ピアレビューの概要

2020年12月16日 ポール・スキップバージョン1承認
2020年12月7日 ウィリアム・J・グリフィス 第1版 承認済み

要旨

‘Long Covid’、すなわちSARS-CoV-2感染後に関連する医学的合併症は、患者での報告が増加している重要なウイルス後合併症である。そのため、SARS-CoV-2感染に関連する疾患メカニズムを理解し、薬物標的を同定し、炎症過程を明らかにする必要性が高まっている。このニーズに対応するために、我々は、96種類の免疫応答関連タンパク質の標的質量分析に基づくマルチプレックスパネルを作成した。このマルチプレックスアッセイを、無症候性および中等度の感染症患者の血清サンプルのコホートに適用した。すべての患者は PCR で SARS-CoV-2 感染が陽性と判定され、その後抗体が陽性であることが判明した。ウイルス感染から 40～60 日後にも、すべての患者で炎症反応が有意に残存していることが観察された。残存していたタンパク質は、抗炎症反応とミトコンドリアストレスに関連していた。このことは、SARS-CoV-2感染が沈静化した後も、無症状で中等度の患者であっても、体内の生化学的・炎症的経路が長く変化し続けることを示唆している。

キーワード

SARS-CoV-2,質量分析、炎症、バイオマーカー、プロテオミクス

序論

SARS-CoV-2感染から回復する人が増えている中で、ウイルス感染後の疲労症状、すなわち「Long-COVID」の報告が増加していることが懸念されている。この現象は、症状が出てから数週間から数ヶ月は回復しないと定義されており、SARS-CoV-2感染後、数週間から数ヶ月間、慢性的な疲労感や再発性の疲労感を呈するとされている1, 2。「長期間のコービッド」の影響と合併症を理解し、それを管理することは、公衆衛生サービスの次の課題となっている。現在、英国ではウイルス検出と抗体検出のための検査能力が向上しているが、Long-COVIDの理解と診断にはまだギャップがある。

疾患の重症度に関連して、SARS-CoV-2感染に対する炎症反応を特徴づけるための研究が行われている。重症度が高炎症性サイトカインストームと関連しているのか、あるいは宿主の防御免疫の失敗によりウイルスの拡散や臓器損傷が抑制されないのかについては、これまで議論があった。この問題への取り組みを困難にしているのは、COVID-19感染症における免疫機能を評価するための診断ツールがないことである。サイトカインパネルのような既知の主要な炎症性タンパク質を調べるためのシンプルで高価な免疫測定パネルがあるが、これらは既知の経路に関する情報しか得られず、新規の炎症反応やあまり定義されていない炎症反応の発見には限界がある。質量分析法を使用して複数の診断用タンパク質を定量する標的型プロテオミクスは、この問題に対処するのに役立つ。ウイルス検出のための新しいアッセイは、標的型質量分析 3, 4 を使用してすでに開発されているが、「Long-COVID」の診断や理解のための症状を見るために利用できるアッセイはない。

以前の研究（未発表のレポート）から、我々は96プロと抗炎症関連タンパク質（図1a、プロトコルズ.io 5の表1を参照してほしい）までを見てカスタムターゲット質量分析ベースのアッセイパネルを開発した。私たちの仮説は、Long-COVIDの症状は、長引く「尾」と、体が以前に見たことのないタイプのウイルスによる感染症に対する異常な炎症反応に関連している可能性があるというものであった。我々はこのアッセイを、PCRでSARS-CoV-2感染が陽性と判定された医療従事者から採取したサンプルのコホートに適用した。サンプルは感染後少なくとも40～45日目に採取し、抗体検査で陽性を示した。抗体検査陰性、感染報告なし、PCR 検査陽性の医療従事者の血清と比較した。

図1　感染後の血清炎症プロファイルの多変量解析

a) マルチプレックス炎症パネルの代表的なオーバーレイドクロマトグラム。b) 感染後40日以上のSARS-Cov-2感染患者10人と陰性対照10人の主成分分析スコアプロット。

方法

倫理的な声明

サンプルは、Health Research Authorityが承認したプロジェクトCo-Stars（Great Ormond Street Hospital NHS（英国保健医療局） Trust COSTARS, IRAS 282713, ClinicalTrials.gov Identifier. NCT04380896,2020年5月8日登録）から同定し、参加者全員が書面による同意を得ている。

