www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.11.24.517882v1
SARS-CoV-2 Spike Protein Induces Hemagglutination: Implications for COVID-19 Morbidities and Therapeutics and for Vaccine Adverse Effects
Celine Boschi1,David E. Scheim2*,Audrey Bancod1,Muriel Millitello1,Marion Le Bideau1,Philippe Colson1,Jacques Fantini3,Bernard La Scola1*.
1 MEPHI,Aix-Marseille Université,Institut de Recherche pour le Développement(IRD),Assistance Publique-Hôpitaux de Marseille(AP-HM),IHU Méditerranée Infection,13005 Marseille,France.
2米国公衆衛生局、現役予備役、Blacksburg,VA 24060,USA
3 INSERM UMR S 1072,Aix-Marseille Université,13015 Marseille,France
キーワード
SARS-CoV-2;COVID-19;スパイクプロテイン;赤血球凝集;シアル酸;CD147;静電荷;グリコフォリンA
概要
コロナウイルスの糖鎖生化学に関するSARS-CoV-2の実験結果は、スパイクプロテインと赤血球、他の血球、内皮細胞表面の糖鎖との結合がCOVID19の感染性と罹患性の鍵であることを示している。
これらの糖鎖付着とその潜在的な臨床的関連性をさらに深く理解するために、ヒト赤血球と混合したSARS-CoV-2のWuhan、Alpha、デルタ、オミクロン B.1.1.529系統からのスパイクプロテインを用いて、古典的赤血球凝集（赤血球凝集）アッセイが適用された。これら4系統のスパイクプロテインの中心領域の静電ポテンシャルを分子モデリングシミュレーションにより検討した。
SARS-CoV-2のスパイクプロテインの糖鎖部位に強く結合することが示されている大環状ラクトンであるイベルメクチン（IVM）を用いて、スパイクプロテインによる赤血球凝集誘導の阻害を検証した。
これらの実験の結果、まず、これら4系統のSARS-CoV-2のスパイクプロテインが赤血球凝集を誘導することが判明した。オミクロンは先の3系統の場合よりも有意に低いスパイクプロテインの閾値濃度で赤血球凝集を誘導し、その中央のスパイクプロテインの領域でより多くの電気陽性であった。
IVMはスパイクプロテインの前に赤血球に添加すると赤血球凝集をブロックし、その後に添加すると赤血球凝集を逆転させた。これらの結果は、COVID-19におけるウイルスのスパイクプロテインの糖鎖結合の役割に関する以前の知見を検証し拡張するものである。
さらに、IVMのような競合的糖鎖結合剤を用いた治療法の選択肢を示唆するとともに、スパイクプロテインを生成抗原とするCOVID-19 mRNAワクチンに関する稀な重篤な副作用（AE）の解明に役立つと思われる。
はじめに
SARS-CoV-2の感染性と罹患率の鍵は、スパイクプロテインの各モノマー上の22のN-結合型グリコシル化部位から接線方向に突出する糖鎖である。1-5これらのN-糖鎖のいくつかは末端シアル酸部位でキャップされており、ワイパーのようにスパイクプロテインを往復して抗体結合から一部保護されている1,2,6,7. SARS-CoV-2および他のいくつかのコロナウイルスでは、これらのN型糖鎖は、ウイルスが宿主細胞表面の複合糖質に最初に付着するための付属物としての役割を担っている1,8-13。これらの複合糖質は、赤血球14,15、血小板16、内皮細胞17などの宿主細胞表面に負の静電ポテンシャルを与え、さらに正電荷を持つSARS-CoV-2スパイクプロテインが、ウイルスがACE2と融合して複製する前に付着しやすくする8,18-20。例えば、血管内皮細胞では、細胞あたり28,000個のSAチップ付きCD147レセプターと175個のACE2レセプター21の間に差があることから、COVID-19患者で報告された広範囲の内皮障害における糖鎖の役割を裏付けるものとなっている22,23。
