Contents
マレク・オスタシェフスキ，アレクサンダー・スクーピン，ルディ・バリング
要旨
神経疾患の理解，診断，治療の難しさは、中枢神経系が様々な生理的粒度において非常に複雑であることに起因している。脳の発達と機能に関わる個々の構成要素、それらの相互作用、ダイナミクスは、分子、細胞、または機能ネットワークとして表すことができ、疾患はネットワークの擾乱である。このようなネットワークは、相関するメカニズムを反映するように適切に調整されれば、神経疾患を研究する上で有用なツールとなり得る。ここでは、神経疾患に特異的なネットワークを構築するアプローチについて、分子レベル、細胞レベル、脳レベルという異なるスケールで疾患に関連した病態を記述することについて概説する。また、これらのスケールを統合するために必要なクロススケールネットワーク解析についても簡単に述べる。
キーワード システム医学、マルチスケールブレインネットワーク、ネットワーク再構築、分子ネットワーク、細胞ネットワーク、コネクトーム、クロススケール解析、神経変性疾患、てんかん
1. はじめに
ヒトの脳は、分子、細胞、解剖学的スケールのメカニズムが同時かつ継続的に相互作用することで、高次のプロセスが生じるという、非常に複雑な臓器である。この複雑性を適切に解析することが、脳疾患の診断と治療のあり方を考える上で重要である。システムズ・アプローチは、脳の病態生理の課題に取り組むための適切なパラダイムである。
脳生理学の異なるスケール間のダイナミクスと密接な連関は、神経系の発達においてすでにはっきりと見て取れる。重要なことは、急性および慢性疾患において観察される分子および細胞プロセスは、しばしば胚発生のメカニズムを反映し、再利用していることだ。ソニックヘッジホッグ、Wnt、FGF、BMPなどの標準的な経路とその基礎となる転写制御ネットワークは、進化の過程で高度に保存されている。ある種の遺伝子のホモログやパラログは、異なる時期に、異なる生前・生後の細胞系列で発現する[1]。例えば、胚の血管系形成に必要な遺伝子は、成体では創傷治癒時に再表現される。もちろん、これらの進化的に保存されたモジュールの成体における回路構成は大きく異なるため、胚と成体の環境でその発現が活性化されると、異なる結果が得られるかもしれない[2, 3]。しかしながら、発生生物学は、特に、発生過程が分子、細胞、解剖学的なレベルで統合的に制御されており、この制御の乱れが後期の病態に反映される可能性を考慮すると、疾患の病因に関する仮説の生成に非常に有効な情報を提供し支援する[4, 5]。
胚発生における最も早いイベントのひとつは、主体軸の決定である。原始線条が発達し、ノトコルドが形成されると、中胚葉、外胚葉、内胚葉という異なる細胞層が形成される。中胚葉、外胚葉、内胚葉の各細胞層が形成され、内胚葉のすぐ背側にある外胚葉は、神経系の前駆体である神経外胚葉の形成に誘導される。最初は平らなシートだった神経外胚葉は、折り畳まれて神経管となり、それ自体がさらに分化して、前後、背側、腹側の位置に応じて多くの異なるタイプの神経細胞になる[6]。末梢運動系と感覚系の形成を含む、脊髄と脳内の特定の神経細胞型の発達は、これらの特定の初期発達段階における誘導とプログラミングに遡ることができる[7]。
神経外胚葉の最前部と神経管は、非常に複雑な折り畳み、増殖、移動のイベントの結果として、脳へと発達する[8]。この時期には、大脳皮質のような特定の脳領域の移動と成長によって、脳の断片的な性質が隠されるようになる。新しく発生する神経細胞は、細胞の自律的な位置情報を持っており、さらに空間的な細胞内・細胞外の合図を受けて、発生中の胚の中で前後方向および背腹方向に移動・ホーミングすることができる。これらの事象は、複雑な細胞生存、アポトーシス、増殖、分化シグナルの発現と活動によって重ね合わされ、最終的に異なるタイプの神経細胞とグリア細胞の形成と、脳の最終的なコネクトームへの配線につながる[9]。神経細胞の電気的活動は、胚発生時にすでに始まっており、神経系の発達に重要な要素となっている[10]。
神経管形成と同様に、特定の分子および細胞プロセスが、神経系の特定の構成要素への分節化を支配している。その一つが、中脳と後脳の境界の形成であり、発達中の脳の顕著な分節化を反映している[11]。このプロセスを推進する重要な経路の一つがWnt 経路である。一連の階層的に組織化された転写因子（例えば、EN1、PAX2、PAX8）と分泌型モルフォゲン（WNT1、SHH、FGF8）は、正確な前後境界で非対称性を設定する[12]。この境界には「組織化センター」が形成され、例えばドーパミン神経細胞のような様々な神経細胞前駆体の分化と成長を導く。特定の神経細胞のサブタイプを追跡し、それらに特定の遺伝子発現シグネチャーを割り当てることで、神経系の配線原理の理解が大きく進んだ。
1.2 神経疾患に必要なシステムアプローチ
脳の発生は、遺伝的プログラム、分子機構、細胞間相互作用、移動、機能的な解剖学的領域の形成など、様々な生物学的複雑性が統合されたプロセスである。これらのネットワークに障害が生じると、脳に病的状態が生じることが予想される。実際、最近の知見では、脳の発達過程における分子、細胞、解剖学的機能不全が、例えば、てんかんを引き起こしていることが示唆されている[13]。興味深いことに、Wnt経路の構成要素は、後に特定の脳領域や神経細胞に関連する疾患において影響を受ける[14, 15]。これらの知見は、神経系発生の分子事象の多くについて、システムベースの計算機モデルを開発するための集中的な取り組みに拍車をかけている。
異なる層のメカニズムの統合は、脳のホメオスタシスから変性までの全生涯にわたって行われる。同様に、神経病態の全体像を把握するためには、脳疾患の空間的および時間的スケールの表現を統合することが必要である。
脳の発生、恒常性維持、機能、神経変性の過程は複雑である。分子、組織、解剖学的なレベルで精巧に構築され、機能する脳は、内在する機能や環境との相互作用によって絶えず変化している。このような複雑なシステムの障害は、分子構造から神経細胞集団の機能障害、解剖学的あるいは機能的な脳結合の変化に至るまで、その機能のさまざまな側面に影響を及す。神経疾患という難題に適切に対処するためには、脳機能に関与する主要なプロセスを理解する必要がある。この目的のために、既存の知識と実験結果を組み合わせて、脳の分子、細胞、解剖学的レベルの病的プロセスを記述するネットワークを構築している。そして、これらのネットワークの構造とダイナミクスを解明し、その背後にある病態を理解するために、常に改良された解析手法が適用されている。
