Unnaturalness in the evolution process of the SARS-CoV-2 variants and the possibility of deliberate natural selection
著者 田中淳1,2,*, 宮沢孝幸2,3,*（敬称略）
概要
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、過去3年間にパンデミックを繰り返し、アルファ型からオミクロン型まで様々な変異型が発生している。本研究では、SARS-CoV-2分離株のうち、スパイクタンパク質に多くのアミノ酸変異を持つオミクロン変異株に注目し、SARS-CoV-2オミクロン変異株の形成に至る進化過程を明らかにすることを目的とした。
SARS-CoV-2オミクロン変異株の形成に至る変異の順序を明らかにするため、オミクロンBA.1関連129株、BA.1.1関連141株、BA.2関連122株の塩基配列を比較し、SARS-CoV-2オミクロン変異株の形成に至る変異の順序や相同組換えの発生など、SARS-CoV-2オミクロン変異株の進化過程の解明に努めた。
その結果、オミクロン株BA.1、BA.1.1、BA.2の一部が形成されたのは、変異の蓄積や相同組換えといった自然界で一般的に観察されるようなゲノム進化の産物ではないと結論した。
さらに、オミクロン変異株BA.1およびBA.2の35の組換え分離株の研究から、オミクロン変異株が2020年にすでに存在していたことが確認された。ここで示した解析は、オミクロン変異株がこれまでの生物学では説明できない全く新しいメカニズムで形成されていることであり、SARS-CoV-2変異株がどのように形成されたかを知ることは、SARS-CoV-2パンデミックの再考を促すものである。
はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス病2019であるCOVID-19は、2019年12月に中国の武漢で初めて報告された(1)。この新興感染症はかつてない速さで世界中に拡散し、世界保健機関（WHO）は2020年3月11日にCOVID-19の世界的大流行を宣言するに至った（https://www.who.int/）。SARS-CoV-2はベータコロナウイルスサブグループBに属し、10個の遺伝子をコードする一本鎖のポジティブセンスRNAゲノムを持ち、NCBI Reference Sequenceのアノテーションによれば、最終的に26個のタンパク質を産生する： NC_045512.2である。ゲノムサイズは29.8kbから29.9kbである。スパイク(S)、エンベロープ(E)、膜(M)、ヌクレオカプシド(N)の4つの構造タンパク質からなる(2, 3)。構造タンパク質のうち、表面糖タンパク質であるSタンパク質は、S1とS2の2つのサブユニットからなる約180kDaの最大のタンパク質である。膜融合を仲介し、最終的にウイルスの侵入を促進する。S1サブユニットの受容体結合ドメイン（RBD）（アミノ酸残基319-541）は、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）と相互作用し、そのペプチダーゼドメインに結合する(4, 5)。
過去3年間（2019年〜2022年）、SARS-CoV-2は、様々な地域で数カ月かけて出現した新型が世界中に移動し、その後パンデミックを繰り返し誘発することで再加速した。
最初のパンデミックの初期段階において、SARS-CoV-2の最もインパクトのある変異は、Sタンパク質の非同義変異D614Gであった。この変異は武漢の流行を引き起こした祖先の系統には存在しなかったが、世界中で急速に優勢となった(6)。その後まもなく、懸念される変異型、B.1.1.7：20I（アルファ、V1）、系統B.1.1.7（クレード501.YV1）またはアルファは、Sタンパク質に10個のアミノ酸の違いを含む17個のユニークな変異を特徴とし、2020年9月下旬にイギリス南東部で初めて検出され（7）、イギリス全土に急速に拡大し、2021年初めには優勢となり、同様の成功を収めてほとんどのヨーロッパ諸国に広がった。2021年11月までに、この系統の地域感染が175カ国で報告された(8)。その直後、2020年10月にSARS- CoV-2 Alphaの変異株B.1.351 : 20H（Beta、V2）の出現が確認され、8月初旬に採取された検体から南アフリカの東ケープ州で初めて検出された。このベータ型は南アフリカ国内で拡散し、同地で流通していた他のSARS-CoV-2系統を駆逐したようであった(9)。その後、2020年12月にブラジルで進化したと思われるP.1: 20J（Gamma, V3）が確認された。日本の保健当局は2021年1月10日、東京の羽田空港で4人のブラジル人旅行者からガンマ変異株を発見し、初めて公に報告した(10)。
ほぼ同時期に、2021年2月にインドで初めて検出されたデルタ変異株（パンゴ系統名B.1.617.2）と、2021年1月にコロンビアで初めて検出されたB.1.621系統としても知られるミュー変異株が報告された(11, 12)。
ほぼ1年後、懸念されるこれらの変異株、Omicron（命名された世界的流行（Pango）系統の系統学的割り当て：B.1.1.529；BA.1、 Nextstrain clade 21K）は、2021年11月24日に南アフリカのゲノムサーベイランスのためのネットワークからWHOに初めて報告されたSARS-CoV-2の変異株である(13, 14)が、最初に報告されたWuhan-Hu-H1株(NCBI Reference Sequence: NC_045512.2.)と比較すると、50個以上のアミノ酸が変化しており、そのうち39個のアミノ酸の違いがSタンパク質で観察された。この変異型はボツワナで最初に検出され、現在では世界的に循環している優勢な変異型となっている(15)。
米国では、サンフランシスコ公衆衛生局が、2021年11月22日に南アフリカから帰国した旅行者から移行したオミクロン亜型BA.1が原因であったCOVID-19の症例をカリフォルニア州で確認した(https://www.cdc.gov/media/releases/2021/s1201Omicron-variant.html)。その後、最初のオミクロン亜型BA.1が急速に拡大し、デルタ亜型に取って代わった(16)。