赤血球は、そのシアロ糖タンパク質被膜上に、主にグリコフォリンA（GPA）の末端残基として配列された3500万個のSA分子が、特に高密度に表面に分布している14,15。ヒト赤血球上のGPAの末端残基として最も多いのは、その主成分がNeu5Acであり、GPAの他の末端単糖は、SARS-CoV-2のスパイクN-グリカンと同じものである2,5。赤血球や他の血球は、このGPAの表面コーティングを介してウイルスと結合することにより、宿主防御の役割を果たすことができる。赤血球の凝集体は、3つの臨床試験において、COVID-19患者のほとんど26,27または3分の128の血液中に実際に見つかっている。29 In vitroでは、SARS-CoV-2スパイクプロテインと偽ウイルスは、SA誘導体を含むナノ粒子アレイに付着した30。マイクロアレイ検出技術は通常、SA31またはCD147へのスパイクプロテイン付着は、ナノサイズの多価の結合により形成されるので検出できない32。
SARS-CoV-2のこのような赤血球凝集能は、臨床的に重要な結果をもたらす。第一に、何兆もの赤血球がそれぞれ狭い肺毛細血管を1分間に1回循環しているので、たとえ小さくても、動的に凝集・解離する赤血球の塊（病原体がない場合でも形成されることがある33,34）は赤血球の酸素供給を妨げることがある。COVID-19患者では、肺毛細血管の損傷した内皮が、比較的無傷の肺胞に隣接してしばしば観察され35,36、低酸素症は、正常な呼吸力学にもかかわらず発現している22,35,37-39。COVID-19のこれらの病態は、SA末端残基と内皮細胞接着を介して、寄生虫に感染した赤血球が他の赤血球に凝集する重症マラリアと同様であり、しばしば致命的な結果をもたらす1。
COVID-19の凝集、凝固および血管閉塞に関与する血球の種類と過程は広範であるが、ウイルスによって誘発される赤血球凝集（赤血球凝集）は試験管内試験で研究しやすい中心的事象である。ここでは、細胞培養上清とSARS-CoV-2の3量体スパイクプロテインを用いて、古典的な赤血球凝集アッセイがこの研究のために使われた。実際、SARS-CoV-2スパイクプロテインをヒト全血と混合すると赤血球の凝集が起こるが40、他の2つのコロナウイルス株からのスパイクプロテインも赤血球凝集を誘導する41,42。赤血球凝集アッセイは、スパイクプロテイン上の部位に結合し、ホスト細胞への付着から保護する薬剤の赤血球凝集阻害効果についてさらに検討するために応用できる。いくつかのin silico研究1により、大環状ラクトンであるイベルメクチン（IVM）は、いくつかのグリコシル化結合部位を含むSARS-CoV-2スパイクプロテインのサブドメインに高い親和性をもって結合することがわかった43。
この研究の目的は、コロナウイルス、特にSARS-CoV-2について確立された糖鎖生物学の原則が、古典的な赤血球凝集アッセイを用いて検証できるかどうか、これらの糖鎖と競合的に結合するとされる薬剤によって赤血球凝集阻害が達成されるかどうかをテストし、武漢ウイルスとそのα、ΔおよびωB1.1.529変異株の比較血液凝集能を明らかにすることであった。SARS-CoV-2によって誘導された赤血球凝集を、ウイルス全体ではなくスパイクプロテインを用いて検査することの臨床的意義と、さらにIVMを用いて競合的糖鎖結合による赤血球凝集阻害を検査することの有用性は、以前の研究で示唆されている1。
結果