しかし、このようなシステムアプローチは、神経疾患の課題に十分に答えるには十分ではない。脳のコヒーレントな機能を生み出すダイナミックなトポロジーのネットワークは、脳組織の他のスケールとの関係とともに考える必要がある。例えば、神経細胞と他の細胞の相互作用に対応する神経細胞の発火の頻度と振幅は、神経細胞を含む解剖学的位置の機能、および発火を引き起こす分子プロセスの文脈で考慮されなければならない。
以下では、神経疾患にアプローチする際に考慮すべき3つの生理学的スケール（分子、細胞、脳全体）について概説する。これらのスケールのネットワークの構成要素を特徴付ける最近のアプローチと、各スケールに特化したネットワークを構築し洗練させるアプローチについて述べる。最後に、神経疾患の複雑性をさらに理解するために、スケールを超えたネットワーク解析の必要性を強調する。
2分子間相互作用ネットワーク
2.1 構成要素
分子神経生物学のレベルで疾患に関連するメカニズムを明らかにすることは、必要であると同時に非常に困難なことだ。神経細胞やグリア細胞の生理学的な知識はまだ限られており、それは脳組織が不均一であり、アクセスが困難であることが主な理由である。事実、分子ネットワークは、神経細胞の分子生物学を縮小して表現しているに過ぎない。図1は、このような縮小されたネットワークと、それが表現する細胞との関係を示したものである。
この縮小された、しかし還元主義的でない視点こそが、疾患指向の分子ネットワークの本質である。ネットワークは、病因に関与するプロセスをモデル化しなければならないので、関連する構成要素と相互作用にのみ焦点を当てなければならない。しかし、神経疾患に関与する多くのプロセスを考慮すると、分子ネットワークのどの要素が関連しているかを特定することは、簡単なことではない[16]。
2.2 疾患に特化した分子ネットワーク
分子ネットワークの典型的な構成要素と対応する相互作用の種類を表1に示し、異なる構成要素間の潜在的な相互作用の指標を示した。ここで強調したいのは、ネットワーク表現は動的なプロセスを記述するものであり、上記の相互作用のタイプは様々な時間的・空間的解像度を持つということだ。例えば、シナプス活性の基質の軸索輸送は、神経膜を介したカルシウム輸送とは全く異なるものである。
疾患特異的な分子ネットワークの焦点は、病態の性質に依存する。この範囲は、明確に定義されたメカニズムから、一連の関与する経路を経て、多数の関与する分子に至るまで、多岐にわたる。分子ネットワークの焦点は、事実上、システムレベルの解析が答えるべき疑問と密接に関係している。ネットワークモデルの焦点が定まれば定まるほど、より正確な分子候補の質問が可能となり、高品質で計算可能な代謝モデルのレベルまで到達することができる[17]。
2.3 分子ネットワークの構築
2.3.1 同定
プリオン様疾患の場合、原因メカニズムはミスフォールディングしたプリオンタンパク質であり、神経変性を引き起こし、神経系全体に広がる[18]。プリオンの構造的性質が解明されても[19]、この単一分子機構の病態に関する知識は、治療法を提案するのに十分ではない。
ハンチントン病（HD）は、ハンチンチン蛋白質をコードする遺伝子に過剰なグルタミン酸が繰り返し現れることによって引き起こされる遺伝病である[20]。このような変異したハンチンチンは、神経細胞内に病因となる封入体を形成し、そのタンパク質分解系に負担をかけると考えられている。このような遺伝的要因は明らかにされているが、分子的な神経病理学の正確なメカニズムはいまだ解明されていない。
アルツハイマー病（AD）やパーキンソン病（PD）のような慢性神経変性疾患は、遺伝的要因と環境要因の組み合わせによって影響を受ける[21, 22]。多くの家族性遺伝子や疾患誘発毒素が、これらの疾患の経過に影響を及ぼす様々な分子経路を示唆している。しかしながら、その原因については未だ不明な点が多い。
てんかんは、遺伝的要因が明らかにされている、あるいは危険因子となる神経疾患である。ここでは、分子機構の機能不全により、中枢神経系の高次組織レベルでの病態が出現する[23, 24]。既存のアプローチは還元的であり、病態の複雑さを理解することができないため、このクラスの疾患の研究における分子ネットワークの有用性は限られているように思われる[25]。
神経病理学の分子レベルを反映するネットワークの構築は、通常、明確に定義されたいくつかのステップを経て行われる。一般的には、（a）候補分子の同定、（b）データベースへの問い合わせや手動による相互作用のキュレーションによる分子の接続、（c）ネットワークの改良と評価、である。
2.3.2分子のつながり
分子ネットワークを構築するための候補分子の同定は、多くの場合、実験的疾患モデルにおけるハイスループットなスクリーニングによって支援される。多くの場合、基礎となるデータ、すなわちネットワークを使って連想ネットワークが構築されるが、この場合、相互作用は接続された要素間の機構的なつながりを表すことはない。最終的には、これらの連想ネットワークは、疾患関連のメカニズムモデルを構築するための候補の優先順位付けをサポートする[26-28]。
プリオン病に関しては、マウスモデル[29]、細胞モデル[30]、酵母遺伝子スクリーニング[31]が分子ネットワークの構築をサポートした。同様に、HD関連の病態についても、酵母スクリーニングによりネットワーク構築の候補の優先順位付けが行われた[32]。ヒトの死後組織は、入手可能な限りオミックスプロファイリングに使用され、例えば、PD [33-35]やAD [36, 37]の病因に関わる遺伝子を特定することが可能であった。興味深いことに、ある種のてんかんの場合、分子間相互作用ネットワークの候補は、外科手術中に採取された脳組織の生検から再構成されたものである[38]。
2.3.3 絞り込みと評価
候補分子間の相互作用の確立には、分子機構に関するデータベースへの問い合わせ[39]、または手作業によるキュレーション[40]が必要である