その直後（2週間も経っていない）、2021年12月5日にデンマークで、武漢-胡-H1と比較した場合、Sタンパク質に31個のアミノ酸の変化がある新しいオミクロン変異株BA.2系統が初めて同定された(17)。2022年2月22日、WHOはオミクロン亜型BA.2（https://www.who.int/news/item/22-02-2022-statement-on-Omicron-sublineageba.2）について、懸念されるオミクロン亜型は現在、デルタ亜型（パンゴ系統の呼称B.1.617.2）に代わって世界的に流通している優勢な亜型であると言及した（https://www.who.int/docs/defaultsource/coronaviruse/2022-01-07-global-technical-brief-and-priority-action-on-Omicron–corr2.pdf?sfvrsn=918b09d_20 ）、GISAIDに報告された配列のほぼすべてを占めている。その後、2023年3月16日現在、WHOは2022年2月以降に公開されたウイルス配列の98％以上がオミクロン変異株であると述べている（https://www.who.int/news/item/16-03-2023-statement-on-the-update-of-who-s-workingdefinitions-and-tracking-system-for-SARS-CoV-2-variants-of-concern-and-variants-of-interest）。
オミクロン変異株BA.1とBA.2は、それぞれ2021年10月から12月頃に拡大・分岐したことが示唆されている。これらの変異株は2021年2月から3月頃に共通の祖先から分岐したと推定されている(18)。オミクロン変異株BA.1とBA.2はSタンパク質に14アミノ酸の変異がある点で共通していることから、オミクロン変異株BA.1とBA.2の共通祖先は2021年2月から3月頃にすでにSタンパク質領域に14アミノ酸の変異を獲得していた可能性があるが、国際的なデータベースからは共通の祖先株は見つかっておらず、両株は異なる経路で変異を獲得した可能性がある。
本研究では、Sタンパク質のアミノ酸変異の導入順位を調べることで、Sタンパク質のアミノ酸変異が他の変異株よりも2倍多いオミクロン変異株の進化過程の解明を試みた。
結果
各バリアントは、Sタンパク質のD614G変異を持つ分離株から独立した進化経路を経て生じたと考えられる。これらの変異株におけるSタンパク質の遺伝子変異では、ほとんどの変異が非同義変異であった（図1）。Alpha、Beta、Gamma、Delta、Mu変異株には同義変異はなかったが、Lambda変異株とOmicron変異株にはそれぞれ1つだけあった。これらの変異株の中で、Sタンパク質に最も変異が蓄積しているのはオミクロン変異株（BA.1系統）で、Sタンパク質では主に非同義変異であり、同義変異はc25000uに1つしかない。ヒトのコロナウイルスがどのように変異してきたかを考えると、同義／非同義の比率は異常である（補足図1参照）。
当初、S蛋白のアミノ酸配列がOmicron-BA.1型の変異サブセットを含むSARS-CoV-2の分離株の存在を推定したが、1カ所の変異位置は変異しておらず、元のWuhan型のアミノ酸配列で構成されていた。これらの分離株をBA.1-01と命名した。Sタンパク質領域の各アミノ酸配列は、方法の項に記載したように、BA.1-0.1_S：Omicron-BA.1型のアミノ酸（Oaa）とWuhan型のアミノ酸（Waa）とその位置番号（XXX）と命名した（例、BA.1-0.1_S:OaaXXWaa）。そして、BA.1-0.1_S:OaaXXXWaaを有する推定分離株を、そのアミノ酸配列によりBLASTプログラムを用いて検索した。その結果、SARS-CoV-2_human_USA_NY-PV55373_2022(GenBank: ON246090.1)の同一性が99.92%であった以外は、クエリーアミノ酸配列と100%一致する分離株が得られた。
驚くべきことに、オミクロンBA.1-0.1分離株はN501Yを除くすべての変異部位で検出された（図2A）。オミクロンバリアントのBA.1系統には、Mu(m)バリアント（B.1.621と呼ばれる）で見られるR346K変異を持つオミクロン分離株（BA.1.1）が存在する、すなわちBA.1_SはBA.1.1_S:K346Rと定義できる。BA.1-0.1.1_S:OaaXXXWaaのアミノ酸配列を持つ分離株についても、「方法」のセクションに記載したようにBLAST検索を行った。その結果、オミクロンBA.1.1-サブセット-0.1分離株は、S373Pを除くすべての変異部位で検出された（図2B）。オミクロン変異株のBA.1系統と同様に、オミクロン変異株のBA.2系統においても、BA.2-0.1の分離株はSタンパク質のT478KとP681Hを除くすべての変異部位で検出された（補足図2）。これらの分離株の存在は、突然変異の蓄積による連続的な進化過程を通じてオミクロン株が確立されたことを否定するものである。そのため、オミクロン変異株を形成する上で、どの変異が最初あるいは最後に起こったのかを決定することはできなかった。図2Bに示すように、BA.1.1-0.1分離株の半数以上は、Sタンパク質に同義変異c21595uが検出されている。しかし、これはc21595u変異がどのような順序で生じたかを説明するものではない。不思議なことに、BA.1株分離株では、このc21595u変異はSARS-CoV-2_human_USA_ID-CDC-LC0481844_2022（GenBank: OM409228.1）とSARS-CoV2_human_USA_MI-CDC- ASC210597972_2022（GenBank: OM396816.1）のみに検出された。これらの分離株は共通してG339D変異を欠いている。この同義変異は変異が起こりやすいホットスポットの位置にある。それにしても、同じ変異が異なる分離株で独立に起こったとすれば、c21595uの出現割合がオミクロン変異株BA.1.1-0.1で著しく偏っているのは非常に不自然である。