血球凝集素反応（赤血球凝集）およびIVMによる赤血球凝集の阻害と回復の試験
赤血球凝集実験では、Wuhan、Alpha、デルタの各系統について、スパイクプロテイン濃度が1.06 ng/μL以上で赤血球凝集が観察されたが、それ以下では観察されなかった。オミクロンスパイクプロテインについては、0.13 ng/µL以上の最低濃度で赤血球凝集を観察したが、それ以下では観察できなかった（図1-2、表1）。
図1 赤血球凝集が発生したウェル（1;涙滴が見えない）と赤血球凝集が発生しなかったウェル（2;涙滴が見える）のサンプル画像
【原文参照】
図2 SARS-CoV-2のWuhan、Alpha、デルタ株ではスパイクプロテイン濃度0.27,0.53,1.06,2.12 ng/µLで、オミクロンではスパイクプロテイン濃度0.07,0.13,0.27,0.53 ng/µLで誘導された赤血球凝集。赤血球とスパイクプロテインの30分後に添加した1,2、4,8μMのIVMの赤血球凝集逆転の効果を示す。IVMによる赤血球凝集の阻害についても同様の結果が得られ（写真なし）、その違いは結果セクションに記載し、表1にまとめている。
赤血球凝集阻害実験では、スパイクプロテインの30分前に1μMの濃度になるように2.5%RBC溶液に添加したIVMは、赤血球凝集を部分的に阻害し、Wuhan、Alpha、デルタウイルス系統では2.12ng/μL、オミクロンウイルス系統では0.27ng/μLのスパイクプロテイン濃度で赤血球凝集が観測された。2μMのIVMでは、Wuhan、Alpha、デルタの各系統で赤血球凝集の完全な阻害が観察された。オミクロンでは、赤血球凝集を完全にブロックするために4μMのIVMが必要である。
赤血球凝集逆転実験では、テストしたスパイクの最高濃度で赤血球凝集を逆転させるのに必要なIVMの濃度は、Wuhan/Alphaとデルタ/omicronウイルス系統でそれぞれ1μMと2μMであった。
赤血球凝集は、どのSARS-CoV-2株の細胞培養上清でも観察されなかった。
対照実験では、RBC単独では赤血球凝集を示さなかった。PBSと混合した赤血球も同様に赤血球凝集を示さなかった。IVMを50μLの2.5%RBCに8μMの濃度になるように添加しても溶血は起こらず、赤血球凝集も誘導されなかった。IVMの溶媒である2.5%DMSOと97.5%水の溶液は、赤血球凝集をブロックすることも逆転させることもなかった（図2,3）。
表1 .
【原文参照】
赤血球溶液に添加したときに赤血球凝集を誘導するのに必要な組換えスパイクプロテインの最小濃度（ng/μL）、およびこの誘導された赤血球凝集を阻害または逆転させるのに必要なIVMの濃度（μM）。これらの値を決定するためのテストは、それぞれ3連で行われた。
図3
【原文参照】
コントロール：(A)赤血球単独、(B)赤血球とPBS、(C)赤血球とPBSとIVM、(D)赤血球とPBSとDMSO。赤血球凝集は観察されない。
ウェスタンブロットと定量分析細胞培養上清中のスパイクプロテインのウェスタンブロットによる定量分析の結果を図4に示す。これは、そのスパイク濃度が凝集の誘導のための濃度閾値以下であることを示す。実際、ウイルス感染後48時間の細胞培養におけるWuhan株の上清について、N-グリコシル化スパイクプロテインの濃度は約0.7 ng/µLであり、ウェルに添加するとその半分の濃度に希釈され、上述の赤血球凝集実験において赤血球凝集の誘導が認められた組み換えスパイクの最小濃度1.06 ng/µLよりもおよそ3倍低くなっている。
図4 細胞培養上清中のスパイクプロテインのウェスタンブロット分析による定量化
【原文参照】
ライン1および2：SARS-CoV-2、Wuhan株に感染させ、それぞれ24時間および48時間に採取した細胞培養上清。3行目：非感染細胞培養上清。4,5、6行目：組換えSARS-CoV-2スパイクプロテイン、それぞれ2.25,1.25,0.56 ng/μL。
分子モデリング