トランスクリプトームのプロファイリングと文献に基づくネットワークの再構築は、例えばプリオン病 [29, 41]やAD [42]のように、病気の進行中に影響を受ける経路を示す方法として提案されている。また、神経疾患の遺伝的リスクファクターに着目したゲノムデータに基づくネットワーク再構築が、プリオン病[43]、てんかん[44]、PD[45]に対して提案されている。
分子ネットワークの構築には、分子間の相互作用を新規に組み立てるか、自動的に構築されたネットワークを確認するために、手作業によるキュレーションが必要な場合がある。大規模な疾患に特化したネットワークの構築は困難な作業である。AD(46)とPD(47)の分野では、異種分子間相互作用マップが作成された。また、より焦点を絞ったアプローチとして、既存の代謝経路をキュレーションして脳特異的なネットワークにしたものがある[40]。最後に、PDの分野では、さらに焦点を絞ったネットワークベースのモデルが構築され、神経細胞代謝の細胞ストレスとタンパク質のミスフォールディングに関連するプロセスが詳細に表現された[48, 49]。
解析的に同定された候補分子と相互作用に基づいて構築されたネットワークは、バイアスがかかりやすい。構築されたネットワークの評価と改良を行い、適切な焦点が当てられるようにする必要がある。確立された疾患関連ネットワークの品質は、ネットワーク構造にマッピングされた関連する実験データセットを用いて評価することができる。Fujitaらは、手動でキュレーションしたPD関連ネットワーク上の脳組織トランスクリプトミクスデータを視覚化することを提案し、その関連性を評価することができる[47]。てんかんの場合、このような評価は、例えば特定の神経受容体に焦点を当てたり[50]、薬物耐性患者の脳組織からの遺伝子発現プロファイルを使用してフィルタリングするなど、異なる疾患サブタイプにネットワークを調整するのに役立つ[51]。ヒトの脳サンプルに加え、疾患関連の実験モデルからのデータセットも同様に適用できる[52, 53]。特に、特定のパスウェイの詳細な分析に焦点を当てた実験セットアップは、このようなネットワーク評価において有用である。例えば、Wntシグナル伝達経路のメカニズムに関する最近の研究[54]では、Wnt刺激後の遺伝子発現の時系列が得られた。これらの時系列をネットワーク解析すると、Wnt経路の正準および非正準の活性化を支配する既知のメカニズムが確認され、ADに関連する分子メカニズムに光が当てられた。今回構築したネットワークは連想的なものであるが、このような遺伝子発現時系列データを精選した疾患モデル上にマッピングすることで、重要なメカニズムを反映する精度を検証することができる。
2.4 まとめ：分子ネットワーク
組織特異的な実験データセットを使用する以外に、開発された分子ネットワークの形状を改良するために、追加的な情報源を適用することができる。最近、マイクロRNAが神経疾患の潜在的な調節因子として注目されている[55-57]。このようなmRNAの制御因子は、脳に焦点を当てた遺伝子制御ネットワークを構築する際に特に重要である。同様に、DNAのメチル化、またはタンパク質のアセチル化は、神経疾患における多数の遺伝子の強力な制御因子として浮上し[58-60]、分子ネットワークの機能モジュール全体に影響を与える可能性がある。
脳疾患の分子ネットワークは、その構築に使用されるデータソースなど、非常に異質なものである。脳の分子機構は、実験モデルや死後組織、特に脳生検を用いて研究されている。このようなネットワークを構築する場合、ネットワークの広さと深さの間でトレードオフを行う必要がある。大規模なネットワークは、疾患プロセスを俯瞰することができ、限定的な分析アプローチを可能にする[47]。さらに、ADやPDのような疾患と糖尿病や自己免疫疾患の間で重複するメカニズムを解明することを目的とした、疾患間の分子比較の研究が可能になる[61- 63]。一方、小規模で集中的なネットワークは、確立された数学的枠組みを用いて、疾患に関連するプロセスを高い品質で記述することができる。このようなネットワークにおけるダイナミクスのシミュレーションにより、表現されたプロセスの因果関係と時間的解像度に関する事前予測が可能になる[48, 64]。
重要なことは、分子ネットワークを独立した構造として考えるべきでないことだ。脳細胞の細胞機構は、脳の機能領域を形成する埋め込み組織との関連で機能する。このように、プリオンの病態は分子的な基盤を持っているが、高次のネットワークという観点からも考えなければならない。プリオンとGABA受容体との相互作用や興奮毒性への影響に関する最近の知見により、細胞内ネットワークとの関連付けが可能となった[65]。この関連性は、ドーパミン神経系におけるプリオンタンパク質の調節的役割に関する知見によってさらに強化された[66]。プリオン病の症状バイオマーカーを説明するためには、分子層と脳層をつなぐことが必要かもしれない[67]。
HDの分子的基盤に関する我々の知識は、その病態を説明するには不十分である。この事実は、分子間相互作用のネットワークを超えて、システム分析の範囲を広げることを示唆している。初期HDの遺伝学と神経画像研究を関連付ける研究は、分子レベルのネットワークと脳レベルのネットワークの橋渡しをするものである[68]。
重要なことは、分子メカニズムを分析する際には、より高いレベルのネットワーク表現を考慮する必要があるということだ。PDでは、特定のニューロン集団の変性が観察され、細胞間相互作用 [69, 70]が病態に重要な役割を演じていることが示唆されている。さらに、PDの主要なメカニズムとして、シヌクレイン凝集体の脳領域全体への病的な拡散を指摘する証拠が増えている[71, 72]。より高度なネットワーク構成は、PD病態のさらなる理解につながるかもしれない。ADとPDに関する最近の研究では、PDとADで影響を受ける異なる脳領域のオミックス解析 [37, 73]、あるいは脳レベルのネットワークの機能に影響を与える遺伝的要因 [74, 75]によって、この概念に従っている。
てんかんの分子病態は、高次のネットワークの病態に大きく寄与している[76]。したがって、システム生物学の必要性は、分子ネットワークの多くの要素にまたがるだけでなく、異なるネットワーク層にもまたがる、その創発的な適切さのために急務となっている。
3 細胞間相互作用ネットワーク