様々なSARS-CoV-2変異株が樹立される過程で、1つの細胞に2つの異なる変異株が感染し、ウイルスRNA合成過程で相同組換えが起こり、複数の変異株が生じたことが報告されている。図2に示した分離株の原因が相同組換えであると仮定すると、相同組換えによって鎖の変化が起こるブレークポイントのいくつかは短すぎる（1nt、2nt、3ntなど）（図3および補足図3）。したがって、相同組換えをこれらの分離株を確定する根拠とするのは不合理である。また、これらの分離株のほとんどは2021年から2022年にかけて米国で発見されたものである。しかし、2021年8月に米国で大流行していた変異型がDelta変異型であったことを考えると、すでに流行しているT478KやD614Gのような変異を引き起こさなかった可能性は最も低い。もはや流行していない最も古い変異型（T478KやD614Gなど）が、過剰感染を引き起こし、相同組換えに関与するほど存在していたとは考えられない。また、これらの分離株のほとんどは2021年から2022年にかけて米国で分離されたものである。それでも、2021年8月に米国で主に流行していた分離株はDelta変異株であったことを考えると、T478KやD614G変異を持たない古いタイプの変異株が超感染を引き起こし、相同組換えに関与するほど存在していたとは考えにくい。この仮定は、これらのBA.1-0.1株およびBA.1.1-0.1株はすべて、Sタンパク質を除くすべての領域でBA.1系統の配列を保持しているという事実からも支持される（図4）。また、これらのBA.1-0.1株およびBA.1.1-0.1株は、Sタンパク質を除いてすべてオミクロン株BA.1の塩基配列を保持していることから、これらの分離株がT478K変異やD614G変異を持たない古いタイプの変異株との相同組換えによって生じたと考えるのは不合理である（図4）。
さらに、BA.1分離株とBA.1-0.1分離株の中には、S遺伝子の上流と下流に変異サブセット（同義：u10135c、ORF3：L106F、N：D343G）を持つものがあり、u10135cとL106F（ORF3）の変異は完全に対応している。したがって、BA.1変異株とこれらの変異のない変異株との間の相同組換えは、変異株の形成過程では起こらなかったと考えられる（図4）。BA.1.1ではBA.1.1と比較して同義変異c2470uが起こっており、このc2470u変異はBA.1.1-0.1分離株（SARS-CoV-2_human_USA_IL-CDCASC210695497_2022：GenBank： OM770362.1; SARS-CoV-2_human_USA_NY-CDC-LC0450936_2021:
GenBank：OM228453.1）： OM228453.1）。同義変異c2470uもまた、ごく少数のBA.1-0.1分離株（SARS-CoV-2_human_USA_OR-CDC-LC0470830_2022: GenBank： OM367679.1; SARS-CoV-2_human_USA_ID-CDC-LC0481844_2022: GenBank: OM409228.1; SARSCoV-2_human_USA_MI-CDC-ASC210597972_2022: GenBank:OM396816.1; SARS-CoV2_human_USA_WI-CDC-LC0494047_2022: GenBank: OM500517.1）。これらの結果は、BA.1-0.1分離株とBA.1.1-0.1分離株は独立して成立していることを示唆している。一方、これらの分離株のアミノ酸が1つずつ武漢型に復帰変異していれば、天文学的な数の分離株を調べることによって、これらの分離株を検出することができる。しかし、これらのウイルス株は、天文学的な数の検査で検出されたのではなく、配列決定された全ゲノムの数（限られた数）で検出されたのである。これらの変異のほとんどが同義変異を伴わずに起こったという事実（図2）は、これらの変異のどれもが自然界で試行錯誤的なランダム変異の結果として生じたものではないことを示唆している。いくつかのBA.1-0.1、BA.1.1-0.1、BA.2-0.1分離株では、他のウイルス（補足図1）で見られるように、同義変異はほとんど検出されない（図2および補足図2）。c25000uは、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.1.1-0.1、BA.2-0.1分離株が形成されるまで起こらなかった唯一の同義変異であり、α、β、γ、δなどの以前の変異株では観察されなかった。それにもかかわらず、c22120u、c24034u、c23635u、c24448u、c21811u、a23884g、c22987uのような同義変異を持つ変異株の出現は非常に不可解である、 c23609a、c23413u、c23896u、c22879u、u24097a、c23893u、c24442u、u24847c、c24382u、c22264u、c22879u、c22480u、u21976c、c22480u、g24577a、u23101cのような同義変異株がBAに存在する。 1 .1、BA.1-0.1およびBA.1 .1-0.1分離株（Fig. 2 Synonymous Others）、a22948g, c23635u, c21859u, c22945u, c23701u, c22987u, a24433g, c23347u, u24640c, a24619g、 c24865u、a23989g、u23047c、 u24346c、c21811u、c21952u、 a22753u、c23635u、c24023u、 c24382u、c22572uがBAに含まれる。 2-0 .1 分離株（補足図2 Synonymous Others）では，これらのサブセットを持つ変異株が形成された．
様々なSARS-CoV-2変異株が成立する過程で、2つの異なるウイルス変異株が1つの細胞に同時に感染し、オミクロン変異株BA.1系統とBA.2系統の間でウイルスRNA合成の際に相同組換えが起こるとすれば、BA.1系統とBA.2系統の間にも相同組換えによる変異株が存在することが予想される。