赤血球の表面は、膜タンパク質やガングリオシドにアニオン性のシアル酸が多く発現しているため、電気陰性である。そこで、分子モデリングシミュレーションにより、本研究で用いたスパイクプロテインの静電表面電位を検討した。私たちは、スパイク3量体のうち、各単量体の受容体結合ドメイン（RBD）によって形成される中央部に注目した。スパイク三量体の中央部の静電ポテンシャルは、Wuhan初期系統からオミクロン変異株まで指数関数的に上昇した（図5、下段）。これは、電気陰性領域（赤で着色）の漸減と、それに伴う電気陽性領域（青の領域）の増加によって引き起こされた。この増加は、WuhanとAlphaの間では緩やかで、デルタではより大きく、オミクロンでは非常に高いレベルに達している。図5の上段で示したように、ここで検討した4つのSARS-CoV-2株間の正味正電荷の変化は、赤血球凝集の誘導に関係している。なぜなら、電気陽性は負に帯電したRBC表面間の静電反発を軽減するからだ。
図5 SARS-CoV-2スパイク3量体の静電表面電位
【原文参照】
上段。生理的条件下では、赤血球はその負電荷表面間の電気的ゼータ電位の反発により、互いに分離した状態を維持する。スパイクプロテインの陽電子表面は、このゼータ電位を中和し、赤血球同士の接触をより密接にする。下段。すべての変異株において、スパイク3量体の静電表面電位は、各単量体のRBDによって形成される中央領域でより電気陽性である。表面電位の定量的解析（AU=任意単位）では、Wuhan系統からオミクロン系統にかけて指数関数的に増加することが示された。
考察
テストした4つのSARS-CoV-2系統すべて、Wuhan、Alpha、デルタ、オミクロン BA.1について、ヒト赤血球と混合したスパイクプロテインは赤血球凝集を誘導した。この結果は、例えば3つの臨床研究においてCOVID-19患者のほとんど26,27あるいは3分の128の血液中に見られた赤血球の凝集と試験管内試験で対応するものであり、このような血球凝集がこの病気の病的状態の鍵であるという示唆を強めてくれるものである。COVID-19における赤血球凝集に関連した血管閉塞は、ヒトと同様の毛細血管径47と血球グリコシル化パターン48を持つゼブラフィッシュ胚でさらに証明された。SARS-CoV-2スパイクプロテインをゼブラフィッシュ胚の静脈に注入すると、注入後3-5分で小さな赤血球の塊の形成とそれに伴う血流速度の低下が起こった49。また、様々な生体内試験または試験管内試験の研究において、SARS-CoV-2スパイクプロテインS1は、内皮、肺、神経細胞の障害、血小板血栓形成とマイクロクロットの原因となった40,50-52。
上記の糖鎖結合に加えて、静電引力も赤血球とSARS-CoV-2スパイクプロテインの結合を促進し、観察された赤血球凝集の基礎となっている可能性がある。分子モデリングシミュレーションで示されたように、SARS-CoV-2スパイクプロテインの中央領域は正電荷を持ち、これが負に帯電した赤血球表面への引力を生み、また赤血球間の反発する静電気力を緩和していることがわかった。この結果は、SARS-CoV-2スパイクプロテインの静電ポテンシャルが正であるという過去の報告と一致している19,53。糖鎖結合が主な基礎力であるか静電引力であるかにかかわらず、ここで観察された赤血球凝集は、より一般的には、血小板や内皮細胞などの他の細胞にスパイクプロテインが付着することが、新型コロナウイルス感染症的状態に関係しているのではないかと示唆しており、これら二つの細胞は、赤血球と同様に表面に微細な糖鎖1を持ちそれに伴い表面負電荷を持っている16,17。これらの付着は、臨床的にはウイルスまたは遊離スパイクプロテインの痕跡で示される内皮細胞の損傷23,35,51や、血小板、好中球および他の血液細胞を取り込んだフィブリン硬化血栓の形成54に現れ、RBC塊が播種された可能性もある。