3.1 構成要素
人間の脳は約10＾9個の神経細胞から成り、各神経細胞は他の神経細胞に対して平均10万個のシナプス結合を持っている[77, 78]。このような神経細胞の相互作用の多さから、発達段階ですでに確立されたネットワーク構造が明らかになる。このネットワークは、局所的に結合している細胞もあれば、脳内や体内の離れた領域に投射している細胞もあり、時空間的な特性も様々で、中には1メートル以上の長さの結合もある[79, 80]。さらに、神経細胞間の相互作用様式は多様であり、神経伝達物質とそのシナプスの対応する受容体に依存して、興奮性または抑制性のいずれかとなる。
脳の主要構造は生涯にわたって安定しているが、脳は他のすべての器官と比較して非常に大きな局所的可塑性を示し、学習と記憶を可能にしている。この可塑性は、海馬や大脳皮質などの特定の脳領域において、入力に依存したニューロンネットワークのトポロジーの再配線によって実現されている。この書き換えの主なメカニズムは、ヘブの学習則に従ってニューロン間のシナプス結合を活動依存的に変化させる長期増強と長期抑圧である[81, 82]。
重要なことは、ヒトの脳には50%以上のグリア細胞が存在し、脳細胞ネットワークの活性化に重要な役割を担っていることだ。これらの細胞のうち、アストロサイトが大部分を占め、オリゴデンドロサイトとミクログリアがそれを補完している[83]。アストロサイトは、神経細胞の活動および関連するエネルギー需要を、血流調節および対応するグルコースおよび酸素の取り込みに移行させ、神経細胞の代謝を促進する[84, 85]。オリゴデンドロサイトはミエリンシートによってニューロンの軸索を絶縁し、迅速なシグナル伝達を可能にするとともに、脆弱な構造を外部から保護する[86]。ミクログリアは、脳のマクロファージである。
病原体や損傷した細胞を感知し、特定部位に移動し、貪食によってそれらを掃除する[87]。図2は、これらの相互作用の概略を、対応するネットワーク表示とともに示したものである。
脳は、多くの空間的・時間的スケールをカバーする、広範かつ異質な細胞間相互作用を示す。最も高速な細胞間シグナリングは、ミリ秒単位の時間スケールでニューロン間に生じる[88]。これにより、軸索電位の電気インパルスがシナプスで接続された細胞へ伝達される。この高速通信と典型的なフィードバックループにより、高速な知覚、適切な反応、行動の洗練が可能となる。重要なことは、ニューロンネットワーク内のシグナル伝達は、周囲のグリアにも影響を及ぼし、グリアはニューロンコミュニケーションを調節することができるということだ。
アストロサイトは、化学的情報伝達を促進するためにシナプス間隙を塞ぎ、神経伝達物質を間隙から除去し、シナプス前末端にリサイクルする役割を担っている[90]。重要なことは、アストロサイトは多様な神経伝達物質に対する受容体を発現していることだ。例えば、グルタミン酸シナプスで放出されたグルタミン酸は、シナプス後のニューロンだけでなく、周囲のアストロサイトも活性化させる。活性化したアストロサイトは細胞質Ca2+を数秒の時間スケールで増加させ、これがATPやグルタミン酸の潜在的放出を含む下流シグナル伝達プロセスの引き金となる[91]。この放出は、血流の調節を誘発するが、局所的な増幅プロセスも誘発する[92]。その後、シグナルは細胞間Ca2+波によってアストロサイトネットワーク内に伝播し、数十個の細胞を活性化し、数百マイクロメートルに広がることができ[93]、そこで長期増強と長期抑制によってシナプス形成を含むニューロン活動を誘発または調節する可能性がある[94]。
オリゴデンドロサイトは、数分から数時間という時間スケールで起こるミエリン形成によって、神経細胞の機能を支えている[87]。さらに、最近の知見では、代謝のサポートや神経細胞機能の制御における役割も指摘されている[95, 96]。同様に、微生物は神経細胞の動態に長期的な影響を及ぼす。病原体や細胞の残骸（損傷したニューロンを含む）を脳から除去するほか、ミクログリアはシナプスの刈り込みを行う[97]。その結果、ニューロンネットワークのトポロジーが数時間のスケールで変化し、脳機能にとって不可欠となる。興味深いことに、最近アストロサイトについても同様の役割が報告された[98]。表2は、脳のダイナミクスにおける様々な細胞の種類とその役割の概要を示している。
全体として、ニューロンの巨大な接続性は、単一エンティティの非線形ダイナミクスをメゾスコピックにより秩序ある挙動に変換する高密度ネットワーク構造をもたらす。その結果、微調整された活動パターンは、視覚記憶[99]や運動制御[100]などの情報の特定の表現に対応するニューロンの局所的に同期した発火をしばしば示す。その根底にあるニューロン微小回路は、多くの制御的な細胞間相互作用に埋め込まれ、それによって調節されているため、ネットワークのトポロジーを変えることによって可塑性と適応を可能にする[89]。異なるレベルやスケールを統合するために、システムアプローチに依存する必要がある。
3.2 疾患特異的なネットワークトポロジー
疾患特異的なネットワークのトポロジーとダイナミクスを特定するための課題は、一次的な影響と二次的な影響を区別することだ。この文脈では、個々の実体を反映する単一細胞の特性が、どのように病態を引き起こす可能性のある細胞ネットワーク挙動に変換されるか、という一般的な疑問が生じる。
分子修飾とネットワークダイナミクスの障害との直接的な関連は、てんかんにおいて観察される。この場合、チャネルタンパク質のたった一つの変異が、単細胞レベルで興奮性を高め、より頻繁なスパイクを誘発することがある[101, 102]。細胞ネットワーク内のこのような修正された特性を持つノードは、メゾスコピックダイナミクスに劇的な変化を引き起こす可能性がある。単細胞の興奮性が高くなると、多くのニューロンの活動がグローバルに同期し、発作を誘発する可能性がある。同時に、影響を受けた細胞ネットワークは、同期した発火を補償することができる場合が多い。事実上、発作の発生時間と脳領域の両方を予測することは困難である[103]。興味深いことに、抗てんかん薬で発作抑制効果が得られない場合、側頭葉の一部を切除したり、発作の伝播を可能にする特定の突起を切断することが可能な治療法である[104]。