そこで、オミクロン変異株のBA.1系統とBA.2系統の両方の変異アミノ酸サブセットを持つ分離株についてもBLAST検索を行った。その結果、オミクロンBA.1系統とBA.2系統の組み換え分離株が検出された。驚くべきことに、オミクロンBA.1系統とBA.2系統の組換え株であるSARS-CoV-2/human/PRI/PR-UPRRP-582/2020（GenBank: ON928946.1）は、2020年にはすでにプエルトリコに存在していた。オミクロン（B.1.1.529）はSARS-CoV-2の変異株で、2021年11月24日に南アフリカのゲノムサーベイランスのためのネットワークによって初めてWHOに報告された(13, 14)。ボツワナで最初に検出された後、世界的に拡散し、現在ではSARS-CoV-2の主流となっている(15)。オリジナルのB.1.1.529亜種の出現後、BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5など、オミクロンの亜種がいくつか出現した(19)。2022年10月以降、BQ.1およびBQ.1.1と呼ばれるBA.5の2つの亜型が出現した。
そこで、組換え株であるSARS-CoV-2/human/PRI/PR-UPRRP- 582/2020（GenBank: ON928946.1）が2020年にすでに存在していたのはなぜかという疑問が生じた。プエルトリコで流行しているSARS-CoV-2の分離株を、「PRI」、「PR-UPRRP」、「2020」というキーワードで検索した。その結果、得られた127のヒットの中に29のオミクロン関連配列が見つかった（図5B）。これらの結果から、Sタンパク質のアミノ酸配列を持つSARS-CoV-2系統は、オミクロンBA.1およびオミクロンBA.2と同一であることが示唆された。
の系統は、2020年にはすでにプエルトリコで流行しており、15株が完全なOmicron BA.1+を有していた。
R346K_mut-サブセット（BA1.1）、14株はc21595uの同義置換を有していた。4株はSタンパク質のアミノ酸配列がオミクロンBA2（BA.2_S）と完全に一致し、8株はオミクロンBA.2-0.1（BA.2-S:K440N）であった。
考察
オリジナルのSARS-CoV-2ウイルスは、実験室での偶発的な流出に起因するという仮説がいくつか提唱されている。近年のバイオテクノロジーの発展により、コロナウイルスを含む多くのウイルスが人工的に合成され、様々な実験に用いられている(20-22)。実験室で人工的に変異ウイルスを作り、変異を導入してウイルスの表現型を研究することは「リバースジェネティクス」と呼ばれ、ウイルス学では一般的な手法である。SARS-CoV-2のフリン切断部位には、連続したアルギニンをコードするコドン（CGG）が不自然に存在するため、SARS-CoV-2は人為的に生成されたと主張されてきた。
- 1）遺伝子操作されたウイルスがこのような最適でないフリン切断部位を利用する論理的理由はない。
- 2) SARS-CoV-1のSタンパク質のS1/S2境界におけるフリン切断部位の人為的挿入に関する、偽型ウイルス実験系を用いた唯一の先行研究では、SARS-CoV-2に存在するフリン切断部位の配列とは異なる最適な “RRSRR “配列が用いられている。
- 3) 武漢ウイルス学研究所では、コロナウイルスに完全なフリン切断部位を人為的に挿入した過去の研究の証拠もない。
- 4) フリン切断部位のアルギニンに隣接する不自然なCGGコドンはコロナウイルスではまれであるが、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、その他のヒトコロナウイルスでは特定の頻度で観察される。
しかし、これらは宣言に過ぎず、非論理的である。自然界に存在するウイルスがなぜ最適でないフリン切断部位を利用するのか、誰も説明していない。このフリン切断部位やCGGコドンを人工的に挿入することが技術的に可能であることについても言及されていない。Sタンパク質に多塩基性のフリン切断部位を挿入することは、SARS-CoV-2が天然に存在するウイルスか人工的なウイルスかを論じて結論することを不可能にしている。
オミクロン変異株のSタンパク質には多くの変異が蓄積しているにもかかわらず、変異のほとんどは非同義変異であり、同義変異はc25000uの1つだけで、極めて不自然であることから、オミクロン変異株は人工的に合成されたものであるという仮説が導かれる。本研究で示された以下の結果は、オミクロン変異株が自然発生ではなく人工的に合成された可能性があるという仮説を支持する可能性がある：
- 1）変異部位の1つがWuhant型であるオミクロン変異株関連分離株の存在、
- 2）これらの分離株ではSタンパク質の同義変異がほとんどないこと、
- 3）2021年11月24日に南アフリカからWHOに初めて報告されたはずのオミクロン変異株が、2020年にはすでにプエルトリコで流行していたこと、オミクロン株BA1とBA2の間の組換え株である分離株が存在したこと、
などである。また、オミクロン変異関連株（BA.1-0.1株、BA.1.1-0.1株、BA.2-0.1株）のうち、変異部位のひとつに武漢型変異を持つ株が樹立された。オミクロン変異関連分離株を樹立した後、同義変異を持つものもあった（図2および補足図2同義その他）。Sタンパク質の非同義変異によって生じた復帰アミノ酸変異を持つウイルスは人工的に合成され、その後自然環境でさらに同義変異を獲得したと考えるのが妥当である。
人為的に合成された非同義変異のみを持つ変異株が世界的に拡散していると仮定すると、自然環境下で、過去に同義変異を持たない非同義変異を持つ変異株が同義変異を獲得する仕組みが説明できる。SARS-CoV-2の現在の流行状況を考えると、これらのウイルスが自然に発生したとは考えられない。SARS-CoV-2分離株の形成を説明する上で、ここに示したように、SARS-CoV-2分離株はこれまでの生物学では説明できない全く新しいメカニズムで形成されている。