SARS-CoV-2 オミクロン変異株のスパイクプロテインの赤血球凝集誘導作用が、今回テストした先行株に比べてはるかに強く、赤血球凝集誘導の閾値はオミクロンの0.13 ng/μLに対してWuhan、αおよびデルタ系統の1.06 ng/μLであり、興味深い結果であった。赤血球の凝集がCOVID-19の病的状態、特に赤血球の酸素化効率の低下に関係しているという仮説の下では、呼吸困難、酸素や人工呼吸を必要とする患者の割合が、以前のウイルス系統と比較してオミクロンではすべて激減しているので、この発見は逆説的に見える55。しかし、上述のように、宿主細胞の糖鎖に対するウイルスのスパイクプロテインの結合親和性が最適レベルを超えて上昇すると、宿主細胞のシアロシド結合部位に新たに複製されたウイルスがひっかかったり、SAリッチの非感染性標的へのウイルスのひっかかりが増加し、感染性にとって逆効果になる1,23,56。オミクロンの糖鎖結合傾向は、赤血球凝集誘導活性の増加によって示されるように、感染した肺胞細胞からのオミクロンビリオンが肺胞と毛細血管基底面の接合部に侵入して内皮細胞に感染したり、血流に入る能力を制限する可能性がある。
同様に、オミクロンのスパイクプロテインの正電荷が以前の系統に比べて増加していることも、ウイルスの引っ掛かりを増加させ、血流への侵入を制限している可能性がある。さらに、オミクロンスパイクプロテインの全体的な静電ポテンシャルは先行する系統のものよりも高いが、そのN末端ドメイン（NTD）は先行する系統のものよりも低いという分子モデリングからの示唆があり、53,57,58、シアル酸結合親和性はより高い59。また、COVID-19の血栓塞栓症や神経学的合併症に関与する細胞受容体であるα7nAChRに対するオミクロンスパイクプロテインの変異した残基の結合親和性が低いことも、やはりin silico解析に基づいて、このウイルスの変異株の罹患率が低い理由であると提案されている60。
電気的に中性な分子であるIVMは、AlphaからDelta変異株のスパイクタンパク質の10個の糖鎖結合部位に強い親和性をもって結合することがシリコで発見されている43。このことは、宿主細胞の糖鎖へのスパイクタンパク質結合の競合阻害が、赤血球凝集阻害の手段かもしれないということを示唆している。4つの異なるウイルス系統に対して1〜2μMの濃度のIVMは、スパイクタンパク質と同時に添加すると赤血球凝集を阻害し、またスパイクタンパク質を先に添加したことによって誘導された赤血球凝集を逆転させた。この赤血球凝集逆転効果は、この効果を報告した3つの臨床研究のうち最新のものから図6に要約したように、重症COVID-19患者の治療前のSpO2レベル低下に対してIVM投与後24時間以内に観察された急激な上昇を説明できるかもしれない62。ここで報告されたIVMによる赤血球凝集の阻害は、同じくSARS-CoV-2スパイクタンパク質と強く結合することが示されたグリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸が、スパイクタンパク質と同時に投与された場合、ゼブラフィッシュ胚のRBCクランピング防止と類似している49,63。このゼブラフィッシュ胚の研究で観察された散在した赤血球の塊は、COVID-19患者の血液で観察されたものと同様、26-28で観察された広範囲に交錯した赤血球のマクロスケールな赤血球凝集クラスターよりずっと小さいことは注目される。従って、臨床的に重要な赤血球の塊を誘発したり、元に戻したりするためには、より低濃度のスパイクタンパク質とIVMの濃度である必要があると思われる。したがって、200-350μg/kgの標準的経口投与後約4時間で到達する約412nMのIVMの血漿中ピーク濃度は、この研究で観察された赤血球凝集反転と類似した効果を1-2μMのIVM濃度で達成できる範囲であると思われる。