HDの場合、病因となる遺伝因子は細胞の表現型とよく相関している。その結果、神経変性は線条体に優位に起こるが、単一細胞の特徴と細胞ネットワークレベルでの病態の間の機構的な関係はまだ理解されていない。最近の報告では、神経細胞活動の増大が、対応する脳領域においてより大きなエネルギー需要を誘発し、老化を促進し、より早い細胞死をもたらすことが示唆されている[105]。
同様に、PDに関する現在の証拠は、黒質のドーパミン作動性ニューロンとそれに対応する細胞間相互作用の不均衡なエネルギー収支を指摘している[106, 107]。これらのニューロンの選択的な脆弱性は、ドーパミン合成と長い突起のホメオスタシスによる余分なエネルギー需要に由来している。エネルギーバランスの乱れは、これらのニューロンを早期の細胞死へと導く。さらに、ドーパミン合成の影響を受けた領域内のグリアとその結果としての代謝支援の割合は、他の脳領域と比較して低い[109]。ドーパミン神経変性のもう一つの要因は、ミスフォールドしたα-シヌクレインタンパク質の細胞内拡散であろう[110, 111]。組織レベルのストレスの結果、黒質のドーパミン作動性ニューロンの過剰な変性は、線条体のドーパミンのプールを枯渇させ、末梢神経系と感覚運動皮質からの信号を調整する基底核のフィードバックループに影響を及ぼす[112]。その結果、視床神経細胞が同期して発火し、定型的な振戦を誘発する。これらのニューロンの活動は、脳深部刺激（DBS）によって標的とすることができ、ニューロンの活動を非同期化し、振戦を抑制することができる[113]。
プリオン病では、細胞ネットワークの調節異常の分子的基盤が観察される。プリオン病では、ミスフォールディングの連鎖反応により、細胞内または細胞外の凝集体が形成され、最終的に神経細胞が死滅する[114]。神経細胞のネットワーク構造とそのダイナミクスが変化することで、認知症などの神経症状が引き起こされる。てんかんやPDでは、神経細胞の活動が高度に同期しているため、直接的な動的障害が観察されるが、ほとんどのプリオン病では、ネットワークトポロジーの変化がもたらす結果はあまり理解されていない[115]。神経変性に関する統一的な観点からの有望なアプローチは、いくつかの疾患にわたる多くのフェノタイプの形質と症状を関連付ける脳のエネルギー代謝である[116, 117]。
3.3 セルラーネットワークの構築
3.3.1 細胞間相互作用の同定
3.3.2 要素の接続
細胞ネットワークは、表現される相互作用が構造的・力学的に非常に複雑であり、特に神経細胞の特殊な形態と神経細胞ネットワークの並外れたシナプス結合性のために、構築するのが困難である。グリア細胞の構造は、ニューロンほど精巧ではないものの、突起や多細胞の相互作用も特徴としている。このような異質で相互接続されたモザイク状の細胞から、細胞間ネットワークのトポロジーを決定することは、神経組織学にとって自明ではない課題である。
この問題に対する最初のアプローチは、ゴルジによって提案された、クロム酸銀による低効率的な細胞膜染色であった。その結果，単一ニューロンの染色によって、ニューロンのramified morphol- ogyと大脳皮質の層状の組織が明らかになった[118]。しかし、この方法は、関心領域で細胞の一部しか標識されないため、細胞ネットワークの同定には適さない。
現在では、電子顕微鏡を使って、神経細胞の相互作用を微細な部分構造まで追跡することが行われている[119, 120]。シナプスのトポロジーが多様であるため、自動化されたセグメンテーションアプローチには限界があり、得られた大規模なデータセットを主に手動で分析する必要がある。最近のシナプス特異的色素の開発[121]により、よりハイスループットな研究及び機能制御研究[122, 123]が可能となった。これらのアプローチの一般的な限界は、個々のシナプスを識別することはできるが、それらを特定のニューロン-ニューロン間の接続に割り当てることができないことだ。ネットワーク再構築の文脈では、これは、必要なノードの関連付けをせずに、ニューロンネットワークのエッジのみが識別されることを意味する。
このように、ヒトの脳組織で細胞ネットワークを研究することは本質的に困難であるため、動物モデル研究に大きな焦点が当てられるようになった。2007年、Lichtmanと共同研究者は、トランスジェニックBrainbowマウスモデルによって、神経細胞結合の課題に取り組むブレイクスルー発明を行った。このアプローチは、異なる色の蛍光タンパク質を大量に発現させ[124]、細胞特異的な色の混合物を作り出すことに基づいており、これにより単一ニューロンの識別とその接続の特定が可能となる。事実上、ニューロンのマイクロサーキット全体を記述することが可能になった[125]。Brainbow法では、ニューロンの接続を識別することはできるが、ネットワークのダイナミクスに関する情報は得られない。
脳の細胞ネットワークでは、シナプスのシグナル伝達と可塑性に関して、ダイナミクスが極めて重要である。また、グリア間の相互作用やニューロン-グリア間のクロストークは、細胞間の直接結合を伴わない細胞外空間で起こるため、組織情報からは推測できない[126]。現在、細胞ネットワークのダイナミクス[127-129]は試験管内試験のアプローチで研究されており[130]、生体内試験でのネットワークダイナミクスの疾患特異的変調を理解するための良い足がかりとなっている[131]。遺伝学と光学を組み合わせた最近の開発により、神経細胞微小回路の制御可能な光遺伝学的実験モデル系が実現した[132, 133]。遺伝子を改変したレポーターを持つ脳に二光子顕微鏡を適用することで、脳領域のイメージングと神経活動の光制御が可能になる[134]。神経細胞の微小回路のイメージングと制御は、てんかんのような急性の神経細胞の誤作動を特徴とする疾患の研究に特に適している。その他の神経疾患では、ニューロンネットワークのダイナミクスと関連するトポロジーが慢性的に損なわれているため、細胞ネットワークの再構成には、特にニューロン-グリア相互作用の調節効果に関するより多くの入力情報が必要だ[135, 136]。しかし、細胞ネットワークにおけるこれらの相互作用を確立するためには、分子と活性の同時プロファイリングを可能にするアプローチが必要である。
3.3.3 リファインメントと評価