一つの考え方として、これらのウイルスが人工的に作られたという仮説は、新しい突然変異獲得メカニズムを提案するよりも合理的である。しかし、現在のSARS-CoV-2の流行を考えると、自然に発生したとは考えにくいこれらの変異株を人為的に作り出す理由があるのだろうか？
ウイルスエンベロープ上のウイルスタンパク質（エンベロープタンパク質、HAタンパク質、スパイクタンパク質など）の単一（あるいは複数）のアミノ酸の変異によって、多くのウイルスの病原性、宿主特異性、細胞向性、免疫原性が変化することが知られている。2009年のパンデミックA（H1N1）インフルエンザウイルスのHAタンパク質における1アミノ酸の置換は、その複製と病原性を変化させた(23)。チクングニアウイルスでは、E2糖タンパク質の1アミノ酸の変化が標的細胞結合のためのグリコサミノグリカン利用に影響を与え(24)、E1糖タンパク質の1アミノ酸の変化が蚊媒介蚊の特異性と流行性に影響を与える(25)。MERS-CoVやSARS-CoV-1のような過去のコロナウイルスでは、点変異が中和抗体に対する耐性を与えることが証明されている(26-28)。
仮にSARS-CoV-2オミクロン変異株とその1アミノ酸復帰変異株が人為的、組織的に作られたとしよう。その場合、他の変異株（アルファからデルタ）も人為的に作られたウイルスではないかと疑うべきである。実際、特に初期の変異株において見られる様々な変異の多くが、実際にウイルス感染の増加と関連しているという知見が今日まで得られていないことから(29)、一連の変異株は、感染性と病原性に関与するSタンパク質のアミノ酸を同定するために人為的に作られた可能性が支持される。
リバースジェネティクス実験はウイルス研究にとって不可欠なものであり、人工的に合成されたウイルスが意図的に世界中にばらまかれたと考えるのはウイルス研究にとって不都合である。しかし、リバースジェネティクスがウイルス研究で一般的になった今、人工合成ウイルスの可能性を排除せずにSARS-CoV-2の変異過程を議論することは科学的ではないと考える。
最後に、人工的に合成されたウイルスが拡散した可能性はあるが、リバース・ジェネティクス技術はウイルス学に多大な進歩をもたらしたので、我々はリバース・ジェネティクス技術を批判しているわけではないことを付け加えておきたい。また、われわれの分析は限られた数のウイルス配列データベースを用いており、配列決定の技術的問題や何らかの悪意によって信頼性の低いデータが登録された可能性も否定できない。また、これらのウイルスが悪意に基づいて人工的に合成され、配布されたものであると結論づけるものではない。この論文の目的は、SARS-CoV-2が従来のコロナウイルスの変異メカニズムでは考えられないような変異を受けていることを指摘することであり、SARS-CoV-2の変異株の形成については、人為的な理論の可能性も含めて真剣に議論してほしいということである。
それにもかかわらず、今回われわれが示した解析では、オミクロン変異株はこれまでの生物学では説明できない全く新しいメカニズムで形成されると結論づけられた。SARS-CoV-2の変異がどのようにして生じたかは、SARS-CoV-2パンデミックの再考を促すものである。
方法
データ取得
SARS-CoV-2 RNAゲノム、SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-H1（COVID-19/Wuhan-Hu-1CHN/2019/First Isolate）のアノテーションに基づく遺伝子とタンパク質： 変異の定義にはNC_045512.2を参照株として使用し、各タンパク質の塩基番号とアミノ酸番号のベースを提供した。本論文で示したSARS-CoV-2分離株のゲノムデータは、NCBI Nucleotide database (www.ncbi.nlm.nih.gov/)から2022/11/25から2023/03/17にコピーして入手した。
代表的なSARS-CoV-2変異株ゲノムのクエリー
SARS-CoV-2変異株のスパイク蛋白質（α:B.1.1.7、β:B.1.351、γ:P1、δ:B.1.617.2.63、λ:C.37、μ:B.1.621、οicron:BA.1、BA.1.1、BA.2）のアミノ酸配列をインターネットサイトより入手した。 )をインターネットサイト、Stanford Coronavirus Antiviral & Resistance Database (covdb.stanford.edu/)またはCovariant (covariants.org/)から入手し、NCBIタンパク質BLAST検索(blastp: protein-protein BLAST, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasth ome)のクエリー配列として使用した。次に、クエリーアミノ酸配列と100％一致するBLAST検索の結果から、クエリースパイク配列を持つ各バリアント分離株の全ゲノム配列を導き出した。検出されたSARS-CoV-2ゲノムの塩基配列は以下の通りである：
GenBank： MW423686.2; MW430966.1; MW430967.1; MW422256.1; MW598419.1; MW667552.1; MW667553.1; MW721502.1; MW721504.1; MW520923.1; MW642248. 1; mw642249.1; mw642250.1; mz182066.1; mz155303.1; mz155230.1; mz170364.1; mz179869.1; mw6666.1; mw696612.1; mw699217. 1; mw644498.1; mz727706.1; mz620161.1; mz637380.1; mz637401.1; mz780550.1; ol672836.1; ol677199.1; op769083.1; ol764360.1; ol815447. 1; on762438.1; ol849989.1; ol897126.1; ol896945.1; ol896936.1; ol896931.1; om233931.1; om072551.1; om072822.1; om296922.1.