サンプル

このアッセイの原理を証明するために、幅広い年齢層をカバーする10の陽性サンプルと10の陰性サンプルのパイロットグループが選ばれた。陰性群は60%の女性で、年齢範囲は21～57歳、中央値は38歳でした。陽性群は女性が69%で、年齢範囲は31～66歳、年齢中央値は44歳であった。陽性者のうち、7例は無症状で、6例は味覚・嗅覚の喪失または味覚・嗅覚異常を認めた。入院や他の症状を報告した患者はいなかった。

マルチプレックス法

マルチプレックスアッセイのための詳細な方法が公開されており、 protocols.io 5.簡単に言えば、血清サンプルのタンパク質を沈殿させ、ペプチドにトリプシン消化した。ペプチドを脱塩し、逆相クロマトグラフィーで分離し、Xevo TQ-S質量分析計に結合したウォーターズアクイティUPLCシステム上で分析した。

分析

生データは、MassLynx v 4.1 を使用して、多重反応モニタリングモードで取得した。Raw ファイルは Skyline v 19 を使用して処理した。タンパク質-ペプチド配列は www.uniprot.org から取得し、カスタム合成ペプチド（Genscript USA）を使用して設定を最適化した。正規化されたピーク強度データを Microsoft Excel にエクスポートし、多変量解析に SIMCA v 15 (Umetrics, Sweden) を使用してデータを解析し、統計解析に Graphpad prism v 6 を使用した。

結果

対照およびSARS-CoV-2陽性患者で測定したすべての炎症性タンパク質の多変量解析を図1bおよび1cに示す。スコアプロットは、陽性サンプルと陰性サンプルの明確な分離を示しており、SARS-CoV-2感染者の血清免疫プロファイルは、感染後40日経過しても有意な影響を受けていることを示している。図2は、我々のパネルから有意に変化した6つのタンパク質の一変量解析を示している。これらのタンパク質の大部分は、抗炎症性またはストレス応答に関連している。2つのタンパク質はミトコンドリアに由来するもので、ペルオキシレドキシン3（PRDX3）とカルバモイルリン酸合成酵素（CPS1）である。

PRDX3は抗酸化物質として知られている。SARS-CoV-2に感染した患者の血清中のPRDX3の増加は、ミトコンドリアのストレス応答が継続していることを示していると考えられる。

CPS1は肝細胞の主要なミトコンドリア尿素サイクル酵素である。血清CPS1は胆管に由来し、通常、末梢血単核細胞によって迅速に除去される。SARS-CoV-2に感染した患者では、末梢血単核細胞の循環と活性の増加により、血清中のCPS1の基底レベルが低下している可能性がある。

図2　感染後の血清中の変化したタンパク質

Proteins significantly affected (p< 0.001) by the serum in the >40 day post SARS-Cov-2 infected healthcare workers **** p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.01.

シスタチン C はプロテアーゼ阻害剤であり、細胞外レベルは癌、心血管疾患、炎症性肺疾患における疾患予後のバイオマーカーとして使用されている11。マウスの血清シスタチンCは抗炎症性サイトカインIL-10によって制御されており、そのレベルが高くなるとシスタチンCの発現が抑制される。免疫メディエーターを調べた縦断的な研究では、感染後4週間でIL-10レベルが有意に上昇しているのはSARS-CoV-2感染の重症例のみであり、軽症例では4週間では影響を受けないことが示されている12。このことは、シスタチン C について観察した結果と一致している。

また、血清プログラニューリンのわずかな減少も観察される。プログラニューリンは免疫応答において基本的な役割を果たしており、これは神経変性疾患におけるその役割の中でよりよく定義されている13が、血清プログラヌリンの関連性は完全には理解されていない。プログラヌリンは、糖尿病における脂肪細胞14ではプロ炎症性の役割を持ち、血管内皮では炎症反応15に対する抗炎症性の保護的役割を持つようである。

結論

驚くべきことに、無症状または軽度の SARS-CoV-2 感染を受けた患者であっても、感染後 40 日後には炎症やストレス反応に関与するバイオマーカー群が有意に上昇していることが明らかになった。

軽症の患者に適用したカスタムデザインの炎症マーカーパネルを使用したこの初期データは、潜在的な薬剤ターゲットを特定し、感染後の炎症反応についての洞察を提供している。標的型プロテオミクス技術を用いたこのアプローチは、感染後の炎症反応について何が異常なのかを理解するために、より詳細に定義されたサンプルコホートへの応用の可能性を秘めている。