オリジナルのBrainbow 法は、光学的にアクセス可能な領域に限定されている。二光子顕微鏡を用いると、数 mmの範囲まで浸透させることができるため[137]、この方法はまだ典型的な哺乳類の脳の大きさを超えている。これらの限界を克服するために、電気泳動によって組織の脂質を除去し、透明な器官を実現する新しい方法が開発されている[138, 139]。脳を透明化し、特定の蛍光抗体染色を施すことで、切片を作らずに脳全体を単一細胞の分解能でイメージングすることができる。このようにして得られた脳地図は、すべての神経細胞の結合を含むだけでなく[9]，グリアの局在に関する空間情報も提供することができる。Deisserothらは、このような自閉症患者の脳をイメージングしたところ、個々の細胞内で閉ループを示す異常な神経細胞投射を発見した[138]。この発見は、修正された構造がいかに脳のダイナミクスや行動に影響を与えるかを示している。
このような大きな進歩にもかかわらず、クリアリング法はまだ固定された組織の分析に限定されており、ニューロンネットワークのダイナミクスと構造発達の複雑な相互作用をモニタリングすることはできない。この課題は、近い将来、ゼブラフィッシュの実験において解決されるかもしれない[140]。ゼブラフィッシュは透明であり、遺伝的にコードされたCa2+色素と適切な画像解析ツール[141]があれば、システム全体のデータ取得が可能になり、脳のダイナミクスの機構的理解のために計算モデル[129]で推定する必要がある。もう一つの戦略は、非侵襲的な拡散MRIとfMRI技術（小見出し4参照）を単一細胞の分解能に最適化することで、患者の微小回路ダイナミクスを明らかにし、神経学的病因のボトムアップを提供することが可能である。野心的なHuman Brain Project [142]は、これらのアプローチのための統合的なイニシアチブになる可能性がある。
構築された細胞ネットワークの評価は、利用可能な方法を用いて生体内試験で可能である。Tønnesenたちは、光遺伝学のアプローチによって、てんかんの動物モデルにおいて、光で誘発されるニューロンの過分極を達成した。特定のニューロン集団の過分極は、ニューロンバーストを抑制することが判明し、てんかん治療の新しいターゲットを示した[143]。ヒトの脳では、脳磁図（MEG）という手法により、特定の脳領域における神経細胞集団の振動活動を測定することができる[144]。MEGは単一細胞の分解能には欠けるが、疾患特異的な周波数パターンを追跡することができ、その結果、細胞ネットワーク解析の分析結果を検証することができる。
3.4 まとめ：細胞ネットワーク
細胞ネットワークレベルは、分子的な病因とその結果として生じる脳の神経学的な表現型の間の橋渡しをするものである。細胞間相互作用の多様性とその豊かな時空間スペクトル（表2参照）により、このレベルはモデル化が非常に複雑である。同時に、細胞ネットワーク解析は、治療介入の有望な候補を示すかもしれない。病原性細胞の特性は、主要な分子経路を標的とする薬剤によって変化し、あるいはDBSのような組織レベルの介入によって修正されるかもしれないからである。
このような細胞間相互作用を機構的に理解するための大きな課題は、神経細胞ネットワークの高い結合性と多くの時空間スケールをカバーするダイナミクスにある。この複雑さゆえに、実験的な手法では一部の現象にしか焦点を当てることができず、根本的なシグナル伝達メカニズムを理解し、新しい治療戦略を開発するためには、統合的なシステムアプローチが必要である。
4 脳レベルネットワーク
4.1 構成要素
ネットワーク表現は、脳レベルの活動を記述するのに非常に適している。解剖学的、機能的に異なる脳領域の結合は、比較的低いコストで高度な認知機能を提供するために最適化された効率的なネットワーク構造を示唆している[145]。このネットワークの崩壊は、脳の病的状態に関連している。一方、代償メカニズムによって脳の配線が変化することもある[146]。他のレベルのネットワーク表現と同様に、我々は、脳の極めて複雑な構造を、一連の要素と相互作用に単純化することに直面している。図3はこの状況を示している。
このようなネットワークの構成要素の数はかなり限られているが、これは現在のニューロイメージングアプローチの範囲が狭いことが主な原因である。一般に、脳の機能領域は、酸素消費量の測定（fMRI-BOLD）や放射性トレーサーの分布の測定（PETやSPECT）により測定することが可能である。また、非対称な神経細胞における拡散速度を測定することで、構造的な測定が可能だ（DTI-MRI、またはdMRI）。最後に、脳のトポロジーに関する知識は、特定の脳領域とそれに関連する神経伝達物質シグナルのマッピングを提供する。脳レベルのネットワークの構築は、脳領域の適切なラベリングに大きく依存することを強調する必要がある。脳領域のラベリングは難しい作業であり、得られたネットワークの特性に大きな影響を与える可能性がある[147]。表3は、脳内ネットワークの構成要素と相互作用をまとめたものである。
疾患志向の脳レベルネットワークアプローチの目的は、主に神経画像研究からの実験的な読み出しを合成して、特定の病因によって引き起こされる脳の機能と構造の変化の首尾一貫した画像にすることである[148]。脳のネットワークは、ニューロイメージングの読み出しから直接、あるいは確立された脳のトポロジーから推測されるため、通常、分子や細胞のネットワークよりも均質である。さらに、神経画像の枠組みはすべての神経疾患で類似しており、ネットワーク構築の努力は、特定の病原体に関連する脳領域を特定することを目的としている。このため、分子ネットワークとは異なり、異なる疾患に特異的なメカニズムは、構築されるネットワークの焦点に影響を与えない。
4.3.2 評価とリファインメント