Sタンパク質のアミノ酸配列を有するSARS-CoV-2オミクロン変異株ゲノムのクエリーで、オミクロン型ヌクレオチド変異サブセットの1つは変異しておらず、元のSARS-CoV-2 Wuhan-Hu-H1型の配置のままである。BA.1、BA.1.1およびBA.2の各オミクロン変異株について、オミクロン型ヌクレオチド変異サブセットのいずれかが変異しておらず、元のSARS-CoV-2武漢-胡-H1型配列のままであるS蛋白アミノ酸配列を有する分離株シリーズを、それぞれBA.1-0.1、BA.1.1-0.1およびBA.2-0.1と命名した。さらに本稿では、BA.1、BA.1.1、BA.2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれBA.1_S、BA.1.1_S、BA.2_Sと命名し、BA.1-0.1、BA.1.1-0.1、BA.2-0. 各オミクロンBA.1-0.1スパイクシリーズ（BA.1-0.1_Ss）はBA.1_S:V67A; BA.1 S:69H_70V;BA.1_S:I95T;BA.1_S:D142G_143V_144Y_145Y;BA.1_S:I211N_212L;BA.1_S:EPE;BA.1_S:D339G;BA.1_S:L371S;BA.1 s:p373s;バ.1_s:f375s;バ.1_s:n417k;バ.1_s:k440n;バ.1_s:s446g;バ.1_s:n477s;バ.1_s:k478t;バ.1_s:a484e;バ.1 S:R493Q; BA.1_S:S496G; BA.1_S:R498Q; BA.1_S:Y501N; BA.1_S:H505Y; BA.1_S:K547T; BA.1_S:G614D; BA.1_S:Y655H; BA.1_S:K679N; BA.1 S:H681P；BA.1_S:K764N；BA.1_S:Y796D；BA.1_S:K856N；BA.1_S:H954Q；BA.1_S:K969NおよびBA.1_S:F981L / オミクロンBA.1 .1-0.1スパイクシリーズ（BA.1.1-0.1_Ss）は、BA.1.1_S:V67A; BA.1.1_S:69H_70V; BA.1.1_S:I95T; BA.1.1_S:D142G_143V_144Y_145Y; BA.1 .1_S:I211N_212L; BA.1.1_S:EPE; BA.1.1_S:D339G; BA.1.1_S:L371S; BA.1.1_S:P373S; BA.1.1_S:F375S; BA.1.1_S:N417K; BA.1 .1_s:k440n; ba.1.1_s:s446g; ba.1.1_s:n477s; ba.1.1_s:k478t; ba.1.1_s:a484e; ba.1.1_s:r493q; ba.1.1_s:s496g; ba.1.1_s:r498q; ba.1 .1_S:Y501N; BA.1.1_S:H505Y; BA.1.1_S:K547T; BA.1.1_S:G614D; BA.1.1_S:Y655H; BA.1.1_S:K679N; BA.1.1_S:H681P; BA.1.1_S:K764N; BA.1 .1_S:Y796D; BA.1.1_S:K856N; BA.1.1_S:H954Q; BA.1.1_S:K969N; BA.1.1_S:F981L / オミクロンBA.2-0.1スパイクシリーズ（BA.2-0 .1_S）は、BA.2_S:I19T; BA.2_S:24L_25P_26P_S27A; BA.2_S:D142G; BA.2_S:V213G; BA.2_S:D339G; BA.2_S:F371S; BA.2 S:P373S; BA.2_S:F375S; BA.2_S:A376T; BA.2_S:N405D; BA.2_S:S408R; BA.2_S:N417K; BA.2_S:K440N; BA.2_S:N477S; BA.2_S:K478T; BA.2 S:A484E; BA.2_S:R493Q; BA.2_S:R498Q; BA.2_S:Y501N; BA.2_S:H505Y; BA.2_S:G614D; BA.2_S:Y655H; BA.2_S:K679N; BA.2_S:H681P; BA.2 S:K764N;BA.2_S:Y796D;BA.2_S:H954Q;BA.2_S:K969Nであり、これらのコンストラクトを図2、4および補足図1に示した。これらのSARS-CoV-2オミクロン変異株、BA.1-0.1、BA.1.1-0.1、BA.2-0.1のスパイクタンパク質のアミノ酸配列をNCBIタンパク質BLAST検索のクエリー配列として用いた。BLAST検索の結果、BA.1-0.1、BA.1.1-0.1、BA.2-0.1のアミノ酸配列は100%一致した。そして、検出されたSARS-CoV-2ゲノムの塩基配列は以下の通りであった、
GenBankアクセッション番号：OM117411.1; OP797378.1; OM789835.1; OP928789.1; OP928803.1; OP929381.1; OP929396.1; OP929417.1; OM173977.1; OM518459. 1; OM566981.1; ON019560.1; OM097227.1; OM096937.1; OM099902.1; OM117114.1; OM096685.1; OM354436.1; OM646886.1; OM472901.1; OM364511.1; OM131858. 1; ol815451.1; ol896986.1; ol897116.1; ol897118.1; ol896964.1; om367679.1; om343778.1; om409228.1; om396816.1; om134162.1; om075886. 1; om123427.1; om122677.1; om121681.1; om224850.1; on246090.1; om931599.1; om864873.1; om906519.1; om906587.1; om464776.1; om015999.1; om015958. 