SARS-CoV-2スパイクプロテインの赤血球凝集誘導活性は、オミクロンに対して特に強力であるため、心筋炎64-66のようなスパイクプロテインに関連した重篤な副作用（AE）はまれであるにもかかわらず、生成抗原としてスパイクプロテインを使用するCOVID-19 mRNAワクチンの潜在リスクについて疑問を投げかけるものである。67-69スパイクプロテインが血流に移行することにより、まれにこのような赤血球凝集関連症例が発生する可能性は、例えば、ファイザー／BioNTech、モデルナのmRNAワクチン接種後にAEを経験した被験者1,006人の調査で、そのうちの948人の血液中に有意な赤血球凝集が認められたことからも示唆されている70。このようなリスクは、若年層ほど高くなる可能性があり、ある研究では、BNT162b2 mRNA COVID-19ワクチンを2回接種した13-18歳の青年301名に、頻脈や動悸から心筋炎に至る心系のAEが29.2%発生した。71研究者は 4%の発生率の胸痛を「憂慮すべき副作用」としたが、心筋炎の事例はほとんどが軽度で一時的であった。
この研究のフォローアップとして興味のある追加実験は、赤血球凝集を誘発する濃度より低いスパイクプロテイン濃度での赤血球の初期凝集形成のチェックのための顕微鏡的検出である。また、ブロック剤としてヘパラン硫酸の代わりにIVMを用いて、上記のようなゼブラフィッシュの研究を再現することも可能である。最後に、この実験と同様に、生理的濃度のヒト血清アルブミン（HSA）を添加した赤血球を用いて赤血球凝集をテストすることもできる。もしIVMがHSAと結合するのと同じ分子領域のスパイクプロテインの糖鎖と結合するなら、IVMの93%が血液中の血清タンパク質、主にHSAと結合するので72、IVMの93%はこの効果に対して不活性となり、赤血球凝集阻害効果は著しく制限される可能性がある。一方、IVMがスパイクプロテインの糖鎖とHSAにそれぞれ異なる領域で結合するとしたら、大きな分子であるHSA（分子量66.5 kDa、対してIVMは875.1）は立体障害によりIVMの赤血球凝集抑制効果をかなり高める可能性がある。
材料と方法
赤血球のソースと調製
赤血球は、「Establishment Français du Sang「（EFS）から」non-therapeutic blood bag”(Convention N°7828)として認定された血液バッグ提供者から提供された。全血20 ml（抗凝固剤EDTA添加）を50 mlコニカルチューブに加え、pH=7.2のPBS 30 mlで満たした後、800 xgで10分間遠心分離を行った。その後、上清を捨て、新鮮なPBSに交換した。この手順を再び2回繰り返した。最後の遠心分離の後、赤血球をPBSで希釈し、最終濃度を2.5%とした。その後、赤血球は4℃で1週間ストックした。
スパイクプロテインの調製この実験には、以下の4つのSARS-CoV-2株の組換えスパイクプロテイン（BioServUK Sheffield,United Kingdom）を使用した。Wuhan、Alpha、デルタ、オミクロン BA.1（それぞれBSV-COV-PR-33、BSV-COV-PR-65、BSV-COV-PR-97、BSV-COV-OM-0.1）である。
これらのウイルスについて、ストック懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し、それぞれ4濃度のスパイクプロテインを調製した。各ウイルス株のスパイクプロテインをPBSに溶解し、Wuhan、Alpha、デルタ系統では0.27 ng/µL、0.53 ng/µL、1.06 ng/µL、2.12 ng/µL、オミクロン変種では 0.07 ng/µL,0.13 ng/µL,0.27 ng/µLおよび0.53 ng/µLという増加濃度の最終溶液をウェルに添加した。
