学技術プロジェクト、カナダの国際開発研究センター、ロックフェラー財団の支援を受けた。この研究は、ニューヨークの人口評議会避妊研究国際委員会との協力的な交流の恩恵を受けている。