1; om015597.1; om016329.1; ol898806.1; ol898861.1; om016937.1; om016186.1; om036549.1; om051171.1; om126493.1; om079115.1; om099199. 1; om134489.1; om098796.1; on618279.1; on618009.1; om627701.1; om356511.1; om295457.1; on700063.1; om033824.1; on368355.1; om084700.1; on208126. 1; om566593.1; om945690.2; on030252.1; on019844.1; om890075.1; on020044.1; om833954.1; on376082.1; om084604.1; op795273.1; on066609.1; om352882. 1; om290510.1; om369978.1; om199342.1; om011974.1; om090274.1; om043984.1; om121683.1; om121624.1; om175506.1; om360429.1; om360221.1; om358058. 1; om500517.1; om135027.1; om742858.1; om521685.1; om896558.1; on694155.1; om686755.1; om484260.1; om332056.1; om156397.1; om079447. 1; om134645.1; om173298.1; om123082.1; om116023.1; om652943.1; ol994299.1; ol994920.1; om122027.1; om121015.1; ol898817.1; om527504.1; om225320. 1; om931491.1; om931575.1; om931587.1; om034409.1; om036283.1; ol996129.1; om035680.1; om096996.1; on065532.1; om968098.1; om816604. 1; on235452.1; on334146.1; op024162.1; op209732.1; om354578.1; om099080.1; om297301.1; om297438.1; om365368.1; om449159.1; om078863.1; om096959. 1; om117155.1; om133880.1; om077358.1; om372005.1; om770362.1; om897488.1; om918459.1; om918478.1; ol897115.1; ol897114.1; ol986779. 1; ol986696.1; ol987046.1; on831866.1; om864099.1; om863888.1; op745925.1; on831672.1; om043643.1; om176192.1; om226685.1; om343689.1; om295527. 1; om894975.1; om846676.1; om822024.1; om846844.1; om906550.1; om015933.1; om016323.1; om016331.1; om035685.1; om022498.1; om156115.1; om036875. 1; om099560.1; om199246.1; om067048.1; om079299.1; om099911.1; om116588.1; om097010.1; om173300.1; om805961.1; om983266.1; om983325.1; on618010. 1; om084691.1; on021265.1; on039239.1; on056981.1; on144127.1; om770527.1; om156164.1; om155119.1; om199353.1; om084630.1; om084605. 1; om084621.1; om359369.1; om411574.1; om584789.1; om720486.1; om429777.1; on047062.1; on065416.1; op415118.1; om954373.1; on042406.1; om335528. 1; om332335.1; om353626.1; om332813.1; om197398.1; om226919.1; om228399.1; om225859.1; om271353.1; om159454.1; om224473.1; om358278. 1; om361030.1; om412141.1; om496298.1; om044048.1; om121864.1; om224477.1; om227379.1; om228453.1; om622156.1; om906370.1; om970683.1; on117965. 1; om198667.1; om357800.1; om357161.1; om335230.1; om261124.1; om077578.1; om497172.1; om625194.1; om907131.1; on047464.1; om911851. 1; om042846.1; om155337.1; om097339.1; om116805.1; om134409.1; om686782.1; om695863.1; om724725.1; om174366.1; om822132.1; om822106.1; om822105. 1; om822485.1; om135143.1; om125829.1; om098855.1; om156118.1; om155114.1; om863926.1; op359104.1; on209298.1; on232806.1; on421981.1; on811217. 