細胞およびSARS-CoV-2株の調製Vero E6細胞（ATCC-CRL-1586）を、2 mM L-グルタミンおよび10%牛胎児血清（FBS）を含む培地（MEM,Gibco,USA）中、37℃、5%CO2インキュベーターで既知の条件73-75と同様にして培養した。Vero E6に、全ゲノム次世代シーケンシング（NGS）により、属するとジェノタイピングされた4種類のウイルス株を感染させた。Pangolin系統B.1.176（フランスで最初に流行したWuhan遺伝子型に続く最初の主要系統、以下「Wuhan」と呼ぶ）および3つの変異株に属すると全ゲノム次世代シークエンシング（NGS）により遺伝子型判定された4つのウイルス株をVero E6に感染させた。アルファ（B.1.1.7）、デルタ（B.1.617.2）、オミクロンBA.1（B.1.1.529）の3つの変異株である。培養上清をウイルス感染後24時間で採取し、0.22µMポアサイズフィルター（Merck Millipore,Carrigtwohill,Ireland）に通して細胞や破片を除去し、実験用のウイルス懸濁液を得た。
ウェスタンブロットおよび定量分析上記のように調製した武漢SARS CoV-2感染細胞、または非感染細胞および市販スパイクの上清を、還元剤としてDTT（#EU0006-B、Euromedex、フランス）を加えた2x Laemmli Sample Buffer（#1610737,Bio-Rad,Hercules,CA,USA）で溶解し、95℃で5分間加温した。タンパク質を10%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Laemmli,1970)で分離し、ニトロセルロース膜にウェスタンブロッティングした。PBS中の0.3%Tween-20を含む5%脱脂乾燥乳で1時間飽和させた後、膜を、飽和と同じ緩衝液中1：1000の希釈でSARS／SARS-CoV-2コロナウイルススパイクプロテイン（サブユニット1）ウサギポリクロナル抗体（サーモフィッシャーサイエンス、フランス）により一晩インキュベートした。この最初のインキュベーションの後、メンブレンをPBS 1X-Tweenバッファーで10分間3回洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識抗ウサギロバ抗体（#NIF 824 ECL Rabbit IgG,HRP-linked whole Ab,Sigma-Aldrich Life Science,USA）を1：1000で飽和バッファーに希釈し室温で1時間インキュベートした。この2回目のインキュベーションの後、メンブレンを、Fusion Fx化学発光イメージングシステム（Vilber Lourmat,Marne-la Vallée,France）による画像取得によるECL（Western Blotting Substrate,#W1001 Promega,Madison,WI,USA）啓示前にPBS 1X-Tween bufferで10分間3回すすいだ。各ウェルの定量は、ImageQuant解析ソフトウェア（GE Healthcare Europe）を用いてバンド強度を測定することにより算出した。分子量測定にはプロテインマーカー（New England Biolabs,#P7719S）を使用した。
IVMの調製IVMはSigma Aldrich(St Quentin Fallavier,France)から供給された。原液を2.5%のDMSOと97.5%の水で希釈した。20μLのIVMを指定されたウェルに添加し、最終濃度が1,2、4,8μMになるように指定された。
血球凝集（赤血球凝集）の試験、およびIVMによるその阻害と逆転の試験