疾患関連脳内ネットワークの構築には、機能的 MRI（磁気共鳴画像法）が最も広く用いられており、安静時や様々なタスク実行時の脳のBOLD（血液酸素レベル依存）コントラスト信号を記録する。fMRI信号の解析により、活性化された候補領域を特定することができるが、これは自明な課題ではなく、しばしば高度なデータ探索技術を必要とする[149]。同定された活性化領域は脳レベルネットワークの要素となり、相互作用はそれらの共活性化の相関に基づいて確立される[150, 151]。fMRIに基づくアプローチは、神経学的研究の分野では数多く存在する。このレビューの文脈では、病気の全体像を得るために、システム・アプローチに従った研究を強調することが重要である。Baggioらは、PD、軽度認知障害、健常者の安静時fMRIデータを解析し、PDの認知障害に関連するグローバルな脳内ネットワークを再構築した[152]。また、Toussaintらによるてんかんの脳内ネットワークの構築も興味深いfMRI研究の一例だ[153]。これは、てんかん放電に伴う脳機能ネットワークの崩壊を明らかにすることを目的としている。てんかんに対するネットワークアプローチについては、[154]に総説がある。
脳内ネットワークを特定し、結びつけるためのもう一つのアプローチは、放射性標識トレーサーを用いたニューロイメージングである。この方法は、選択された放射性トレーサーが関与する脳内の特定の代謝過程を明らかにするものである。代謝過程には、グルコース代謝のような一般的なものと、シナプス小胞の循環のような疾患特異的なものがある。いわゆる脳の代謝ネットワークは、fMRI由来のネットワークと同様の方法、すなわち異なる脳領域間の放射性トレーサー発現の時間的相関を分析することによって取得される[155]。このような代謝ネットワークは、最近、PD[156]およびAD[157]を対象として構築された。
構造的脳ネットワークは、白質繊維路による脳領域間の物理的結合を表している。これらの結合は、いわゆる拡散MRI（dMRI）の測定値に基づいて、トラクトグラフィーのアプローチで計算される。疾病に関連した変化は、病原性であれ代償性であれ、これらの構造的結合のトポロジーに反映されるかもしれない[158]。興味深いことに、これらの構造的ネットワークは、PD [159]やてんかん[160]の治療に対する脳の反応を反映することが最近示された。
最後に、神経画像に基づく脳ネットワーク以外に、脳の解剖学と機能に関する先行知識を用いて、確立された脳回路の疾患特異的な調節異常のネットワークを構築することができる。その一つがデフォルトモードネットワークと呼ばれる、特定の認知タスクを行っていない時に活性化される脳回路である。このネットワークは、例えば、AD [153, 161, 162]やPD [152]で歪んでいることが見いだされた。疾患関連回路として非常によく調べられているものに、PDの基底核機能障害モデルがある[163, 164]。皮質基底核-皮質ループの構造 [165]は、実際には再構成されたネットワークであり、異なるニューロンサブタイプの基底核および皮質領域への投射が相互作用している[166]。ここで、これらのマッピングされた回路の障害は、脳波と呼ばれる脳の局所領域の神経細胞活動を記録する技術を使用して評価することができる。脳波は、てんかん発作時の脳活動を測定する際に良好な時間分解能を得ることができ[167]、またPDで示されたように、疾患に関連した脳回路の崩壊を縦断的に追跡することができる[168]。
脳レベルのネットワークは、ニューロイメージングに基づくものであれ、先行知識に基づくものであれ、その関連性を評価し、改良する必要がある。この目標に到達するための一つの可能なアプローチは、利用可能な臨床データとの相関である。Moralesら[169]の研究では、パーキンソン病患者の認知評価をfMRIデータの記録と同時に行い、異なる認知障害を持つ患者の重複しないサブグループを構築した。これによって、神経画像データの解釈を改善することができた。臨床評価と同様に、薬物療法に関連する情報も、得られたネットワークの質を向上させることができる。最近の研究では、Coleと共同研究者は、明確に定義された多くの脳回路間の接続性が、ドーパミン療法に影響されることを示した[170]。最後に、縦断的な神経画像は、脳のネットワーキングの質を洗練し、向上させるために大いに役立つ。このアプローチは、被験者のサブグループを層別化し、疾患の進化をよりよく理解するために、Seibylらによって検討された[171]。
ある種の神経疾患は、重大な遺伝的負担を伴う。この情報は、構築されたネットワークをより良く調整するために使用することもできる。Raoたちは、ハンチンチン配列のグルタミン酸の数を考慮して、HD患者に対してfMRIを実施した。この層別化とHDに関連する脳回路のリストとにより、彼らは予測される病気の重症度に特異的なネットワークを特定することができた[172]。遺伝子の層別化は、PDの認知タスクのfMRI測定と結合された[173]。Nombellaとcowork-ersはこの研究で、PDに関連する3つの対立遺伝子がPDの認知システムに影響を与えることを示したが、直接的なネットワーク構築の試みは行われなかった。
4.4 まとめ
疾患特異的な脳レベルネットワークは、その構成に関して非常に均質である。その共通項は脳の解剖学的構造と機能である。その構築は、通常、ニューロイメージングデータの補完に大きく依存し、最も重要な要因は、被験者の選択とニューロイメージングアプローチである。dMRIは固定的なトポロジーを持つネットワークの構築をサポートするが、fMRIと代謝画像は動的なネットワークを構築することができる。重要なことは、後者の手法で得られたネットワークは相関に基づくものであり、時間的な関連性のパターンを表していることだ。そのため、その解釈には注意が必要であり、マッピングされた関連する脳回路に関する事前情報を考慮する必要がある。
脳内ネットワークは、神経疾患の病態を最も高次に表現している。このように総合的に判断することで、ネットワークの障害と臨床的なエンドフェノタイプを納得のいく形で関連付けることができる。同時に、細胞レベル、分子レベルで病態からの障害の出現を評価することは困難である。代謝イメージング[156]と神経画像被験者の遺伝子層別化[173]の改善により、分子レベルと脳レベルのネットワークの相関が明らかになるはずである。
5 合成
5.1 クロススケールネットワーク解析
脳は非常に複雑な構造をしており、この複雑さは器官全体、細胞、分子組織のレベルで観察することができる。図4に示すような入れ子構造のネットワークは、神経疾患の病態解明を困難にしている。しかしながら、これらの各レベルにシステムアプローチを適用することにより、これらの疾患の本質をよりよく理解することができるようになる。
脳組織のレベルにかかわらず、システム解析を目的としたネットワークの構築は、その範囲と深さのトレードオフの関係にある。オミックススクリーン（分子）[41]、微小電極アレイ（細胞）[130]、MRIデータ（脳レベル）[174, 175]に基づいて構築された広範なネットワークは、通常、広範な範囲を持つが深さは限定的である。ネットワークやシステムレベルの解析は、疾患に関連した脳機能障害[33]、微小回路[138]、経路[176]などの一般的で大規模な洞察を提供するものである。一方、十分に配慮して構築されたフォーカスネットワークは、分析されたシステムのダイナミクスに関する詳細な分析と結論を提供する。これらのネットワークは、既知の分子間相互作用（分子）[49]、細胞集団の既知またはモニタリングされた活性（細胞）[177]、あるいは十分にマッピングされた脳回路（脳全体）[178]に基づいて、手動でキュレーションすることが必要である。現状では、サイズとスコープのトレードオフは避けられない。しかし、質の高いネットワーク構築への取り組みがコミュニティ規模で注目され[47, 179]、ネットワーク構築のための新しい高コンテンツのスクリーニングアプローチが提案されるにつれ[180]、疾患特異的ネットワークはその質を犠牲にすることなく規模を拡大していくと予想される。
ネスティッドネットワークの構築に関しては、分子、細胞、脳全体など、ある複雑なレベルのシステムの挙動を詳細に分析するだけでなく、システム分析でスケールを横断することも重要である。このようなクロススケール解析を実現するための実験的アプローチが精力的に研究されている。例えば、新しいイメージング技術[181, 182]は、細胞異常の分子基盤を深く洞察し、細胞スケールと脳スケールの橋渡しをすることを可能にする[139]。
残る課題は、入れ子になったネットワークのレベルで意味のある結論を導き出し、最終的に病気の理解を深めるための適切な分析アプローチである。現在、細胞レベルのネットワークと脳レベルのネットワークをつなぐ計算機的アプローチが数多く提案されており、特定の脳領域の神経活動をモデル化して、脳全体のネットワークダイナミクスを洞察することに焦点が当てられている。これらのアプローチの粒度は、単一ニューロンのスパイク動作のシミュレーション[183]やHodgkin-Huxley方程式に基づくニューロン集団[184]から、強化学習モデルを用いた特定の脳回路による神経伝達物質の放出解析[185]まで様々である。
分子スケールと高次スケールを統合する枠組みはまだ提案されていないが、被験者の分子プロファイルに関連する脳ネットワークの再構築には、この方向への取り組みが見られる[172, 173]。
6 展望
脳を含む発生過程の現在の理解は、精巧な細胞および分子の相互作用から器官レベルの構造と機能が出現することを包含している。我々は、これらのプロセスの時間的・空間的ダイナミクスの重要性を認識し、その擾乱を病原性の状態に結びつけている。同様に、成人の脳の疾患と関連する病理学的プロセスを分析する場合、分子、細胞、器官レベルの機能障害を同時に考慮する必要がある。発育過程と神経変性に影響を受ける特定の神経細胞集団の状態との密接な連関に関する新たな証拠 [186, 187]は、この観点を強化するものである。
神経学におけるシステムバイオメディシンは、人間の脳とその障害の複雑な性質を理解し、正確な診断、効率的な治療の提案、そして最終的には病因の予防を可能にすることが期待される。そのためには、脳を分子、細胞、脳の3つのレベルで構成されるネットワークの集合体として捉えることが重要だ。これらのネットワークは、ある疾患がネットワークレベルの機能障害であることを前提に、様々な数学的・計算論的アプローチの基となる。このような多層ネットワークの構築には、データの統合だけでなく、専門知識が必要である。アレン・ブレイン・アトラス[188]やパーキンソン病マップ[47]のようなコミュニティ主導のアプローチは、分子層をはるかに超えて、この課題に取り組むために必要である。
プリオン病やHDのように分子的な要素が顕著な疾患は、主に分子ネットワークの詳細な分析が有効である。これらの疾患を薬理学的に治療するためには、標的とするメカニズムを正確に特定することが必要である。同様に、PDやADのような慢性神経変性疾患の分野では、対症療法しかできない。ドラッグデザイン[189]や遺伝子治療アプローチ[190]の一貫した失敗は、これらの疾患の原因因子を特定するための洞察に満ちた方法論の必要性を明らかにしており、それはおそらく分子レベルで追求されるべきものであろう。重要なことは、細胞レベルあるいは脳レベルのネットワークを同時あるいは統合的に解析することで、分子的な病因と薬物治療の両方が高次の脳ネットワークにどのように影響するかを解釈することができるかもしれない[191]。
てんかんのような疾患は、主に細胞や脳のネットワーク解析から得られる知見が有効であろう。ここでは、慢性疾患よりもはるかに短い時間で病態が出現する。神経細胞発火の歪んだパターンは、異なるてんかんのサブタイプに層別され、治療に対する反応を分析する必要がある[192]。最近のマルチスケール（193, 194）、マルチモーダル(195)神経画像の進歩は、統合的なネットワーク解析のニーズを満たすものである。細胞および脳のネットワーク分析による治療結果の評価は、PD [196]だけでなくてんかん[197]の分野でもDBSの適用が増加していることから、特に重要な意味を持つ。現在、DBSの電極は単一部位で、オープンループでペースメーカー刺激を与えている。しかし、刺激部位のニューロンの発火周波数を読み取ることができるため、フィードバックシステムを設計したり、多部位刺激を検討したりすることができる[198]。いずれの場合も、治療法を適切に設計するためには、細胞および脳のネットワークのシステム分析が不可欠である。
最後に、分子、細胞、脳の複雑なレイヤーを統合したネットワーク解析は、高度な治療や予防のアプローチに有効である。その一つが、幹細胞を用いた再生医療である[199, 200]。幹細胞移植の主な課題は、幹細胞をどこに配置するかという問題である。そのためには、細胞の分子機能、標的組織におけるその役割、そして移植された領域が脳全体のネットワーク構造と機能に与える影響に関する情報を統合する洞察が必要である。