1; om698275.1; on052769.1; on060006.1; on060007.1; on060009.1; om843171.1; om843276.1; om843550.1; om843316.1; om843340.1; on049267.1; on450720. 1; on250163.1; on256603.1; on480422.1; om888844.1; om890089.1; on009425.2; on082904.1; om901275.1; om877094.2; om877095.2; om877096. 2; om877097.2; on378542.1; on389858.1; on389889.1; on390359.1; om936703.1; on352711.1; on378000.1; on177702.1; on205494.1; on378633.1; on617689. 1; on619375.1; om567618.1; om659585.1; om770913.1; om781641.1; om533441.1; om533458.1; om570235.1; om570252.1; om570249.1; om283361.1; om283362. 1; om283320.1; om283343.1; on618014.1; on618018.1; on618019.1; on618363.1; on311615.1; on383919.1; op579158.1; op054411.1; on633107.1; on414693. 1; on422887.1; op364296.1; op629673.1; on363097.1; op633561.1; on458445.1; on592247.1; on549687.1; on067040.1; on321116.1; on199452. 1; on200331.1; om861064.1; om969592.1; on019120.1; on221861.1; om861619.1; on091288.1; on151370.1; on233850.1; on236456.1; on296711.1; on535443. 1; on624524.1; on377450.1; on397268.1; on239032.1; on373649.1; on481637.1; on701163.1; on312677.1; on349263.1; on377487.1; on377609.1; om638574. 1; om911616.1; om988767.1; on019770.1; om988769.1; on468158.1; on608924.1; on604965.1; on535763.1; on378227.1; on378238.1; on728470.1。
BA.1とBA.2ゲノム間の組換えSARS-CoV-2 Omicron変異株のクエリー
BA.1_S:T19I_L24-_P25-_P26-_A27S_V213G_S371F_T376A_D405N_R408Sとして示されるオミクロン変異株BA.1とBA.2間の組換えスパイクタンパク質をNCBIタンパク質BLAST検索のクエリー配列として用いた。次に、BA.1およびBA.2の組換えオミクロン分離株の全ゲノム配列から、スパイクタンパク質領域の変異型BA.1およびBA.2で観察された特異的なアミノ酸変異の一部を検出した。検出されたSARS-CoV-2ゲノムの塩基配列は以下の通りである。
Accession No：
om360636.1; om410816.1; om429902.1; om497964.1; om565587.1; om628132.1; on549899.1; on449685.1; on176765. 1; om628094.1; on099844.1; om942313.1; on395480.1; on171854.1; on172005.1; on076710.1; on928946.1; om932113. 1; om942438.1; om989528.1; om499181.1; on414822.1; om878325.1; on103067.1; on103153.1; on419036.1; on928719.1; on337887.1; on420444.1; on146520.1; om469541.1; om904085.1; on254531.1; om881098.1; on373310.1。
2020年にプエルトリコで検出されたSARS-CoV-2 Omicron変異株ゲノムのクエリー
PRI PR-UPRRP 2020をキーワードに塩基配列を検索した（検索詳細： PRI[全フィールド] AND (PR[全フィールド] AND UPRRP[全フィールド]) AND 2020[全フィールド])で検索した。そして、検索結果はすべてのSARS-CoV-2分離株ゲノム配列であった。これらの配列のうち、SARS-CoV-2 Omicron variantに関連する配列は、GenBank Accession No: ON928761.1; ON928660.1; ON928794.1; ON928762.1; ON928848.1; ON928741.1; ON928918.1; ON928680.1; ON928975.1; ON928949. 1; ON928673.1; ON928865.1; ON928716.1; ON928663.1; ON928779.1; ON928896.1; ON928946.1; ON928912.1; ON928704.1; ON928873. 1; on928813.1; on928898.1; on928765.1; on928912.1; on928883.1; on928957.1; on928880.1; on928699.1; on928724.1; on928941.1。
ゲノムはSnapGeneソフトウェアを用いてアライメントした。各タンパク質のヌクレオチド番号とアミノ酸番号は、変異の定義のためにWuhan-Hu-1（NC_045512.2; COVID-19/Wuhan-Hu-1CHN/2019/First Isolate）を参照株として用いた。