SARS-CoV-2スパイクプロテインによって誘導される赤血球凝集、そしてIVMによる赤血球凝集の阻害と回復を調べるために、3組の実験を実施した。赤血球凝集を調べるために、96マイクロウェルプレートを使い、PBS中の2.5%赤血球50μLを、指定濃度に希釈したスパイクプロテイン62μLとともにウェルに加えた。さらに20μLのPBSを加え、IVM阻害および逆転実験に用いたのと同じ総液量とした。この混合液を室温で穏やかに攪拌しながら30分間静置した。その後、プレートを少なくとも30秒間傾けると、赤血球凝集が発生していない場合は、ウェルの底に沈降した赤血球からなる涙滴が観察された（図1）。IVMによる赤血球凝集の阻害を調べるために、50μLの赤血球を20μLのIVMと混合し、1-8μMの濃度で室温で穏やかに攪拌しながら30分間放置した。次に62μLのスパイクプロテインを指定濃度で加え、ウェルを室温で穏やかに攪拌しながらさらに30分間静置し、上記と同様に赤血球凝集を測定した。最後に、IVMによる赤血球凝集の逆転を調べるために、50μLの赤血球を62μLのスパイクプロテインと30分間混合し、上記と同様に赤血球凝集を決定した。次に20μLのIVMを指定濃度で加え、ウェルを室温で穏やかに撹拌しながらさらに30分放置し、その後プレートを少なくとも30秒傾け、上記のようにウェルの赤血球凝集を再確認した。
以下の対照実験を行った。50μlの赤血球を単独でウェルに沈殿させ、凝集がないことを確認することができる。20μLのPBSを50μLの赤血球に加え、赤血球凝集の不在を確認した。IVMによる赤血球凝集誘導の可能性は、使用した最高濃度(8μM)で2.5%RBCs 50μLに添加することでテストした。DMSOが赤血球凝集を阻害するか逆転させるかを調べるため、IVMの溶媒である2.5%DMSOと97.5%水を使い、IVMを使わずに、上にそれぞれ記述した赤血球凝集阻害と逆転の実験も行った。
次に、各ウイルス株のウイルス懸濁液を用い、市販のスパイク懸濁液と同量のウイルス上清をウェルに添加して赤血球凝集実験が行われた。
各実験は3回に分けて行った。
分子モデリングシミュレーション
このソースファイルモデルは、Swiss-PdbViewerのMUTATEツールで、示されたAlpha、デルタ、オミクロン変異株の特異的変異プロファイルを導入するために使用された(53,80)。Swiss-PdbViewerで、参照モデル（pdb: 6VSB）とのホモロジーにより、閉じたプレフュージョンコンフォメーションの3量体構造を構築した。スパイク三量体の静電表面電位は、Molegroで解析し、ImageJソフトウェアで定量化した（前述）78。
結論
SARS-CoV-2の4つの系統からのスパイクプロテインは、ヒト赤血球に赤血球凝集を誘導した。このことは、スパイクプロテインによる赤血球の凝集、および他の血液細胞や内皮細胞へのウイルスの付着が、COVID-19の病的状態の鍵であるかもしれないという他の示唆を裏付けるものである。SARS-CoV-2スパイクプロテインの複数の糖鎖部位に強く結合することが示された大環状ラクトンであるIVMは、スパイクプロテインの前に赤血球に添加すると赤血球凝集をブロックし、その後に添加すると赤血球凝集を回復させることから、この薬剤または他の糖鎖結合競合剤を用いたCOVID-19治療の選択肢を示唆するものである。オミクロンB.1.1.529変異株は、試験した3つの系統よりも有意に大きな赤血球凝集誘導活性を示したが、これは分子モデリングから得られた、そのスパイクプロテインの中央領域の静電荷が、以前の系統のものよりもかなり陽性だったことと一部関係があるかもしれない。オミクロンの赤血球凝集誘導活性の増加と罹患率の低下という矛盾は、宿主細胞表面への糖鎖結合力または静電吸引力の増加に伴う、体組織内でのウイルス移動性の制限に由来するのかもしれない。しかし、オミクロンの赤血球凝集誘導活性の高さが、従来のmRNA コロナワクチンと比較して、オミクロンブースターのまれな赤血球凝集関連AEの発生率を増加または減少させる可能性があるかどうかは不明である。
資金提供
資金提供この研究は、フランス国立研究機関（ANR）が管理する「未来への投資」プログラム、Méditerranée-Infection 10-IAHU-03によりフランス政府から支援を受けて実施した。
利益相反
著者らは利益相反を宣言していない。
重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス型