Project Defuse：コウモリが媒介するコロナウイルスの脅威を取り除く

Contents

セクション II A. 要旨
セクション II C. 目標とインパクト
セクション II 　C. 目標と影響
セクション II　技術領域 I：
- 技術計画
- 技術分野2
セクション1.03 管理計画
セクションH 作業の概要フェーズ1
セクションH
セクション II J. 事前のリスク軽減計画
セクションIG. 倫理的、法的、社会的影響

注：仮訳、未編集

Title: Project Defuse: Defusing the Threat of Bat-Borne Coronaviruses

提案第1巻

ダルパ・プリエンプト（HR001118S0017）

主導団体： EcoHealth Alliance （その他の非営利団体）その他のチームメンバー： Duke NUS Medical School （その他の教育機関） University North Carolina （その他の教育機関） Wuhan Institute of Vius （その他の教育機関）：

Duke NUS Medical School (その他教育機関) University of North Carolina (その他教育機関) Wuhan Institute of Virology (その他教育機関) USGS National Wildlife Health Center (その他非営利機関) Palo Alto Research Center (大企業)

研究責任者および事務連絡担当者技術連絡担当者

ピーター・ダザック博士ルーク・ハメル

エコヘルス・アライアンス EcoHealth Alliance

460 West 34th Street, 17th Floor 460 ウェスト 34th ストリート 17 階

ニューヨーク州ニューヨーク 10001 ニューヨーク州ニューヨーク 10001

(p) 212-380-4474 (p) 646-868-4709

(e) daszak@ecohealthalliance.org (e) hamel@ecohealthalliance.org (f) 212-380-4465 (f) 212-380-4465

識別番号：HR001118S0017-PREEMPT-PA-001 授与形態要請する：実施期間：2018年12月1日～22年5月31日、カリフォルニア州パロアルト、中国昆明・武漢、ノースカロライナ州チャペルヒル、ニューヨーク、シンガポール、ウィスコンシン州マディソン

申請資金総額：14,209,245ドル提案有効期間：6カ月提案書提出日：3/2 6カ月提案書提出日：2018年3月27日

2018年 3月 24日

DARPA PREventing EMerging Pathogenic Threats（PREEMPT）委員会様、

PREventing EMerging Pathogenic Threats (PREEMPT, HR001118SOO17)プログラムへの以下の提案を受理していただきたい。このプロジェクトのPIは

ピーター・ダザック博士

エコヘルス・アライアンス会長 460 W. 34th Street, 17th Floor New York, NY 10001

212-380-4474

タイトル　プロジェクトDefuse：コウモリが媒介するコロナウイルスの脅威を取り除く

提案依頼額：14,209,245ドル

お時間をいただきありがとう。ご質問があれば、遠慮なく電話またはEメールでご連絡ください。

敬具

アレクセイ・チュムラ

エコヘルスアライアンスチーフ・オブ・スタッフ 460 W. 34th Street, 17th Floor New York, NY 10001

212-380-4473

セクション II A. 要旨

技術的アプローチ我々の目標は、アジアにおける新種のコウモリ由来高ゾンリスクSARS関連コロナウイルスの波及の可能性を排除することである。TAIでは、流出リスクの高いSARSr-CoVを特定した場所でコウモリを集中的にサンプリングする。そのスパイクプロテインの配列を決定し、リバースエンジニアリングして結合アッセイを行い、コウモリSARSr-CoV（WIVl、SHC014）のバックボーンに挿入して（これらはSARS-CoVではなくコウモリSARSr-CoVのバックボーンを使用するため、デュアルユースや機能獲得に関する懸念は免除される）ヒト化マウスに感染させ、SARS様疾患を引き起こす能力を評価する。我々のモデリングチームは、これらのデータを用いて、ウイルスの進化と波及リスクに関する機械学習による遺伝子型-表現型モデルを構築する。私たちは、どのスパイクプロテインが人への感染を可能にするかを評価するLIPSアッセイによって、過去に採取したヒトサンプルの血清学的データを用いて、これらのモデルを独自に検証する。東南アジア全域の洞窟におけるコウモリの種の構成を予測するための宿主-病原体空間モデルを構築する。このモデルは、我々のフィールドテストサイトである中国雲南省の3つの洞窟における宿主-ウイルス分布の完全なインベントリーと、コウモリの宿主-ウイルス関係に関する一連のユニークな世界的データセットをパラメータとしている。Yl末までには、アジア全域のあらゆる場所でコウモリが危険なウイルス病原体を保有している可能性を特定する、戦闘員用のプロトタイプ・アプリを作成する予定である。

TA2では、洞窟コウモリにおけるSARSr-CoVの排出を減少させるための2つのアプローチを評価する。(1)免疫調整剤をコウモリに接種して自然免疫反応をアップレギュレートし、ウイルスの複製をダウンレギュレートする広域免疫ブースティング、(2)特定の危険性の高いウイルスに対する自然免疫を強化するために、新規のキメラ多価組み換えスパイクプロテインと免疫調整剤をコウモリに接種する標的免疫ブースティングである。新規の自動エアロゾル化システム、経皮ナノ粒子塗布、食用粘着性ゲルなど、飼育コウモリへの接種物送達方法を試験する。フィールドと実験データに基づいた確率論的シミュレーション・モデリングを用いて、洞窟内のテストサイトにおけるウイルスの動態を特徴付け、接種のタイミング、接種プロトコル、送達方法、ウイルス抑制の効果を最大化する。最も効果的な生物学的製剤は雲南省の試験洞窟で試用され、概念実証としてウイルス排出の減少が確認される。管理アプローチ：我々の共同研究グループのメンバーは、15年以上にわたってコウモリとそのウイルスについて共同研究を行ってきた。主導組織であるエコヘルス・アライアンスがすべての作業を監督する。EHAのスタッフは、SARSに関連したCoVの流出確率を評価するモデルを開発し、免疫強化接種と免疫標的接種の両方を行うための最も効果的な戦略を特定する。具体的な作業は以下の組織に委託する：

ノースカロライナ大学のバリッチ教授は、CoVや他のウイルスのスパイクプロテインをリバースエンジニアリングしてきた20年の実績をもとに、標的免疫増強の研究をリードする。
ワン教授（デューク・ナトル・シンガポール大学）は、コウモリ免疫に関する彼のグループの先駆的研究を基に、広範な免疫増強の研究を主導する。
武漢ウイルス学研究所のShi博士は、収集した全サンプルのウイルス検査、結合アッセイ、ヒト化マウスの研究を行う。
USGS National Wildlife Health CenterのRocke博士は、コウモリを含む野生動物におけるワクチンデリバリーの研究を基に、免疫調節生物学的製剤のデリバリーを最適化する。
パロアルト研究センターのユニダッド博士は、免疫増強分子の新しい送達自動化エアロゾル化メカニズムの開発を主導する。

このプロジェクトには、3.5年のプロジェクト期間で総額14,209,245ドルの資金を要求している。

セクション II C. 目標とインパクト

概要　DEFUSEの包括的な目標は以下の通り：

アジアにおける新型SARS関連コロナウイルス（SARSr-CoV）の流出リスクを特定し、モデル化する。
コウモリが本来持っている低い自然免疫をアップレギュレートし（広範な免疫増強）、特にリスクの高いSARSr-CoVを標的とする（標的免疫増強）ことで、一過性に流出リスクを低減できることを設計し、概念実証する。

コウモリからウイルスが出現するリスクを軽減する我々の戦略は、USPACOM内の戦闘員を保護し、他の地域やウイルス（エボラ出血熱、ヘニパウイルス、狂犬病）にも拡張可能である。

セクション II 　C. 目標と影響

概要　DEFUSEの包括的な目標は以下の通り：

アジアにおける新型SARS関連コロナウイルス（SARSr-CoV）の波及リスクを特定し、モデル化する。
コウモリが本来持っている低い自然免疫をアップレギュレートし（広範な免疫増強）、特にリスクの高いSARSr-CoVを標的とする（標的免疫増強）ことで、一過性に流出リスクを低減できることを設計し、概念実証する。

コウモリからのウイルス出現リスクを低減する我々の戦略は、USPACOM内の戦闘員を保護し、他の地域やウイルス（エボラ出血熱、ヘニパウイルス、狂犬病）にも拡張可能である。

革新性と独自性：

コウモリは他のどの哺乳類グループよりも多くの新興人獣共通感染症を保有しており、どこにでも存在し、豊富で、見過ごされがちである。しかし、コウモリ由来の新型CoVへの曝露リスクを低減するための利用可能な技術はなく、有効な治療薬や対策もない。SARSr-CoVはアジア1’※3、アフリカ4、ヨーロッパのコウモリ5’※6で発生し、コウモリは洞窟をねぐらにするが、夜間は広く行動し、糞や尿にウイルスを排出する。私たちは、ヒト化マウスでSARS様疾患を引き起こすが、抗体治療やワクチン接種には反応しない株を分離した洞窟群の近くにある中国雲南省で、新型SARSr-CoVが人に伝播していることを示す直接的証拠を発表した。これらのウイルスは、コウモリの体内で循環・進化し、定期的にヒトに伝播するため、我々の軍隊や世界の健康安全保障にとって明白な危険である。

エコヘルス・アライアンス（EHA）は、ウイルス出現の予測モデルで世界をリードしている。私たちは、流出ホットスポットの機械学習モデル、宿主-病原体空間マッピング、遺伝子型-表現型マッピング、独自のデータセットを用いて、ウイルス出現のホットスポットリスクマップを検証し、改良していく。私たちは、コウモリの自然免疫力が低下しているため、通常であれば致死的なウイルスを持ち運ぶことができることを示してきた。我々は、低分子RIG様受容体（RLR）やToll様受容体（TLR）アゴニストのような戦略を考案し、コウモリの免疫をアップレギュレートし、ウイルスの複製を抑制することで、ウイルスの排出と流出を大幅に減少させる（広範な免疫ブースティング）。アゴニスト治療とSARSr-CoV組換えスパイクプロテインを組み合わせることで、特定の高リスクSARSr-CoVに対する成人のコウモリの既存の適応免疫反応を高める（標的免疫増強）。私たちは、野生動物ワクチンに関するこれまでの研究を基に、配備時の危険性を軽減するための新しい送達方法と自動化された適用方法をデザインする。

技術領域1

高リスクのSARSr-CoVを保有するコウモリが生息する中国雲南省の洞窟群に介入する。このシステムの3つの洞窟（1つは介入テストサイト、2つは対照サイト）から、月ごとのコウモリの生息数と多様性、ウイルスの有病率と多様性、個々のコウモリのウイルス負荷量、宿主の生理学的マーカーに関するデータを収集する;

コウモリの種、性別、年齢階級における低リスクおよび高リスクのSARSr-CoV株のゲノム解析、コウモリの生息域と洞窟間の移動に関する衛星テレメトリーと標識捕獲データ、コウモリ個体数の日、週、季節変化のモニタリングなどである。確率論的ニューラルネットワークを使用して、洞窟内のコウモリ種構成と、中国南部、南アジア、東南アジア全域におけるSARSr-CoVリスクの高い多様性を予測するための共同種分布モデル（JSDM）を構築する。これらはEHAのコウモリの宿主ウイルス関係のデータベースと、コウモリ種ごとの人獣共通感染ウイルスの豊富さの推定値7、中国南部のすべてのコウモリ洞窟の生物学的インベントリデータ、雲南省の洞窟テストサイトの完全なSARSr-CoVインベントリ、すべてのコウモリの種分布データを用いてパラメータ化される。USAIDが資金提供するPREDICTプロジェクトのもと、アジア6カ国から過去に収集した10,000を超えるコウモリサンプルのデータを用いて、ウイルス多様性予測のテストと検証を行う。ある場所でコウモリが危険なウイルスを保有しているリスクを特定するための、戦闘員用アプリのプロトタイプを作成する予定である。この「空間的ウイルス流出リスク」アプリは現場に配備可能で、監視データを用いてリアルタイムに更新され、予測の真偽を確かめ、微調整を行う。

SARSr-CoVの準種（QS）の流出リスクを特徴づけるために、武漢ウイルス学研究所チーム（WIV）は、コウモリの糞便、経口、血液サンプルからSARSr-CoVをPCR法で検査する。我々は新鮮な糞便からウイルス量のデータを収集する。SARSr-CoVのスパイクプロテインの塩基配列を決定し、ウイルス組換え事象を同定し、分離株を用いてヒト細胞内で複製可能な株を同定する。ノースカロライナ大学（UNC）のチームは、高リスクウイルスと低リスクウイルスの大規模サンプルのスパイクプロテインをリバースエンジニアリングし、さらなる特性解析を行う。これらのQS0株ウイルススパイクプロテインを合成し、ヒト細胞レセプターACE2に結合するものをSARSr-CoVのバックボーン（非DURC、非GoF）に挿入し、ヒト化マウスに接種して、SARS様疾患を引き起こす能力、モノクローナル療法、阻害剤GS-57348、あるいはSARS-CoV812に対するワクチンの有効性を評価する。

これらのデータを用いて、ウイルスの進化と宿主のジャンプリスクについて、機械学習による遺伝子型対表現型のベイジアンネットワークモデルを構築する。これにより、上記の遺伝的特徴と実験的アッセイに基づいて、QS0株のヒト細胞感染能力を予測する。スパイクプロテインの多様性、組換えCoV、コウモリの移動や移動による遺伝子の流れに関するデータを用いて、進化速度、組換え速度、ヒトに感染可能な新型株を生み出す能力を推定する。最後に、ウイルスと宿主の関係やコウモリの生息域のデータを用いてスピルオーバーの可能性を推定する。さらに、1）スパイクプロテインを用いた結合実験と細胞培養実験を行い、2）SARSr-CoVの高リスク株として指定された株が、コウモリの洞窟の近くですでにヒトに流出しているかどうかを確認する。われわれの予備調査では、この場所にいる人のコウモリSARSr-CoVに対する血清有病率は3%程度であった13。我々は、このプロジェクトで同定されたSARSr-CoVに対するルシフェラーゼ免疫沈降システム（LIPS）アッセイを用いて、我々のモデリングによって同定された高リスクおよび低リスクのSARSr-CoVに対する抗体が存在するかどうか、これらの以前に採取されたヒト血清（n>2000）を検査する予定である14。

技術領域2

TA2では、ヒトへのウイルス感染の可能性を減らすために、コウモリのリザーバー種内でSARSr-CoVを抑制するスケーラブルなアプローチを開発する。1）広範な免疫増強：コウモリのインターフェロンやTLRアゴニストのような免疫調整剤を適用して、コウモリの自然免疫をアップレギュレートし、ウイルスの複製と排出を抑制する。2）標的化免疫増強：広範な免疫増強処理の存在下で、多価キメラ組み換えSARSr-CoVスパイクプロテインを適用して、免疫記憶を増強し、特定のSARSr-CoVを抑制する。

この2つのTA2研究は1年目から並行して行われる。Wang教授（Duke-NatL Univ. Singapore – Duke-NUS）は、コウモリの免疫に関する先駆的な研究15を基礎として、広範な免疫増強研究を主導する。この研究には、DNA-インターフェロン（IFN）感知分子の中心的存在であるSTINGのような自然免疫因子の機能が弱まっていることを特定することで、コウモリがウイルスに対する効果的な、しかし過剰な反応を維持できる可能性がある16。i）TLR/RLR経路を活性化してIFN誘導を誘導する（例：polylGやS’ppp-dsRNA）。同様の戦略が、SARS-CoVのマウスモデルで実証されている18’19。インターフェロンはフィロウイルス20などに対して臨床的に使用されており、SARSr-CoVの複製はインターフェロン21に対して感受性がある）

ネガティブレギュレーターをブロックすることで、バットIFNを増強する。コウモリIFNaは構成的に発現しているが、高レベルに誘導することはできない17。私たちはCRISPRiを用いて潜在的な負の制御因子を同定し、この遺伝子を標的とする化合物をスクリーニングする。 iv) DNA-STING依存性およびssRNA-TLR7依存性の経路を介して、減衰したIFN産生経路を活性化する。変異したコウモリのSTINGは抗ウイルス機能を回復させることから、これらの経路がコウモリとウイルスの共存に重要であることが示唆される15。v) 粗製CoV断片を接種し、特定のCoVに対する自然免疫応答をアップレギュレートする。

バリッチ教授（UNC）が標的免疫増強研究を主導する。我々は、既知のSARSr-CoVとDEFUSEによって特徴づけられたものから、組換えキメラスパイクプロテイン22を開発する。SARSのSタンパク質の構造と宿主細胞との結合23の詳細を利用して、SARSr-CoVのスパイク3量体とレセプター結合ドメインの配列を決定し、再構築して特性を明らかにし、それらをナノ粒子やアライグマポックスウイルスベクターに組み込んでコウモリに投与する10’*4″27。免疫力を高める低分子化合物との組み合わせで、SARSr-CoVにさらされたことのある成体コウモリの免疫記憶を高めるためにこれらを使用し、フィールドテストに最適な候補を送り出す。グループ2BのSARSr-CoVの免疫原性ブロックを用いた組換えS糖タンパク質ベースの構築物は、広範な適応免疫応答を誘導し、コウモリの異種ウイルス負荷と人への感染リスクを軽減するはずである28’29。自然免疫の減衰は、これまでに試験されたすべてのコウモリ種で高度に保存されている。我々はDuke-NUS特有の

アジア洞窟コウモリ（Eonycteris spelaea）の繁殖コロニーを使い、WIVで捕獲した野生のRhinolophus sinicusコウモリの小集団に拡大し、初期免疫減弱テストを実施する予定である、

動物用ワクチンの開発から認可に至るまで30の実績を持つUSGS National Wildlife Health Center（NWHC）のRocke博士が、我々の免疫増強分子の新しい送達方法を開発し、実施する。地元で捕獲された食虫植物コウモリ31’32を用い、以下のような送達手段や方法を評価する： 1）経皮的に塗布するナノ粒子、2）コウモリが相互にグルーミングして消費する粘着性のある食用ゲル、3）洞窟環境用に設計されたプロトタイプの噴霧器（PARCのUnidad博士）によるエアロゾル化、4）重要な洞窟の入口でのタイマーや移動検知器による自動噴霧などである。研究室31での狂犬病に対するコウモリのワクチン接種、野生の吸血コウモリでの送達・消費・拡散の成功など、野生動物に対するこれらの技術に関する広範な予備データがある。私たちはNWHCの飼育下コウモリのコロニーと米国の洞窟にいる野生のコウモリを使って、ローダミンBというバイオマーカー（消費時に毛に蛍光標識がつく）を使った送達手段の試験を行い、その取り込みを評価する。

最も効果的な免疫調節製剤を用いて、雲南省の試験洞窟で野生のコウモリを対象に、最も最適な展開方法をテストする。実験洞窟と対照洞窟に生息するコウモリの個体数は、配備試験の前後でウイルス量を縦断的に調査する。EHAはこれらの洞窟に10年間アクセスすることができた。DEFUSE Yrlでは、動物研究のIACUCと国防総省ACUROの承認を迅速に得た実績に従い、雲南省林業局と疾病管理センターの協力者に実験的試験の許可を求める。現場と実験データから得た現場でのウイルス循環動態の確率論的シミュレーション・モデリングを用いて、TA2の治療効果を最大化する最適な戦略をモデル化する。介入に必要な頻度と人口カバー率を推定し、再コロニー化または進化によって高リスクのSARSr-CoVが再発するまでのウイルス抑制期間をモデル化する。

成果物

新規SARSr-CoVの地理的および宿主特異的伝播リスクを特定するオープンソースモデルとアプリ

” ウイルス株の伝播に関する遺伝子型-表現型モデルを実験的に検証した。

コウモリの自然免疫を調節してウイルスのシェディングを減少させる実証済みの技術

他のコウモリの宿主-病原体システム（狂犬病、WNSなど）におけるワクチンも含め、コウモリの洞窟を利用するための送達メカニズムを試験・検証した。

野生コウモリのウイルス排出を一過性に減少させる概念実証済みのアプローチで、エボラウイルスを含む他のシステムにも適応可能である。

セクション II　技術領域 I：

技術計画

場所とモデル宿主-ウイルス系の選択。過去14年間、我々のチームは中国南部のコウモリ集団でCoVサーベイランスを実施し、その結果〜10,000サンプル中180以上のユニークなSARSr-CoVを検出した（5%以上の有病率、同一ウイルス株を保有する複数の個体を含む）2,21,33。コウモリのSARSr-CoVは遺伝的に多様であり、特にS遺伝子においてSARS-CoVと大きく異なっている。しかし、雲南省にある我々の試験洞窟では、流行性SARS-CoV34の遺伝的構成要素をすべて含む準種（QS）集団が存在する。我々はそこで、他のSARSr-CoVとは異なり、スパイクの受容体結合ドメイン（RBD）に2つの欠失を含まず、SARS-CoVとはるかに高い配列同一性を持つ3株（WIV1、WIV16、SHC014）を分離した（図1）。1）、SARS-CoVと同様に細胞侵入にヒトACE2レセプターを使用し（図2）、流行性SARS-CoV11’12と同様に、ヒト肺気道初代細胞を含む様々な動物およびヒト細胞2’3’33-35で効率的に複製する。これらのSARSr-CoV S遺伝子をSARS-CoVバックボーンに挿入したキメラ（組換え体）、および合成的に再構築された全長のSHCO14とWIV1は、ヒト化マウス（ヒトACE2を発現するマウス）にSARS様疾患を引き起こし、臨床症状はSARS-CoVモノクローナル抗体療法やワクチン接種では軽減されない11’12。われわれのテストケーブから6km離れた場所に住む人々はSARSr-CoV抗体を持っており13（～3%の血清有病率）、このことは活発な波及を示唆している。これらのデータ、SARSr-CoVの系統地理学、およびコウモリとそのCoVの共発生解析（未発表）から、中国南西部のコウモリ洞窟、およびRhinolophus属のコウモリがSARS-CoVクレードの起源である可能性が高く、現在のQSからSARSr-CoVが出現する危険性があることが示唆される。これらのウイルスを保有するRhinolophus属のコウモリはアジア、ヨーロッパ、アフリカ全域に生息している。したがって、DEFUSEのフィールドワークは中国南部のリスクの高い場所を中心に行われるが、これらのウイルスが流出するリスクを減らすための我々のアプローチは、4つの戦闘司令部地域（PACOM、CENTCOM、EUCOM、AFRICOM）に広く適用できる。

図1（左上）： SARSr-CoVとSARS-CoV34のスパイクプロテインのレセプター結合モチーフのアミノ酸配列のアラインメント。番号のついたアミノ酸残基はヒトACE236との相互作用を担っている。図2（右上）：コウモリSARSr-CoV WIV1はヒト、ハクビシン、コウモリACE22を発現するHeLa細胞で効率よく複製される。

中国雲南省のテスト洞窟におけるコウモリSARSr-CoV QSの全インベントリー。我々のモデリングの訓練と検証のためのデータを提供し、免疫調節試験（TA2）のベースラインとして、DEFUSEのフィールドワークは、我々がフィールド試験を実施する中国南西部、雲南省の高リスク洞窟サイト（図4、赤い三角形）を対象とし、ここで我々は以前に高リスクSARSr-CoVを同定・分離している2,11,33,34。3カ所の洞窟（1カ所は試験用、2カ所は対照用）で、SARSr-CoVのベースラインQS0リスクを測定する。SARSr-CoVを検出・分離するためにコウモリの個体群の長期的なサーベイランスを行い、ウイルス有病率の経時的変化を測定し、コウモリの個体群の人口統計と移動を測定して、SARSr-CoVの宿主-ウイルス動態の特徴を明確にする。フィールドデータにより、我々のモデル予測の精度を検証し、実験動物モデルとフィールド試験の有効性を比較することができる。我々の予備的データ（表1）は、R. sinicus、R. ferrumequinum、R. off inis（試験地で同居している）がSARSr-CoVの主要な貯蔵庫であり、3つの高リスク株（WIV1、WIV16、SHC014）の唯一の貯蔵庫であることを示している。夕方の飛翔中にハープトラップやミストネットを使ってRhinolophus属のコウモリを捕獲し、交差汚染を避けるために滅菌技術を使って直腸、口腔、全血サンプルを採取する（コウモリ1頭につき2個体）。宿主DNAバーコーディング、宿主ACE2受容体遺伝子の塩基配列決定（インターフェイスサイト-1種につき3個体）、系統解析のために2mmの翼組織パンチ生検を行う。コウモリは皮下にマイクロチップ（PITタグ）を装着し、形態学的・生理学的データ（年齢階級、体重、繁殖状態など）を得る。

第1段階では、R. sinicus、R. ferrumequinum、R. affinisの各60頭（洞窟あたり180頭）のコウモリを、3カ月ごとに18カ月間、3つの洞窟から非破壊で採集する。私たちが調査した場所でのRhinolophus属におけるSARSr-CoVの有病率が約6～9%（n=3,304）であったことから、このサンプルサイズであれば、サンプリング期間や洞窟間で10%のウイルス有病率の変動を検出することができる。コウモリを物理的に捕獲しない四半期ごとの2カ月間は、ねぐらの下に清潔な2m2のポリエチレンシートを敷いて新鮮な糞便を採集する37。Rhinolophus属は7週間の妊娠期間を持ち、春に出産し、交尾期間中に集合する。毎月のサンプリング戦略により、確率シミュレーションモデルのパラメータ化に十分なデータを収集し、2回の交尾期間と妊娠期間をカバーして、ウイルス有病率と免疫マーカー（インターフェロンなど）レベルの生活史に起因する変化を評価する。フェーズⅡ（TA2）の間、試験地と対照地のコウモリにおけるSARSr-CoV QSとコウモリの免疫状態の変化をモニターするため、介入前と介入後のサンプリング（4カ月間、隔週で糞ペレットサンプリング）これらの洞窟のねぐらの大きさは比較的小さく、捕獲したコウモリを個別にマーキングしているため、個々のコウモリの免疫状態を追跡することができる。デューク国立大学の飼育下コウモリ研究で検証されたナノストリング免疫プロファイリングパネルを用いて免疫状態を評価する予定である。赤外線スポットライトとデジタル赤外線イメージングを用いて、各プラスチックシートの上にいるコウモリの数と種を記録し、糞のペレットを遺伝子バーコード化して種の同定を確認する38。サンプルはウイルス輸送用培地で保存され、液体窒素ドライシッパーで直ちに凍結され、コールドチェーンが維持され、厳格なバイオセーフティ・プロトコルの下でパートナーの研究所に輸送される。各洞窟の入り口に取り付けたPITタグリーダーと耐候性赤外線カメラにより、時間的なねぐら場所の忠実度、洞窟間の移動率、コウモリ個体数の日内変動を受動的にモニタリングする39。ICARUS衛星発信器（lg）を各調査のねぐらから12頭のRhinolophus属のコウモリ（合計36頭）に取り付け、夜間の採餌分散パターンを決定する（https://icarusinitiative.org）。テレメトリーとPITタグのデータは、生息域やねぐら間の混合の度合いを算出し、動態モデルのパラメータ化を行うために使用する。

調査洞窟は携帯型LiDAR技術40 42を用いて調査され、ねぐら地域の3D画像と、TA2（図3）において免疫調節治療の標的を定めるための種の構成に関するデータが得られる。ウイルスの検出を最適化するため、実験室とモデルの結果に基づいてサンプリング数を調整する。

図3：洞窟の特徴を把握し、集団でねぐらを作っているコウモリの個体数を定量化するための光検出・測距（LiDAR）スキャン： A）LiDARシステムがクラスター化したコウモリの360°全方位写真を撮影、B）写真を3D点群に変換、C）レーザー反射強度に基づいてコウモリ以外の点を除去、D）自動計数アルゴリズムが個々のコウモリを計数。図41から。

我々のチームは、生物学的サンプリングのためのコウモリの安全かつ人道的な取り扱いについて、50年以上の経験を有している。このプロジェクトは適切なIACUC/ACUROガイドラインとPPEガイドラインの下で実施される。EHAは現在進行中のDTRA支援プロジェクトをいくつか抱えており、国防総省から動物研究に対するACUROの承認を得ている。また、現在タフツ大学（EHAスタッフは非常勤講師である）を通じてIACUCプロトコルを維持しており、DEFUSEのlACUCに使用する予定である。

アジア全域の高リスク場所とコウモリ種の予測モデル。アジア全域におけるコウモリとウイルスの多様性と波及リスクを予測するモデルを構築し、戦闘員と計画立案者がリスクと介入展開の必要性を評価できるようにする（TA2）。地域スケールの生物種共同分布モデル（JSDM）、機械学習による宿主とウイルスの関連モデル、およびノンパラメトリックなウイルスの多様性推定モデルを組み合わせて、アジア全域の洞窟内のコウモリ群集の構成、主要なウイルスクレードの宿主範囲、および未サンプルのウイルス多様性をそれぞれ予測する。確率的フィードフォワード・ニューラル・ネットワークを用いて、（コウモリとそのウイルスに見られるような）観測が不完全な複数のスケールで有効なJSDMを実装し、環境や進化によって引き起こされるコウモリ種の共起を考慮する43。我々は、この地域の200以上の洞窟の生物学的インベントリデータ44、生理学的に関連する生物気候変数（BIOCLIM）45、オープンソースの地形データ、および起伏や生息地の不均質性などの地下生息地のプロキシにJSDMを適合させる。以前の研究46と同様に、地域スケールの環境変数（土地利用、道路までの距離など）や洞窟固有の変数（洞窟の長さ、ねぐらとなる場所の有無、入り口の大きさ、洞窟の複雑さなど）を用いて、これらのモデルを改良する。独立したコウモリの出現推定と観察47,48を用いてこれらを検証し、既知の宿主とウイルスの関係をすべて網羅したEHA独自のデータベースを用いて、コウモリCoVの多様性と宿主範囲の予測を拡張する7（図4）。一般化加法宿主形質予測モデルと機械学習アルゴリズム（BRT、ランダムフォレスト）49をノンパラメトリック推定量とともに用いて、各コウモリ種のQSにおけるSARSr-CoV多様性を予測し50、サンプリングを通じてリアルタイムでウイルス発見率を評価する（図5）。

図4：中国と東南アジアにおけるコウモリの人獣共通感染症ウイルス多様性の予測マップ（黄色=より多くのウイルス）。我々の雲南テストケーブサイトは赤のアスタリスクで示されている。図5：4属のコウモリのPREDICTサンプリングデータ（実線）に基づくCoV QS多様性の推定値（破線、95%信頼区間）。

予測モデルの地理的範囲を拡大するため、アジア6カ国の10,000以上のコウモリ個体サンプルから1800以上のウイルス検出（CoVとその他）のデータを含める予定である（NIAIDとUSAIDのPREDICT資金提供）。種の構成とウイルスの存在予測については、データの20%検証サブセットとフィールドデータに対してモデルを検証する。

戦闘員用アプリの試作。国防総省向けのデータ収集・分析用アプリケーションの構築経験（例：https://flirt.eha.io/、https://eidr-connect.eha.io/、https://mantle.io/grrs）を活用し、現場のコウモリから危険なウイルス病原体が流出する確率を特定する、戦闘員向けの「空間的ウイルス流出リスク」アプリのプロトタイプを作成する。空間的リスクモデリング、観察・予測された宿主とウイルスの関連性、オープンソースの生物種と病原体のオントロジー、そしてアプリが直接提供するクラウドソーシングのエコロケーション・データから得られたアウトプットを用いて、その予測能力を実証し、微調整を行う。このアプリは、宿主-ウイルス結合アッセイとSARSr-CoV調査から得られた追加リスクデータを取り入れるため、Y2とY3で更新される予定である。我々はEHAのリスクランキングアルゴリズム（https://ibis.eha.io/）を使用し、地理的位置の特徴、情報の新しさ、宿主および病原体の特徴に基づいて、リスクの高い重要な地域を表示する。このアプリはユーザーのGPS位置データを収集し、JSDMからコウモリ種の分布と群集組成の推定値を事前にロードする。これらは、コウモリ検出用の携帯電話対応高周波マイク51を使用して洞窟サイトに入ることなく収集されたリアルタイムの監視データで改良され、畳み込みニューラルネットワーク52を使用して基準となる音響コールを検証・訓練する。特定されたコウモリの種は、EHAの宿主-病原体データベースからのウイルス多様性データおよびDEFUSEからのSARSr-CoVデータと自動的にリンクされ、病原体中心、コウモリ中心、または地図中心のビューとして表示される高リスク病原体リストが提供され、重要な情報が受信された際には積極的なアラートが発せられる。すべてのコードモジュールはGitHub (github.com/ecohealthalliance/)で公開され、文書化される。この技術により、コウモリから発見された既存および新規の感染性病原体に関する全体的な状況認識が改善され、国防総省の職員は、波及リスクの高い地域を迅速に特定し、必要な場合には、その影響に先手を打って対応し緩和するためのリソースを迅速に配備することができる。

SARSr-CoV QSの検出、配列決定、回収。すべての既知のAおよびP-CoVs1’53のRNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子（RdRp）内の440 nt断片をターゲットとする汎CoVコンセンサスワンステップ半断続RT-PCRアッセイ、および既知のSARSr-CoVs2’21’33’34の特異的アッセイを用いて、SARSr-CoV核酸の検体をスクリーニングする。PCR産物をゲル精製し、塩基配列を決定し、SARSr-CoV陽性サンプルでqPCRを行い、ウイルス量を決定する。すべてのSARSr-CoVの全長ゲノムまたはS遺伝子のハイスループット塩基配列を決定し、ゲノムウォーキングを行う2,3,34。S遺伝子のヒトACE2との結合能力については、Biocoreまたはウイルス侵入アッセイで解析する。キメラ新規SARSr-CoV QSの合成： SARSr-CoVのS糖タンパク質遺伝子を商業的に合成し、SHC014またはWIV16分子クローンバックボーン（流行性SARS-Urbaniに対するSタンパク質の同一性は88%と97%）に挿入するようにデザインする。これらはBSL-3であり、選択薬剤でもP3C0の対象でもなく（免除されているバットSARSr-CoVバックボーンを使用している）、hACE2トランスジェニックマウスに病原性を示す。異なるバックボーン株は、生存ウイルスの回収率を高め、株間のRNA組換えを介した遺伝子導入の障壁を特定する34。組換えウイルスはVero細胞、またはヒト、コウモリ、ハクビシンのACE2レセプターを過剰発現させたマウス細胞で回収し、RBD-ヒトACE2界面の弱いウイルスの培養をサポートする。全長SARSr-CoVの回収：近縁株（塩基変異5%未満）のパネルから得られた配列／RNAseqデータをまとめ、全長ゲノムを比較し、配列決定エラー54’56を表すユニークなSNPをスキャンする。コンセンサス候補ゲノムは、確立された技術とゲノム長RNA、組換えウイルスを回収するためのエレクトロポレーションを用いて、商業的に合成される（BioBasicなど）28’57。

株特異的SARSr-CoV波及リスクを予測する。試験洞窟におけるQSpの詳細な実験的特性化と、最新の遺伝子型-表現型ベイズネットワークモデルを組み合わせる。これにより、ユニークな遺伝的組換えによって出現する将来のQSのジャンプ確率を予測することが可能になる。我々のモデルは、コウモリSARSr-CoVのS遺伝子に関する一連のアッセイから得られた実験データ（図6、右）を用いてパラメータ化される。われわれの先行データは、スピルオーバー・リスク・モデリングをパラメータ化するためのベースラインとなる11,12,29,58。これに加えて、DEFUSE下で分離されたウイルス（WIV）、コウモリSARSr-CoVスパイクプロテインの特性評価（UNC、WIV）（年間約15-20個）、そして我々の先行研究で塩基配列が決定され、まだスピルオーバーの可能性について検討されていない180以上のコウモリSARSr-CoV株が追加される。すべての実験は3連で行われ、データはリアルタイムでモデルに供給される：

SARSr-CoVのQSジャンプ可能性の実験的アッセイ（図6、右）。構造タンパク質モデリング、変異同定、偽ウイルスアッセイによる事前スクリーニング：ウイルスの侵入はSARSr-CoVs29’58のスピルオーバーを妨げる主要な生物種の制限である。さらなる特性解析のためにQSを選択するために、まずSARSr-CoVのSタンパク質の構造モデリングを行い、ACE2受容体59’60への結合を予測する。RBD29’58’61’62の変異、およびS糖タンパク質の宿主プロテアーゼによるタンパク質分解処理63 65は、SARSr-CoVの細胞侵入と種を越えた感染性を制御している。S-RBD-ACE2またはSタンパク質分解処理にミスマッチがあると、SARS-CoV29’58の細胞侵入が妨げられ、これらのミスマッチを持つQSは優先順位が下がる。RNAseqを用いて、ACE2結合に関連する変異をコードするQSの低量変異体を同定し、RBDにおける低量で結果の大きい微量変異の影響を評価する。単離された株については、確立された技術2を用いた試験管内試験擬似ウイルス結合アッセイ、および生ウイルス結合アッセイ（ウイルス培養の遅延と不必要な拡散を防ぐためWIVで）を実施する。これらのデータ入力に基づく初期モデル予測は、さらなる特性解析のための菌株選択の指針となる。キメラウイルスの試験管内試験：すべてのキメラウイルスは配列が検証され、i)試験管内試験での種を超えたACE2レセプターの使用、ii)一次HAEでの増殖、iii)RBD66’67のユニークなエピトープを認識する広範な交差中和ヒトモノクローナル抗体に対する感受性が評価される。

いくつかの分離株がわれわれのmABパネルに高い耐性を示した場合、われわれはトロントで発生したヒトSARS-CoV血清サンプルの限定数に対する交差中和を評価する予定である。スピルオーバーの可能性のある新規S遺伝子をコードするキメラウイルスは、全ゲノム長の生存ウイルスとして回収するためのSARSr-CoV株を同定するために使用される。In vivoでの病原性： 10匹の動物を1.0 x 104 PFUのvSARSr-CoVで経鼻感染させ、臨床症状（体重減少、呼吸機能、死亡率など）を6日間追跡し、2日目または6日目に犠牲にして、ウイルス学的解析、肺の病理組織学的検査と免疫組織化学的検査、22パラメータ全血球算定（CBC）と気管支肺胞洗浄（BAL）を行う。全長ゲノムQSによる検証：キメラウイルスの結果を全長ゲノムの再キャラクタリゼーションによって検証し、バックボーンゲノムの配列が全長SARSr-CoVのスピルオーバーの可能性を変えるかどうかを検証する。抗原性、レセプターの使用法、ヒト細胞での増殖、病原性などにおける株の違いを反映するように、全ゲノムの特徴を明らかにするためのQSを選択する。HAEの初代培養物での増殖と、hACE2トランスジェニックマウスでの生体内試験での増殖をテストする。年間3-5個の完全長ゲノムウイルスを回収する予定である。合成修飾をテストする： \特定の遺伝的形質の効果や、将来的な未知の組換え体のジャンプの可能性を決定するために、新規の変異の組み合わせでQSを合成する。RBD欠失： SARSr-CoVのRBDの特定部位における小さな欠失はヒト感染のリスクを変化させる。これらのRBD欠失がSARSr-CoVのhACE2レセプターの利用、HAE培養での増殖、生体内試験での病原性に及ぼす機能的影響を解析する。まず、SHC014とSARS-CoV Urbaniにおいて、これらの領域を順次あるいは組み合わせて欠失させ、欠失の導入によりVero細胞とHAE58でのウイルス増殖が阻止されることを期待する。

並行して、RBD欠失修復が低リスク株のヒトACE2使用能力を回復させ、ヒト細胞で増殖するかどうかを評価する。S2 Proteo/yt/c C/eavageとG/ycosytot/on部位：受容体結合後、様々な細胞表面またはエンドソームプロテアーゼ68’71がSARS- CoV S糖タンパク質を切断し、S構造の大きな変化を引き起こし72、融合媒介による侵入を活性化する64,73。我々は、S2における適切に保存されたタンパク質分解切断部位と、潜在的なフーリン切断部位74,75の存在について、すべてのSARSr-CoV S遺伝子の配列を解析する予定である。タンパク質分解切断部位にミスマッチがあるSARSr-CoV 5は、外因性のトリプシンやカテプシンLで活性化される。明らかなミスマッチがある場合は、適切なヒト特異的切断部位を導入し、Vero細胞やHAE培養で増殖性を評価する。SARS-CoVでは、擬似型粒子研究に基づいてこれらの部位のいくつかを切除し、SARSr-CoVのS変化によるウイルス複製と病原性への影響を評価する。私たちはまた、機能的なタンパク質分解切断部位をコードする低存在量の高リスクSARSr-CoVの深い配列データを検討し、もしそうであれば、これらの変化を適切な高存在量の低リスク親株に導入する。N-結合型グリコシル化： SARS-CoVがマクロファージや単球に侵入するための代替レセプターであるDC-SIGN/L-SIGNとSARS-CoV粒子の結合を制御するグリコシル化イベントもある76’77。ハクビシンやタヌキからのヒトSARS-CoVの出現には、2つの新しいN-結合型グリコシル化部位が導入された変異が関与している可能性がある77。この部位はハクビシンやタヌキの株やクレード2のSARSr-CoVには存在しないが、W1V1、WIV16、SHC014には存在することから、宿主のジャンプにこれらの部位が関与している可能性がある。これを評価するために、SARS-CoVとSHC014のクレード2の破壊残基を順次導入し、Vero細胞、DC-SIGNを異所性に発現する非許容性細胞、ウイルス増殖効率の低下を予測したヒト単球とマクロファージでのウイルス増殖を評価する。rs4237 RBD欠失修復株にN-結合型グリコシル化をもたらすクレードI変異を導入し、HAE、Vero細胞、または非寛容性細胞+異所性DC-SIGN発現77でのウイルス増殖効率を評価する。In vivoでは、トランスジェニックhACE2マウスで病原性を評価する。

低存在micrp-ygriatigns： SARSr-CoVのS RBDにおける高度に可変的な残基変化を構造的にモデル化して同定し、市販の遺伝子ブロックを用いて、低リスクの親株のS糖タンパク質遺伝子にこれらの変化を単独または組み合わせて導入し、ACE2レセプターの利用、HAEでの増殖、生体内試験での病原性を試験する。

図7：入力データ、モデル化されたプロセス、出力間の因果関係を表すベイジアンネットワークモデルの簡略化された有向グラフ。

高リスクSARSr-CoV株の波及可能性を予測するためのネットワーク機械学習。上記の実験データを用いて、コウモリSARSr-CoVのスピルオーバー可能性に関する遺伝子型-表現型モデルを構築する。ベイズネットワークモデル（Bayesian Network Models：BNM）を用い、コウモリSARSr-CoVの遺伝子型データ（RBDにおける欠失の有無、タンパク質分解結合部位、グリコシル化部位など）と宿主の生態学的形質に基づいてスピルオーバーのリスクを予測する。ベイズ的アプローチにより、新たなデータの取得に応じてモデルを反復的に更新し、中間的なモデル予測を用いて、予測能力を最大化するために優先すべき実験の指針を得ることができる79。実験条件（生きたウイルス単離株、フルゲノムウイルスまたは合成キメラウイルス、後者の分子骨格を用いたアッセイ）を制御する。形質はBNMの因果関係グラフの入力として使用され、新しい宿主におけるSARSr-CoVのQS感染に寄与する相互に関連したプロセス（受容体結合、細胞侵入、免疫系相互作用、細胞内増殖）を表す潜在変数を予測する。これらは順次、宿主の病原性と宿主のジャンプの可能性という最終的な結果の予測因子として作用する（図7）。これらの遺伝的形質について発表された研究を用いて、因果グラフにおける相互作用の強さと方向について、有益な事前分布を設定する。事前知識モデルのシミュレーションを用いて、特性解析とゲノム配列決定のためのサンプリングからターゲット配列を選択し、モデルの予測力を最大限に高めるデータを収集する。正則化事前分布を使用してオーバーフィッティングを減らし、最終モデルで最も予測性の高い変数を選択する。

過去に収集されたヒトサンプルとサーベイランスデータからのSARSr-CoV血清学的検査を用いてモデルを検証する。調査地域におけるSARSr-CoVの活発な波及により、実際の波及リスクを測定し、QSジャンプの可能性に関するモデルを検証することができる。雲南省の試験洞窟の近くに住む人々から過去に採取された2,000人以上のヒト血清（NIAID、Daszak主任研究者）のLIPSアッセイを用いて、現地のヒト集団に見られるウイルス性QS抗体のデータを収集する。SARSr-CoVs13,80/81と新規のSADS-CoVs14について以前に行ったように、我々は高および低スピルオーバーリスクのSARSr-GoV QSをターゲットとしたLIPSアッセイをデザインする。1）高リスクと低リスクの異なるSARSr-CoV N遺伝子をpRElM-2ベクター（UPSベクター）に挿入し、まずN遺伝子の類似性を評価し、LIPSアッセイにおける交差反応性の可能性を決定する; 3) 抗原をそれぞれの陽性血清サンプルとインキュベートし、プロテインA/Gビーズを用いて溶出した抗原抗体複合体を用いてLIPSアッセイを検証する：ウイルス中和アッセイ。確認試験として、LIPSの陽性検体をウイルス中和アッセイで検証する。これらのLIPSアッセイを用いて、血清検体に高リスクおよび低リスクの.SARSr-CoV QSに対する抗体が存在するかどうかを検査する。LIPSアッセイで測定した曝露量を予測するために、宿主となるコウモリの生態学的データと、これらの個体から以前に収集したヒトの行動調査データを用いて、野生動物との接触を推定する。

潜在的な菌株を予測するための進化モデリングとシミュレーション。ベイジアンネットワーク・モデリングにより、同定したQS配列の波及リスクの予測を行う。全ウイルス集団に関連するリスクを検討するために、進化過程をモデル化し、シミュレーションすることで、サンプリングでは捕捉できなかった可能性の高いウイルスQSと、将来発生する可能性の高いウイルスQS（「QSX」）を特定する。先行研究およびDEFUSEの実地調査から得られたSタンパク質配列と全長ゲノムの大規模なデータセットを用いて、ベイズMCMCの枠組みの中で、合体モデルと分子時計モデルを用いて、SARSr-CoVの置換率とゲノム全体の変異を推定する82。これらのデータとベイズ推論83’84を用いて、洞窟集団におけるSARSr-CoVの組換え率を推定する。これらの推定値を用いて、特定のRNAウイルス機能をモデル化したシミュレーター（例えばV1RAPOPS86）に実装されているフォワードタイムアプローチを用いて、SARSr-CoV QSウイルソームの進化をシミュレートする。遺伝的形質の新しい組み合わせがウイルス集団に広がる速度を予測し、洞窟やコウモリの群れ間での組換え率を比較する。前方シミュレーションの結果は、未知のQSX種や将来のQSX種の可能性を示すものである。これらと波及リスクのSEMモデルを用いて、QSXが発生する可能性が最も高く、波及や病原性の可能性があるものを予測する。進化シミュレーションの結果を用いて、ベイジアンネットワークモデルを繰り返し改良する。病原性を予測する可能性のある遺伝形質の数は多いので、ツリーベースのクラスタリングを用いて変数削減を行い、共起性の高い形質を予測のための共同クラスタとして扱う。これらのクラスターは、DEFUSEのフィールドワークと先行研究から得られたすべてのSARSr-COV配列から作成する。形質クラスターは組換えによって変更される可能性があるため、前方進化モデリングを用いて、未知またはQSXゲノムで生じる可能性の低い形質クラスターのみを残し、形質クラスターがどの程度保存されるかを予測する。これにより、現在のサンプルに基づく予測力の向上と、まだ進化していない将来の株に対する一般化可能性のトレードオフが可能になる。

技術分野2

コウモリSARSr-CoV波及リスク低減のための免疫調節アプローチ a）コウモリは、ウイルス感染に反応し制限する可能性のあるTFNaを恒常的に高発現させている17。 c）NLRP3依存性のインフラマソーム経路は減衰しており、AIM2のような主要な炎症反応遺伝子はコウモリには存在しない87’88。これらの形質は、飛行のフィットネスコストとしてコウモリの免疫感知経路が適応したためかもしれない16。コウモリのウイルス複製は、構成的に発現しているIF Naによって素早く制限される可能性が高く、その結果、ウイルスの刺激が少ないためにB/T細胞の刺激も少ないと考えられる。第二に、インターフェロンとインフラマソーム応答が弱まることで、T/B細胞依存性の適応免疫（抗体応答など）を引き起こすのに必要なサイトカイン応答が低下し、最終的にウイルスの複製と排出が抑制される。我々や他の研究者は、この現象の概念実証を行った：天然のリザーバー宿主であるエジプトフルーツバットの実験的マールブルグウイルス感染では、低ウイルス量、短時間のウイルス血症、低セロコンバージョン、すぐに衰える低抗体価で広範囲に組織分布がみられ、長期的な防御が確立されていないことが示唆された89’91。中和抗体反応が乏しいことは、タカリベ・ウイルスをコウモリに実験的に感染させた後92や、SARS-CoVをコウモリに実験的に感染させた我々の研究でも起こっている（Wang、未発表）。我々はまた、コウモリのインターフェロンがコウモリのSARSr-CoVを抑制できることを示すことにも成功した21。我々は、コウモリのウイルスに対する自然免疫をアップレギュレートする免疫調整剤を使用することで、ウイルスの複製と排出が一時的に抑制され、宿主のジャンプリスクが減少すると仮定している。さらに我々は、Rhinolophus属のコウモリは寿命が長い（野生で20年以上）ため、個体群のほとんどのコウモリが、我々のサイトで様々なSARSr-CoV QSに暴露されているだろうと仮定している。高リスクのウイルス株に対する適応免疫（免疫記憶）のアップレギュレーションを特にターゲットにすることで、高リスク株のクリアランスが高まる可能性がある。私たちは、コウモリからヒトへのSARSr-CoVの流出を阻止するために、2つの免疫調整アプローチを評価する予定：キメラ免疫原の存在下で、成体コウモリの免疫記憶を活性化し、高リスクのSARSr-CoVのクリアランスを促進するために、広範な免疫増強アプローチを適用する。新規のキメラ多価組換えSタンパク質を、経口投与用の微粒子カプセル化ゲルや、キメラ組換えSARSr-CoV Sをアライグマポックスウイルスで発現させたウイルスアジュバント免疫増強戦略で使用する。この2つの研究は1年目から並行して行われ、効率、コスト、スケーラビリティが競合的に評価され、飼育下動物試験で成功した候補は、雲南省の試験洞窟で行われる生きたコウモリの試験に使用される。自然免疫の低さがコウモリ全体に見られることから、免疫増強はコウモリの属やウイルス科に広く適用できる可能性がある。

広範な免疫増強（Duke-NUS）。自然免疫をアップレギュレートし、ウイルス量を抑制する最も効果的なアプローチを特定するため、以下の主要なリードに取り組む。Toll様受容体（TLR）／RIG-I様受容体（RLR）リガンド：脾臓組織（図8）、肝臓、肺、リンパ節のトランスクリプトミクスで測定されたように、ポリルCのようなTLR刺激に対する生きたコウモリの頑健な反応を示している。これらの活性化プロファイルは、さまざまな刺激に対するコウモリの免疫反応を評価し、Duke-NUSでの実験系（下図）でウイルス量を低下させるものを同定するために使用される。

図8：LPSまたはpolyl:Cで刺激した後の全脾臓NGSのIngenuity Pathway Analysis（IPA）によるパスウェイ解析。コントロールのバットに対するZスコアの増加が目盛り通りに示されており、多くのパスウェイの強い活性化を示唆している。

また、SARS-CoV、IAV、HBVを排除したマウスモデルで示されたように、機能的なコウモリのIFN産生経路を活性化する天然のRIG-I刺激物質の模倣物である5’pppDSRNAでRIG-I経路を刺激する18’19。

万能コウモリインターフェロン：人工遺伝子合成により保存された普遍的コウモリインターフェロンタンパク質配列を設計し、組換えPteropus alecto IFNa17’93やCSF-l/IL-4で以前に使用したように、過剰発現コウモリ細胞からの上清を切断可能アフィニティタグ精製して組換えタンパク質を生産する。コウモリのための普遍的なIFNを利用することで、リガンドに対する種依存的な反応を克服し、幅広い地理的・生態的環境と多くのコウモリ種にわたってIFNを使用できるようになる。我々はすでに、適切な免疫活性化を誘導する、タグ付けされた組換え非ユニバーサルコウモリIFNを作製している（図9）。このリガンドはヒト、フェレット、マウスモデルにおいて、経鼻および経口的にウイルス力価を低下させることが示されている18’19’94。インターフェロンは、フィロウイルス20など、抗ウイルス薬が使用できない場合の有効な対策として、ヒトで臨床的に使用されている。

インターフェロンは毒性があることが知られているため、コウモリの用量耐性を注意深く調べ、治療の臨床効果を評価する。我々は、SARSr-CoVの複製がIFN治療に感受性があることを示している21。迅速な免疫活性化を最適化するために、送達の成功、免疫活性化、宿主への影響について徹底的に調べる予定である。

図9：コウモリウイルスはIFN処理に感受性がある。A) 組換えコウモリSARS関連コロナウイルスWIV1の複製は、Vero細胞においてヒトIFN-6により用量依存的に阻害された。B) コウモリPakiT03細胞において、組換えコウモリIFNa3は用量依存的にコウモリレオウイルスPRV1NBの複製を阻害した。

コウモリ特異的IFNネガティブレギュレーターをブロックすることで、コウモリIFNを増強する：ユニークなことに、コウモリのIFNaは天然に構成的に発現しているが、高レベルまで誘導することはできない。これはコウモリのインターフェロン産生経路に負の制御因子があることを示している17’95。我々はPteropus alecto CRISPRiライブラリープールを使用し、P. alectoゲノムの全遺伝子の複数のRNAターゲットを網羅するように作成した（Wang、未発表データ）。このライブラリーを用いて、コウモリ細胞におけるインフルエンザの複製に影響を与える遺伝子がすでに同定されている。CRISPRiを用いて負の制御因子遺伝子を同定し、それを標的とする化合物をスクリーニングすることで、より短期間でIFN系の誘導性を高めることができるだろう。これまでの研究96″98から、これはすべてのコウモリに保存された経路である可能性が高い。DNA-STING依存性経路とTLR依存性経路を含む、減衰したコウモリ特有の自然免疫経路を活性化する：変異型コウモリSTINGや、AIM2や機能的NLRP3ホモログの再構成によって抗ウイルス機能が回復することを示したが、これはこれらの経路がコウモリとウイルスの共存において重要であることを示唆している。STINGやTLR/RLRの下流の経路（TBK1活性化など）を直接活性化する低分子を同定することで、インターフェロンによるコウモリの自然防御を活性化し、ウイルスクリアランスを促進し、コウモリのウイルス量を大幅に減少させることができると考えられる。コウモリ・マウスモデルでの検証。様々なCoVはヒトの宿主内では効率的な感染と複製を示すが、マウスを宿主とすると、DPP4とACE2レセプターの違いもあって、侵入と複製に欠陥が見られる。

図10: A) 1×10*’コウモリ骨髄細胞におけるat-特異的qPCRの存在（24週間）

NSGコウモリマウス8ef<xe免疫

免疫後、12週間後にマウスを再構成した。B)24週後の循環中のコウモリ-マウス細胞のキメラ比。C)コウモリを再構成したマウスが産生したKLH-破傷風抗原に対する特異的抗体反応。

我々は、E. spelaeaを含む複数種のコウモリの骨髄を用いた照射マウスの効率的な再構成を示した（図10）。マウスにおけるコウモリPBMCの再構成を含め、循環するコウモリ細胞の存在と、抗体応答を産生できないマウスにおけるコウモリ特異的抗体の生成を示した。この「コウモリ化」マウスモデルは、SARS-CoVの循環感染（免疫コンパートメントのみ）と、CoVタンパク質に対するコウモリ特異的抗体の作製モデルの両方に利用できる。コウモリ細胞への感染を効率的に検証することで、ウイルスの感染性を検証し、コウモリ抗体を作製することで、効果的な免疫反応を引き起こす最適なタンパク質／ペプチドの検証を容易にする。

標的免疫増強（UNC）。循環しているSARSr-CoV QSに慢性的にさらされた野生のコウモリの標的化適応免疫（免疫記憶）を高めるために、上記の広範な免疫増強アゴニストの存在下でキメラS糖タンパク質を接種する。我々は系統的に離れた株（例えばUrbani、HKU3、BtCoV 279、〜25%の多様性）の中和ドメインをコードする新規なグループ2b SARSr-CoVキメラS糖タンパク質を開発した。このキメラSは、HKU3バックボーンの全長ゲノムに導入すると効率的に発現し、複数のグループ2b株に対する防御免疫を誘発する。SARSr-CoVキメラSの強固な発現系を試験管内試験での異所性発現を用いて開発する。我々は、組換えタンパク質とアジュバント（自然免疫アゴニスト）を封入した新規の微粒子送達システムとエアロゾル放出用乾燥粉末を開発したAinslie博士（UNC-Pharmacy）と協力し、並行して広範な免疫増強戦略±キメラ免疫原に使用する。同時に、Rocke博士と共同でアライグマポックスウイルス（RCN）にキメラと野生型のSを導入し、野外試験に先立ち、まず試験管内とDuke-NUSのコウモリコロニーで組換えタンパク質の発現を確認する。その目的は、高リスクの環境設定における曝露リスクを遠隔から軽減するための試薬一式を開発することである。キメラSARSr-CoVS免疫原： CoVは突然変異とRNAの組み換えによって急速に進化し、アミノ末端ドメイン（NTD）、RBD、S糖タンパク質のS2部分に中和エピトープをコードしている66,100,101。SARSr-CoVは自然界に広く分布していることから、キメラ免疫原はグループ2bの系統的サブグループにまたがって中和エピトープの幅を広げるように設計されるであろう48。合成ゲノムと構造誘導設計を用いて、HKU3のNTDとSARS-CoVのRBDを残りのBtCoV 279/04 S糖タンパク質分子と融合させ、キメラS糖タンパク質遺伝子をHKU3ゲノムのバックボーン（SARS-CoV、クレード2ウイルスとは25%異なる）に導入し、Vero細胞で複製可能な生存ウイルス（HKU3-Smix）を回収した。HKU3mixのS糖タンパク質遺伝子をVEEウイルスレプリコンベクター（VRP-SChimera）に挿入し、VRPワクチンが致死的SARS-CoVチャレンジとウイルス増殖から保護することを示した。VRP-SHKU3とVRP-S279はともにHKU3mixのチャレンジと生体内試験での増殖を防御し、HKU3mjX S糖タンパク質の中和エピトープが複数のSARSr-CoV株に対する広範な交差防御を提供することを示した。これらの免疫原をコウモリを対象とした広範なブースト戦略として使用するだけでなく、既知の高リスク株を対象とした、より集中的な免疫標的のためのキメラも作製する予定である。UNCのProtein Expression Core（httpsV/www.med.unc.edu/csb/pep）を利用して、コドン最適化、安定化、精製されたプレフュージョンSARS-CoV糖タンパク質エクトドメイン23を生産する。精製された組換えタンパク質は、広範な免疫アゴニスト（アジュバント、Duke-NUS）と共にデリバリーマトリックス（精製粉末、デキストランビーズ、ゲルなど、下記参照）に封入するために使用される。第2世代キメラS糖タンパク質免疫原の設計と試験：キメラSHC014 NTD/SARSCoV-RBD/HKU3 S C末端リコンビナントS免疫原（HKU3-SSoi4）を作製し、実験的およびモデル化分析から指定された既知の高リスク株と低リスク株に対して、より焦点を絞った免疫標的を設定する。組換えHKU3-SSoi4 S遺伝子は、アライグマポックスウイルスワクチンベクターに挿入するためにRocke博士に送られる。確立された技術を用いて、我々はS発現の特徴を明らかにし、デューク・ニューヨーク大学での免疫増強試験のためにWang教授にウイルスベクターを提供する。ヒトのコドンに最適化されたHKU3-SSoi4およびHKU3-Smix組換えキメラスパイクプロテインは、UNCプロテオミクスコアで発現・精製され、エインズリー博士と共同でナノ粒子およびマイクロ粒子キャリアーに含めるためのmg量を生産する。WIV-SSoi4とHKU3-Smix糖タンパク質の発現はウェスタンブロットとマウスへのワクチン接種によって検証され、組換えタンパク質が致死的なSARS-CoVとSHC014のチャレンジから防御する中和抗体を誘発するかどうかを決定することができる。マウスとコウモリを用いた生体内試験に十分な量の材料を生産する。組換えウイルス糖タンパク質の発現をウェスタンブロットとマウスへのワクチン接種によって検証し、組換えタンパク質が致死的なSARS-CoV、HKU3-Smix、SHC014のチャレンジから防御する中和抗体を誘発するかどうかを決定する。SARSr-CoV集団の遺伝的構造において、複合型S糖タンパク質遺伝子RNA組換え体の証拠がないか、RNAseqデータを調査する。もし存在すれば、2-3個の有効な組換えS遺伝子を合成し、これらの遺伝子をSHCO14またはHKU3ゲノムのバックボーンとVRPに挿入し、細胞培養とマウスでの生存率と複製特性を評価する。免疫原を作製し、感染防御能を評価する。

アジュバントと免疫原デリバリー・ビークル Ainslie博士（UNC）は、ワクチン応用における抗原とアジュバントのデリバリーのために、生分解性ポリマーアセタール化デキストラン（Ac-DEX）を開発した。Ac-DEXはワクチン開発において他のポリマーより優れている。それは、水溶性から不溶性へ移行するFDA認可のワンステップ法を用いて容易に合成でき、スケーラブルである102-104;

マイクロパーティクル（MP）は小さい（5-8pm）ので、DCに貪食され、リンパ節に輸送され、効率的に分子を送達することができる105;MPはpH中性で、安全106、コールドチェーン外で安定である107 *、エアロゾル化したり、スプレーやゲルで送達することができる102,108;そして我々は以前、カプセル化したポリ（l： C）（l）、レジキモド105、STINGアゴニストを当グループの新規MPに封入し109、TLRアゴニストの活性を有意に高めるという概念実証を行った。我々は、STING環状[G(3′,5′)pA(3′,5′)p]111をカプセル化したHAを用いて、フェレットのインフルエンザモデルにおいて、最新のFDA承認不活化インフルエンザウイルス(Fluarix)よりも優れた効果を示した110。アゴニスト入り粒子は、別々に、あるいは組換えSARS-CoVキメラスパイクプロテインと組み合わせて作られ、我々の空気力学的MPやナノ粒子に封入される。Eonycteris属（Duke-NUS）とRhinolophus属（Wuhan Inst. Virol.）のコウモリにおけるウイルス感染モデル：上記の免疫調節アプローチの有効性を試験・比較するために、この種に感染するマラッカウイルス（レオウイルス科）に感染した洞窟ナガコウモリ（Eonycteris spelaea）の繁殖コロニーを用いる112413。

まず、3個体から翅の生検を行い、ACE2受容体遺伝子の塩基配列を決定する。これをヒト細胞株に挿入し、ウイルス株との結合を事前にスクリーニングする。結合したものを生体内試験に使用する。ABSL3では2種類のコロナウイルス（SARSr-CoV W1V1とMERS-CoV）を使用する。SARSとMERSの感染研究は、EonycterisとPteropusの細胞株と初代免疫細胞を用いてすでに進行中である。E. spelaeaのコロニーは感染実験が可能な個体数に達し、ABSL3施設にはコウモリ専用のケージが設置された。マラッカウイルスとMERSによるEonycterisコウモリの試験的生体内試験感染は、2018年7月までに完了する予定である。以前の感染研究は、CSIRO、AAHLのL-F WangによってオーストラリアのPteropusとRhinolophusコウモリで完了し、現在オーストラリアのクイーンズランド大学を通じてPteropusの追加感染試験が計画されている。W1Vでは、20頭の野生のRhinolophus属の成コウモリ（男女各10頭）を試験洞窟で捕獲し、ABSL3内に収容してACE.2レセプター遺伝子の塩基配列を決定し、上記のようにスパイクの事前スクリーニングに使用する。すべての実験において、ウイルス量はqPCR、産生されたウイルスの滴定、NGSトランスクリプトミクス、イムノプロファイリングパネルに追加されたウイルス特異的ナノストリングプローブによって測定される。抗体応答は、前述したようにUPSアッセイで測定する。リガンドの生体内直接投与に加え、UNC、NWHC、PARCと共同で、洞窟のような環境に適したエアロゾル化および液相展開法もテストする。このアプローチにより、フィールドベースの評価に拡大する前に、安全で制御された環境で、免疫増強戦略をテストすることができる。内部標準化と少量のサンプル材料（全血飛沫からのナノストリング分析を含む）に重点を置いた、£spelaeaコロニーで使用された実験プロトコルと分析方法は、WIVとTA2の試験洞窟トレイルで、野生で捕獲されたRhinolophus属のコウモリの実験的感染を分析するために再現される。

デリバリーシステムの開発（NWHC）。我々はこれまでに、プレーリードッグのペストワクチン30、コウモリの狂犬病ワクチン31、白鼻症候群の戦略（未発表データ）114など、放し飼いにされた野生動物の疾病を管理するための経口ワクチンと送達方法を開発し、安全性と有効性を試験して登録した。以前にコウモリの狂犬病ワクチンで示したように、我々は免疫調整剤や組換えSARSr-CoVスパイクプロテインをライノロフスのコウモリに投与するために、コウモリ同士がグルーミングする粘着性の食用ゲルを試験する予定である。ポックスウイルスは野生動物にワクチンを投与するための効果的なウイルスベクターである3o,ii5,ii6^。我々は、生体内試験バイオフォトニックイメージングを用いて、改変ワクシニア・アンカラ（MVA）とアライグマ・ポックスウイルス（RCN）ベクターによるコウモリでの概念実証と安全性を実証した31。RCNは経口経路でもMVAより高いレベルでコウモリに複製され、安全であることがわかった。われわれはアライグマポックスウイルスをベクターとする新規狂犬病糖タンパク質（モザイクまたはMoG）を使用し、経鼻投与および局所投与によりコウモリに予防効果を示した31（図11）。

図11：モザイクGタンパク質（RCN-MoG）を発現するアライグマポックスウイルスを経鼻（ON）または局所投与したEpstesicus fuscusの狂犬病チャレンジにおけるワクチンの有効性と、典型的なGタンパク質またはルシフェラーゼを発現するRCN（陰性対照）との比較。

ポックスウイルスは様々な野生動物や家畜に安全であり、外来DNAの大量挿入が可能である。我々は以前、ペスト抗原を発現するアライグマポックスウイルスベクターワクチンを用いて、プレーリードッグのYersinia pestisによるペストを管理したことがある。私たちはローダミンB（RB）というバイオマーカーをベイト剤に組み込み、標的種と非標的種による取り込みを評価した114417（図12）。RBは毛が伸びるまで（プレーリードッグでは約50日間）、紫外線顕微鏡で見ることができる。その後、我々は大規模な野外試験を実施し、西部7州の4種のプレーリードッグでワクチンの有効性を実証した。

図12：ローダミンBを含むベイト剤の取り込みを調べるため、プレーリードッグの毛とひげのサンプルを蛍光顕微鏡で観察。

経皮投与：生きた薬剤の使用を避ける戦略を試すため、経皮投与効率を高めるナノ粒子を使用する118。マウスへのTLRアゴニストと抗原の同時デリバリーで示されているように120、樹状細胞の取り込みを介したコウモリへのワクチンの経皮デリバリー法119として、ポリ乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）を用いて免疫調整剤をカプセル化する。この方法は、SARS-CoVスパイクプロテイン24に対するマウスの免疫反応を増強するアジュバント121の有無にかかわらず、ac-DEXに対して競合的に試験される予定である。最初の臨床試験は、米国で、我々が以前に何度か実験用に飼育・管理している、現地で入手した食虫性のオオコウモリ（Eptesicus fuscus）を用いて実施される予定である31,32。バイオマーカーであるローダミンB（RB）を含む様々な試験製剤を局所塗布してコウモリを治療し、未治療のコウモリと同居させ、バイオマーカー分析のために毛やひげを採取してコウモリ間の移行をモニターする。初期の実地試験：コウモリのコロニー内では毛づくろいの割合が高いため、コロニー間での効果的な製品移動が可能である。ペルーでのバイオマーカー試験では、RB標識グリセリンゼリーにより、標識コウモリ1頭に対して1.3～2.8頭の割合で移動が認められた。われわれは、それぞれのデリバリー・ビークルを用いて、地元のアメリカ食虫植物コウモリの自然環境で初期試験を行う予定である。様々な用量を投与してから1週間以内に、ミストネットまたはハープトラップを使ってコウモリを洞窟の入り口に捕獲し、毛を採取してバイオマーカー分析による取り込み率を評価し、その後放す。大量投与に最適なアプローチを決定した後、野生の飼育下サイコウモリ（WIV）でテストし、次に雲南省の3つの洞窟でテストする。バイオマーカーを使用して取り込み率（および非標的種の汚染）を評価し、これらのデータを免疫調節剤の最適な散布率を決定するためのモデリング研究に使用する。革新的なエアロゾル・アプローチによるコウモリへの接種：実験室での研究で取り込みが確認されたら、免疫調節物質を含まないバイオマーカー標識培地を用いて、地元の洞窟や冬眠地でスケーラブルな投与方法を評価する。パロアルト研究所（PARC）のジェローム・ウニダッド博士と共同で、PARC独自の革新的なエアロゾルプラットフォーム技術を使い、洞窟環境で使用できるフィールド展開可能なプロトタイプを設計する。Filament Extension Atomization (FEA)122テクノロジーは、5～500ミクロンのサイズに調整可能な狭小分散飛沫をもたらすロール・ツー・ロリー・ミスト・プロセス（https://www.parc.com/services/focus-area/amds/）を用いて、ImPa・s（唾液やほとんどの水性ワクチン製剤の粘度）から600Pa・s（局所投与用のクリームやジェルの粘度）までの幅広い粘度の液体を噴霧することができる。FEA技術は、従来の噴霧を目的とした水性製剤や、局所デリバリー用の食用ゲルやクリームなど、DEFUSEプロジェクトが関心を寄せているすべての製剤と互換性があり、生理活性成分の負荷に制限はない。FEAは、生物学的有効性を考慮した処方で、コウモリに直接噴霧するための普遍的な送達プラットフォームになりうる。洞窟をベースとした噴霧システムのプロトタイプの潜在的なフォームファクターを図13に示す。

DEFUSEプロジェクトのためのフィールド展開可能なプロトタイプの可能性（ベンチトップ型、ハンドヘルド型）。

図13：PARCのFEA

技術-A. 粘弾性流体中のビーズオンアストリング構造123、B.FEAローラーシステムにおけるフィラメント形成と飛沫分割の並列化、C.-E. FEAで噴霧された代表的な流体の高速ビデオからの画像、F.

PARCとNWHCは、米国の洞窟コウモリで初期プロトタイプ試験を実施する。PARCはその後、中国雲南省昆明のコウモリ洞窟のテストサイトで概念実証のデモンストレーションに使用する形にプロトタイプを開発する。フィールドに展開可能なシステムは、非標的種（洞窟内のツバメなど）を避けるため、コウモリが飛来・離脱するタイミングを狙うよう、モーション・アクチュエーションで、かつタイマーで作動させる予定である。

展開戦略を最適化するための動的循環モデリング。免疫増強、および複数の投与オプションとスケジュールを選択するため、洞窟コウモリの個体群におけるウイルス循環のモデルを用いて展開シミュレーションを行う。このモデルは、我々の3つの洞窟試験システムから得られたデータに適合させるが、ロバストで他のケースにも一般化できるように設計されている。さまざまな展開シナリオで結果をシミュレートし、現実の条件下での最適な適用について保守的な推定を行う。縦断的サンプリングデータに確率的ウイルス循環モデルを当てはめる： \フィールドサンプリングで収集した縦断的なウイルス有病率、標識再捕データ、テレメトリーデータ、赤外線カメラデータを用いて、テスト洞窟におけるコウモリの個体群動態とウイルス循環のモデルをパラメータ化し、構築する。

図14：バングラデシュのコウモリコロニーにおけるウイルスの縦断的サンプリングからモデル化したウイルスの季節的循環。

oci Jw. Apf 既存のモデルを修正する。

バングラデシュでの縦断的研究に基づき、マルチウイルスシステム用に開発された時間的ダイナミクスを抽出する既存のモデルを修正する124（図14）。移民と移住、そしてコウモリ間の柔軟で非線形な接触率を持つ、単純だが頑健な確率的SIR過程モデル125を用い、断続的なウイルス発生から定期的な風土病循環まで、幅広いウイルス動態を比較的少数のパラメータで捉える。私たちは、部分観測可能マルコフ過程（pomp）126の枠組みを用いて、これらのモデルをサンプリングデータに当てはめ、ウイルス循環の自然確率性とサンプリングの観測誤差を考慮・分離した、潜在的な動的疾病伝播過程の推定を可能にする。時間的交差検証を行い、2つの洞窟のデータを3つ目の洞窟のデータに当てはめた結果を検証することで、モデルの妥当性を確認する。一連のもっともらしい展開シナリオの下での循環をシミュレートする。飼育下試験で得られた免疫増強分子の中で最も成績の良いセットと、洞窟研究で得られた最も効果的な送達媒体と送達方法を用いて、確率的SIRモデルを用いて、試験洞窟における一連の展開シナリオにおけるウイルス循環のシミュレーションを行う。これらのシナリオは、もっともらしい強さ、頻度、抑制戦略の組み合わせの範囲をカバーし、各治療戦略の有効性の不確実性を組み込む。これらのシミュレーションから、ウイルスの循環とシェディングが抑制される程度と期間を予測し、研究対象洞窟での展開に最適なシナリオを決定する。より広範な条件下での展開戦略の頑健性を検証する：大まかな観察に基づく不確かな推定値、異なる環境条件による治療の取り込みと効果のばらつき、限られた時間と資源の中で、展開が非常に多様な種の個体数と組成の下で行われる可能性が高いと予想される。我々は、多くの可能性のある条件下で展開シミュレーションを行い、それぞれの条件下での最適な展開と、不確実性や限界に対して保守的で頑健な戦略を決定する。

中国雲南省の試験洞窟で、免疫調節分子の概念実証を行う。中国雲南省の3つの試験洞窟に、最も成功した免疫調節分子を配備する。LiDARマッピングと赤外線ビデオ監視によって、各洞窟の主な出入り口と、コウモリが飛び出す際に使用する通行パターンを特定し、主な開口部の上部（10時と2時の位置、下向き）に2つのPARCスプレーノズルを配置する。洞窟の開口部の大きさに応じて、ノズルを伸縮可能なブームに取り付け、洞窟の口の上部に配置する。スプレーはコウモリの動きによって作動させ、飛び出しや飛び込みの際に連続的に、または時間をずらして噴霧し、コウモリが飛び抜ける水性のカーテンを作る。確率的ウイルス循環モデルとリアルタイムの個体数データを用いて、最適な散布期間を決定する。予備データから、グルーミング活動によるグリセリンゲルの移動率を2.0と仮定する。初期の試験では、RBを用いてカバレッジを評価する。その後、テストケーブで免疫調節生物学的製剤とバイオマーカーを散布し、他の2つの対照ケーブではバイオマーカーのみを散布する。展開前の4カ月間のサンプリングに続き、展開翌日から4カ月間の展開後サーベイランス（サンプリング戦略参照）を実施し、1）治療に対する個々のコウモリの免疫反応の性質と期間、2）個体群レベルのSARSrに対する免疫反応を評価する。

2）糞便ペレットスクリーニングに基づく、テスト洞窟と対照洞窟における個体群レベルのSARSr-CoVウイルス排出率。また、バイオマーカーのスクリーニングも行い、達成されたカバレッジを評価する。このアプローチは、コウモリのねぐらの接続性（再捕獲とテレメトリーデータに基づく地域の洞窟間の混合パターン）をモデル化するために我々のアプリを使用し、最も接続性の高い洞窟を特定することで、コウモリが生物学的処理を他の洞窟に移し、より広いエリアでのウイルス排出を抑制できるようにすることで、より大きなコウモリのねぐらのネットワークに対してスケールアップすることができる。

セクション1.03 管理計画

プロジェクトTDophEAFlienUSE leina;, D機関はニューヨークのEcoHealth Allianceで、新興の人獣共通感染症に焦点を当てた国際的な研究組織である。研究代表者であるダスザック博士は、新興人獣共通感染症に関するラボ、フィールド、モデリング研究プロジェクトの管理において 25年以上の経験を有する。Daszak博士は毎年2カ月間（1カ月はDEFUSEから、1カ月はEHAのコア資金から）、TAIでのモデリングとフィールドワークを中心に、すべてのプロジェクト活動を監督・調整する。Karesh博士は、人獣共通感染症および野生生物疾患プロジェクトを40年以上主導してきた経験を持ち、パートナーシップ活動とアウトリーチの管理に毎年1カ月を費やす。エプスタイン博士は、コウモリの人獣共通感染症に関する20年の経験を持ち、パートナー間の動物実験を調整する。オリヴァル博士とロス博士はこのプロジェクトのモデル化アプローチを管理する。サポートスタッフには、中国雲南省の現地調査チーム、モデリング・アナリスト、開発者、データ管理者、現地コンサルタントが含まれる。EHAチームは他の共同研究者とも幅広く協力している： Wang教授（15年以上）、Shi博士（15年以上）、Baric教授（5年以上）、Rocke博士（15年以上）である。下請け契約： #SARSr-CoVのリバースエンジニアリング、BSL-3ヒト化マウス実験感染、標的免疫増強治療の設計と試験を監督する、には、PCR試験、中国で収集したコウモリのサンプルからのウイルス発見と分離、スパイクプロテイン結合アッセイ、ヒト化マウスの研究、およびRhlnolophusコウモリの実験的試験を実施する。Rocke博士はNWHCのコウモリの捕獲コロニーを初期試験に使用し、米国と中国の洞窟実験を監督する。#革新的なエアロサープラットフォームを、コウモリへの大規模な接種のための現場展開可能な装置に開発する。ウニダッド博士はロック博士と緊密に協力し、初回トレイルと中国での洞窟実験の両方で使用する野外配備可能なプロトタイプを開発する。

共同研究者の調整：すべての主要関係者は、定期的に予定されるウェブ会議と電話会議に参加し、さらに個人や研究者グループ間で頻繁に電子メールや電話でのやりとりを行う。定期的な会議には以下が含まれる：

治験責任医師とプログラム・マネージャー間の週1回のミーティング（プロジェクトとタスクの状況について）
プログラムマネージャーとサブアワディの管理者、スタッフとの間の週1回のウェブ／電話会議。

> EHA 担当者とすべての被補助研究者との間で毎月ウェブ／電話会議を行う。

主要担当者間の月1回のウェブ会議（研究発表／調整）
年に4回、EHAの主要担当者が直接パートナーに会うミーティングを行い、年に2回、被補助者同士が直接パートナーに会うミーティングを行う。

すべての主要担当者による年1回の直接ミーティング

評価指標には、質の高いデータの作成、マイルストーンとスケジュールの成功裏の達成、科学的交流と協力、質の高い出版物の作成、効果的な予算管理が含まれる。

データの管理と共有：エコヘルス・アライアンスは、すべてのプロジェクトの現場、研究室、モデル化作業を通じて収集・生成されたデータの中央データベースを維持する。このデータベースは安全なクラウド・ホスティング・サービスを使用し、アーカイブやプラットフォームに依存しないフォーマットへのエクスポートを可能にする。このデータベースは、プロジェクト構成要素間のデータとメタデータの互換性を確保し、データのバージョン管理と注釈を追跡し、DARPAのデータ要求と開示要件に準拠できるようにする。アーカイブされたヒトサンプルデータはすべて非識別化される。パートナーは、プロジェクトの期間中、中央データベースに生データおよび処理済みデータを提供する。プロジェクト・パートナーは、常にデータベース内で生成したデータにアクセスすることができ、ローカル・コピーの管理を維持する。データベースからのデータのDARPA以外の外部関係者への公開、または一般への公開や出版は、すべてのプロジェクト・パートナーとの協議後にのみ行われる。EHAは、複数パートナーによるパートナー・プロジェクト（PREDICT、USAID IDEEAL、Global Rariavirus Reporting System）のデータ管理において豊富な経験を有する、

問題の特定と解決定期的な計画、モニタリング、評価会議が、問題発見のための主要な仕組みとなる。軽微な問題（サンプル入手や検査結果の遅れなど）については、Daszak博士とプロジェクト・マネージャーが監視し、適切な対応と解決を通じて、内部で対処する。長期にわたる生産性の低下、不十分な科学的協力、または研究の方向性や資源配分に関する重大な紛争など、重大な問題が発生した場合、EHAは交渉を通じて問題解決を支援する。解決に至らない場合は、当グループの技術アドバイザーや DARPA プログラムスタッフとの協議が必要となる場合がある。

リスク管理：タイムラインを維持し、マイルストーンを達成するためには、すべてのプロジェクト段階を厳密かつ継続的に監視し、頻繁かつ定期的にコミュニケーションを行い、意思決定を行い戦略を実行する能力が必要となる。このような性質のプロジェクトでは、研究者が徐々に実験システムを最適化したり、データを改良したり、分析アプローチを進める前に追加データを待つなど、漸進的なペースで進む基礎研究活動とは異なる考え方が必要となる。タイムラインを維持するために、我々はこれらのトレードオフを継続的に評価し、反復がいつ適切か、いつ現在の情報を使って前進する必要があるかを決定する。

経歴

ピーター・ダスザック博士はエコヘルス・アライアンスの社長兼チーフ・サイエンティストであり、微生物の脅威に関するNASEMフォーラムの議長、執行委員会のメンバー、1億3000万ドルのUSAID-EPT-PRED1CTのEHA機関主導者である。彼の300を超える科学論文には、EIDホットスポットの初の世界地図49-127、未知のウイルス多様性の推定50、ウイルス-宿主関係の予測モデル7、SARS-CoV2やその他の新興ウイルスのコウモリ起源の証拠128431などがある。

ラルフ・バリック教授は、UNCチャペルヒル大学疫学部および微生物学・免疫学部の教授である。彼の研究は、RNAウイルスの転写、複製、持続性、異種間伝播、病原性を研究するモデルとしてのコロナウイルスに焦点を当てている。彼のグループは、人獣共通感染症ウイルスの異種間伝播に関連する潜在的な「プレエピデミック」リスクを評価し、対策を評価するためのプラットフォーム戦略を開発した1^12,2^57,64。

ウンファ・ワン教授はデューク大学・ニューサウスウェールズ大学医学部の新興感染症プログラム・ディレクターである。SARS-CoV、5ADS〜CoV、ヘニパウイルスなどの新興コウモリウイルス2,14,60,80,124や、コウモリの免疫学、飛翔、ウイルス耐性に関連する遺伝学的研究に注力している15,16,75,93。2014年にユリイカ賞（感染症研究部門）を受賞し、現在はSingapore Nat. 現在、Singapore Nat. Foundation grant “Learning from bats”（970万SGD）を率いている。

石正麗教授は中国科学院武漢ウイルス研究所新興感染症センターの所長であり、BSL3およびBSL4の責任者でもある。彼女の研究は、ウイルス病原体発見のための伝統的およびハイスループットシークエンス技術に焦点を当てている。2004年以来、コウモリが媒介するウイルスを研究し、SARSPCoVグループの発見を主導している2,3,34,67。Tonie Rocke博士はUSGS National Wildlife Health Centerの研究科学者である。野生哺乳類の疾病（ペスト、サル痘、狂犬病、白鼻症候群など）の生態学と管理に重点を置いて研究を行っている。米国西部における野生のプレーヤードッグへのペストワクチン経口接種の大規模野外試験を主導している。

ジェローム・ウニダッド博士は、PARCのハードウェア・システム研究所の研究スタッフである、

高粘度流体、ポリマー、生体高分子のエアロゾル送達を含む、新しい流体送達システムの研究に注力している。コンシューマー向け、バイオメディカル向け、付加製造向けのFEAスプレー技術開発の技術リーダーを務める。

セクション 11 ‘< キャパビフルエコヘルス・アライアンス（EHA）は、アジア、アフリカ、南米など20カ国以上で新興人獣共通感染症を研究する国際的な非営利団体である。EHAは、新興疾病の起源と促進要因、新興ウイルスのコウモリ起源、SARSr-CoVs、ヘニパウイルス、その他の有名な新興病原体の動態に関するモデリングと分析のパイオニアであり、USAID-EPT-PREDICTプログラムの主要なコンソーシアム・パートナーである。ノースカロライナ大学医学部（UNC）、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のバリック研究所は、基本的なウイルス学、免疫学、分子生物学を行うためのバイオセーフティーレベル2の施設であり、提案された研究のためにマウスを繁殖させるための大学スペースでもある。Baric BSL-3実験室は認可されており、キメラウイルスの回収と特性解析、コウモリコロナウイルスを調査するための換気げっ歯類ケージのすべてを行うのに必要な設備を備えている。国立野生生物センター（NWHC）には、専門の研究室とサポートエリア、スタッフオフィス、BSL-3生物封じ込め動物研究エリアがある。研究棟にある設備の整った2つの研究室は、提案された研究に常時利用可能である。NWHCのBSL-3生物学的封じ込め動物研究エリアは、病理学的焼却、蒸気滅菌装置、紫外線照射室を備えており、生物学的封じ込めエリアから出る前にすべての物質を処理することができ、陰圧に保たれている。訓練を受けた動物看護スタッフと獣医師が、動物の世話、監視、取り扱いにあたる。NWHCは動物の医療処置のための設備が完備されている。パロアルト研究センター（PARC）は、物理学、材料科学、化学、生物学、工学、コンピュータ科学、制御学、民族学の分野から140人以上の専門フルタイム研究者で構成されている。施設は、噴霧実験や流体力学測定を行うための2つの汎用ラボ、細胞培養ラボ、化学ラボ、レーザーパターニングと3Dプリンティング施設、専門スタッフが常駐するモデルショップ、電子機器ラボで構成されている。武漢ウイルス学研究所：BSL2、BSL-3,05L-4実験室、動物飼育室、その他の支援施設を含む。バイオセーフティ研究室はCoV研究、サンプルテスト、シークエンシング、結合アッセイ、試験管内試験.およびin v/vo作業を行う。デュークNUSメディカルスクール;シンガポール：デュークNUS動物BSL-3施設はシンガポール北部のSingHealth Animal Husbandry and Hospitalと併設されている。この施設は感染症研究を安全に実施するための最新鋭のモジュラー実験室である。動物BSL-3ラボは、ウイルス学、基礎免疫学、分子生物学的能力を備え、げっ歯類、非ヒト霊長類、コウモリを含むケージ動物を取り扱うための設備が整っている。知的財産権： PARCは以下の非商用品目について制限を主張する：スプレー装置内でひずみ硬化粘弾性流体の飛沫を効率的に収集する方法、Project DEFUSEに向けた装置開発に使用する。PARCはこの技術を私費で独占的に開発し、USGはこの装置に関連する技術データについて限定的な権利を有すると主張する。PARCは、移行を支援するための関連する背景知的財産について、政府または技術移行パートナーと誠意をもって交渉する意思がある。商業所有権に関する制限はない。関連研究 Daszak, PI on subcontract, USAID-EPT1&2, PREDICT: Consortium partner lead. 役員。理事会メンバー、2つの5年契約（7,500万ドル、1億3,800万ドル）のモデリングと分析を担当し、World25カ国以上で野生生物の新種ウイルスのサーベイランス、能力構築、行動リスク評価、データベース管理を行う。EHAの下請け契約は3,500万ドルを超える。>1,000を超えるウイルスが発見され、10,000のサンプルが収集された。Science誌、Nature誌、Lancet誌に論文が掲載される。

ダザック、主任研究者、NIAID：バットコロナウイルス出現のリスクを理解する：中国における新型SARSr-CoVの波及リスクを研究するための5年間の助成金。280万ドル、副賞5件。Science誌、Nature誌、PNAS誌に発表。

ダザック、USAID、チーフ・オブ・パーティー：感染症の出現と変化した景観の経済学：マレーシアにおける土地利用の変化と疾病発生の経済学を分析する250万ドルの3年契約で白金賞を受賞。

セクションH 作業の概要フェーズ1

PI-TA-Ol 課題 1：実験的研究とモデリング（EHA）のためのデータを得るため、中国南部のフィールドでコウモリの縦断的サンプリングと生態学的データ収集を実施する。

小課題1.1 コウモリのサンプル採集とフィールド介入パイロット（EHA）のために、中国でIACUCとACUROの承認と適切な許可を申請し、取得する。サブタスク1.2 SARSrCoVのスクリーニングと塩基配列決定のため、中国雲南省の洞窟でコウモリから毎月検体を採取する。ライブキャプチャーと非侵襲的サンプリングにより、毎月360頭のRhinolophus属のコウモリから口腔、糞便、血液サンプルを採取する。検体は分析用に研究室に送られた。個々のコウモリの形態学的、人口統計学的、生理学的データを収集する（EHA、コンサルタントのZhu）。サブタスク1.3 コウモリの連結性とねぐらの忠実度を評価するためのPITタグ付け。サンプリングしたすべてのコウモリにPITタグを付ける。各洞窟の入り口に無線周波数識別データロガーを設置し、遠隔捕獲-再捕獲モニタリングを行う。(EHA、コンサルタントZhu）。サブタスク1,4 コウモリの生息域の広さと連結性を評価するための衛星テレメトリー。36頭のRhinolophus sp.コウモリにIg ICARUS衛星タグを付ける。(EHA、コンサルタントのZhu）。サブタスク1,5 コウモリ個体群のリアルタイムモニタリング。LiDARによる洞窟調査を実施し、個体数モニタリングのために、ねぐらの入り口に遠隔赤外線サーモグラフィを設置する。

画像認識のアルゴリズムを最適化する。(EHA、コンサルタントZhu）。サブタスク1.6 プロジェクト全体のデータベースを開発・維持する。安全なクラウドホスティングデータベースに、フィールド、ラボ、実験作業から収集・生成されたすべてのデータを保存する。

マイルストーン 1.2 コウモリ標本と関連宿主データの毎月の収集完了、13台のデータロガーと1.5台の赤外線カメラの設置、1.4 コウモリ発信機の起動とデータ収集の成功、1.6 データベースの構築とテスト、1.6 フィールドデータのデータベースへの毎月の入力。

成果物リアルタイム・テレメトリーおよび標識再捕データをアップロードし、DARPAの共同研究者が利用できるようにする。

PI-TA-Olタスク2：コウモリ種の分布とウイルス流出リスクの最も高い場所を予測するモデルを構築する（EH A） , サブタスク2.1 南北アジアと東南アジア全域の洞窟におけるコウモリ群集を予測し、ウイルス流出リスクの高い地理的ホットスポットを特定するための共同種分布モデルを構築する（EHA）。サブタスク2,2 宿主および生態学的形質を用いた機械学習モデルにより、コウモリにおける人獣共通感染症の可能性のあるウイルスの存在を予測する（EHA）サブタスク2.3 ノンパラメトリックなウイルス豊富度推定量により、まだサンプルされていないウイルスの多様性を予測する。サブタスク2.4 戦闘員のための「空間的ウイルス流出リスク」アプリのプロトタイプを開発する（EHA）。

マイルストーン：2.1 アジアコウモリの共同種分布モデルの適合、コウモリ群集構成とウイルス多様性の洞窟レベルの予測、2.2と 2.3 コウモリ属ごとのウイルス多様性とジャンプ可能性の予測、2.1～2.3の予測検証、2.4 テスト用プロトタイプアプリの作成、プロトタイプアプリのフィールドテスト成功。

成果物コウモリ群集の構成と、種ごとのウイルス多様性および人獣共通感染症の可能性の展開可能なモデル。完全な機能を備えたユーザーフレンドリーなアプリケーションの開発。

PI-TA-01 タスク3：コウモリのサンプルからのSARSr-CoV QS0のスクリーニング、特性評価、分離（WIV）サブタスク3. 小課題3.2 PCR陽性検体からSARSr-CoVスパイクプロテインの遺伝子配列を決定する（WIV）。小課題3.3 新規SARSr-CoVのスパイクプロテインを持つ組み換えウイルスを開発し、回収する（Duke-NUS）。サブタスク3.4 ディープシーケンスデータに基づき、低存在量で高リスクのSARSr-CoVの存在を特定する（UNC）。

マイルストーン CoVの有病率と遺伝的多様性の定量化： PCR陽性検体のライブラリー。スパイクプロテインの全塩基配列決定。タスク4で使用する組換えウイルスの作成。高リスクSARSr-CoV QSの可能性リスト。

PI-TA-01 課題4：SARSr-CoV QSのジャンプ可能性の実験的アッセイ（UNC）

サブタスク4.1 構造タンパク質モデリング、変異同定、偽ウイルスアッセイによる事前スクリーニングを実施する。(UNC）。サブタスク4.2 宿主細胞株に対するキメラウイルスの試験管内試験を実施する(UNC)。サブタスク4.3 hACE2トランスジェニックマウスを用いた生体内試験での病原性を評価する（UNC）。

サブタスク4.4 キメラウイルスの結果をフルゲノムQSで検証する（UNC）。サブタスク4.5 RBD欠失、S2タンパク質分解切断およびグリコシル化部位、N-結合型グリコシル化など、ウイルスのスパイクプロテインに対する合成修飾を試験する（UNC）。サブタスク4,6低存在量、高結果の微小変異がジャンプポテンシャルに及ぼす影響を調べる。(UNC)

マイルストーンマイルストーン：各サブタスクの開始と完了。

成果物人獣共通感染症の可能性がある高リスクのSARSr-CoV QSのリスト。動物実験用の候補SARSr-CoV。データの提供。

PI-TA-01 タスク 5：高リスク SARSr-CoV 株の遺伝子型-表現型間の伝播可能性を予測するベイジアンネットワークモデルの構築とテスト。(EHA）。

小課題5.1 特性解析のためのQS選択の指針となる事前データを用いた予測を行う(EHA)。サブタスク5.2 ウイルス試験管内試験および生体内試験から得られたリアルタイムのデータに基づいて、モデル予測を更新する（EHA）。

マイルストーンマイルストーン：事前データを用いた予備的モデルの完成、プロジェクトで得られたリアルタイムデータを用いたモデルのテストと改良。

成果物高リスク SARSr-CoV 株の伝播リスクに関する機能的ベイズ予測モデルのソースコードとモデル出力。

PI-TA-01タスク6：過去に収集されたヒトサンプルおよびサーベイランスデータ（EHA、WIV、Duke-NUS）から得られたSARSr-CoV血清学的検査を用いて、モデル予測値を検証する。

サブタスク6.1 ルシフェラーゼ免疫沈降システム（LIPS）アッセイを設計し、我々が特徴付けたハイジャンプおよびロージャンプリスクのSARSr-CoV QS0を解析する（WIV）。サブタスク6.2 組換えタンパク質または弱毒ウイルスをウサギに接種して、LIPSアッセイの特異性を決定する（WIV）。サブタスク6.3 陽性血清サンプル、スパイクプロテインベースのLIPS、ウイルス中和を用いたUPSアッセイを検証する。(WIV）。サブタスク6.4 SARSr-CoVのQSスピルオーバーを評価するために、雲南省から過去に採取したヒト血清を試験する（WIV）。サブタスク6.5 QS0ジャンプの可能性に関するBNM予測の妥当性を検証し、コウモリとヒトの接触データを用いて実際のスピルオーバー確率を特定する（EHA）。

マイルストーン LIPSアッセイの開発と検証、血清のスクリーニング、ベイズモデルの検証：特定の SARSr-CoV QSに対する新しい。LIPS 血清検査法、スピルオーバー証拠に基づく検証モデルのソースコード、

PI-TA-02 タスク 7：コウモリ化マウスと飼育コウモリのコロニーを用いた「広範な免疫増強1」の実験的検証（Duke-NUS)

小課題7.1 コウモリ特異的IFNネガティブレギュレーターをブロックすることで、コウモリのインターフェロン（IFN）をブーストする（Duke-NUS）。サブタスク7.2 DNA-STING依存性およびTLR-依存性経路を含む、減衰したコウモリ特有の自然免疫経路を活性化する（Duke-NUS）。サブタスク7.3 コウモリとマウスのモデルにおいて、広範な免疫増強の検証を行う（Duke-NUS）。サブタスク7,4 飼育下のEonycteris sp.コロニーにおいて、マラカウイルスおよびSARSr-CoV感染を用いた免疫調節を試験する。(Duke-NUS）。

サブタスク7.5 野生で捕獲されたRhinolophus属における標的免疫増強の試験 (WIV)

マイルストーンマイルストーン：各サブタスクの開始と完了。

成果物実験データ;免疫刺激物質の全動物プロファイリングと関連する反応速度論。その後のウイルスチャレンジ試験で使用する一次リガンド1種と二次リガンド2種の選択。広範な免疫増強のための動物モデルの実証。

PI-TA-02 タスク8：ヒト化マウスと実験コウモリコロニーを用いた「標的免疫増強」の実験的試験（UNC, NWHC, Duke-NUS, WIV)

サブタスク8.1 キメラSARSr-CoV S免疫原を開発する（UNC）サブタスク8.2 第2世代キメラS糖タンパク質免疫原を設計し、ヒト化マウスで試験する（UNC）。サブタスク8.3 アライグマポックスウイルスを用いた標的免疫増強法を開発し、Duke-NUSで飼育コウモリを用いた試験を行う(NWHC)。小課題8.4 飼育下のEonycteris sp.コロニーで、マラカウイルスとSARSr-CoV感染を用いた標的化免疫増強法をテストする。サブタスク8.5 野生で捕獲されたRhinolophus属における標的免疫増強の試験 (WIV)

マイルストーンマイルストーン：各サブタスクの開始と完了。

成果物キメラ SARSr-CoV S 免疫原とポックスウイルスベクター免疫増強分子が使用可能になる。ヒト化マウスと飼育コウモリを用いた標的免疫増強法の概念実証。

PI-TA-02 課題9：免疫増強分子の経皮投与法の開発と評価（UNC, Duke-NUS, NWHC）

サブタスク9.1 候補の広範な免疫増強分子と標的免疫増強分子を含む高分子アセタール化デキストラン(Ac-DEX)微粒子(MP)を合成する(UNC, Duke-NUS)。サブタスク9.2 MPのメトリックスを試験管内試験およびげっ歯類で試験する（UNC）。サブタスク9.3 MPの安全性をウィスコンシンとシンガポールのコウモリで試験する（NWHC、Duke-NUS）。

マイルストーン各サブタスクの開始と完了。

成果物：広範な免疫増強分子または標的免疫増強分子を含む、使用可能な Ac-DEX MP。MPの有効性と安全性試験のデータ。

PI-TA-02 タスク 10: 免疫増強分子を投与するための送達システムの開発と評価 (NWHC, PARC)

サブタスク 10.1 バイオマーカーのローダミン(RB)を用いた経皮投与法を飼育下の米国コウモリでテストする(NWHC)。サブタスク 10.2 野生の米国コウモリ（NWHC）を用いて、RBマーカーを用いた送達物質の実地試験を実施する。サブタスク 10.3 フィラメント伸長霧化（FEA）装置のプロトタイプを開発する（PARC）。サブタスク 10.4 RBを使用したFEA装置を米国の飼育コウモリ（NWHC）で試用する：各サブタスクの開始と完了。

成果物：飼育下および野生のコウモリにおける経皮投与実験のデータ。FEA装置のプロトタイプ。FEA装置送達システムのProof-of-Coricept。

フェーズⅡ：

PII-TA-OlTask 1｛PI-TA-OlTask 2から継続｝：実験室および野外実験（EHA）に基づき、「空間的ウイルス流出リスク」アプリを更新する。

小課題1.1 実験室およびフィールドの結果から、コウモリ種のリスクに関する情報を組み込む(EHA)。小課題1.2 地理的位置の特徴と宿主・病原体の特徴を利用したリスクランキングアルゴリズムを組み込む（EHA）。小課題1.3 宿主種とプロジェクトおよび過去のデータから得られたウイルス多様性データをリンクさせる（EHA）、

マイルストーン（複数可）：マイルストーン：各サブタスクの開始と完了。

成果物病原体ランキング、コウモリ種ランキング、地理的ランキングによる情報を表示する、実用的なプロトタイプアプリ。

PII-TA-OlTask2（PI-TA-01タスクからの継続）：高リスク SARSr-CoV 株の遺伝子型-表現型間の波及可能性を予測するベイジアンネットワークモデルを構築し、テストする。(EHA）。

小課題2.1 SARSr-CoV集団における種内および種間の突然変異率と組換え率を推定する（EHA）。小課題2.2 将来のQSと未サンプルのQSを予測するための順進化シミュレーションを行う（EHA）。サブタスク2.3 将来の高リスクQSの波及を予測する（EHA）マイルストーン（複数可）：各サブタスクの開始と完了。

成果物：機能モデルからのソースコードとモデル出力。将来のQS変異体の予測。ネットワーク機械学習モデルによる高リスク SARSr-CoV QSの特定。

PII-TA-02 課題 3（PI-TA-02-10 から継続）：免疫増強分子の送達システムの開発と評価 (NWHC, PARC)

小課題 3.1 FEA プロトタイプのための運動・時間作動施設の設計と最適化を行う(PARC)。小課題3.2 ウィスコンシン州の野生のコウモリを対象に、FEA運動作動プロトタイプを用いてRBマークを付けた送達物質の実地試験を実施する(PARC, NWHC)。

マイルストーン FEA 展開プロトタイプの設計。

成果物：運動および時間作動施設を備えた最適化されたFEAプロトタイプ。野生のコウモリにおける。RB 標識物質の FEAによる送達の概念実証。

PII-TA-02 課題4：配備戦略を最適化するための動的循環モデルの構築とテスト課題4,1 ロバストな確率的SIRプロセスモデルを開発する。小課題4.2 部分観測可能マルコフ過程の枠組みを用いて、雲南省のテスト洞窟からのサンプリングデータにSIRモデルを当てはめ、時間交差検証によって検証する（EHA）。小課題4.3 テスト洞窟サイトでの展開に最適なシナリオを決定するために、一連のもっともらしい展開シナリオの下でウイルス循環をシミュレートする（EHA）。サブタスク4.4 より広範な条件下で、展開戦略の頑健性をテストする。

マイルストーン各サブタスクの開始と完了。

成果物：動的循環モデルのソースコードと出力;展開のための最適化されたシナリオ。

Pfl-TA-OZ 課題5：リスク／予備免除モデルの精度を実証し、雲南省洞窟の多種コウモリコロニーにおけるウイルス排出を抑制するための最も効果的な分子送達方法を展開する（EHA、PARC、NW HC、Duke-NUS、UNC）。

サブタスク5.1 特定の場所（入口、出口）を特定し、FEA自動エアロゾル化ポイントを特定し、展開計画を微調整する。(EHA、WIV、NWHC、Duke-NUS、PARC、UNC）。小課題5.2 コンセプト実証実験展開前の4カ月間、テストサイトの洞窟1つと洞窟群の対照洞窟2つでコウモリウイルス監視を実施し、ベースラインデータを評価する（EHA Consultant Zhu, WIV）。小課題5.3 中国雲南省の1つのテスト地点と2つの対照洞窟で、FEAエアロゾル化メカニズムによる最も効果的な免疫増強分子と送達技術の配備実験を実施する（PARC、EHA、WIV）小課題5.4 配備後4カ月間、テスト地点の1つの洞窟と2つの対照洞窟でコウモリのウイルスサーベイランスを実施する。(EHAコンサルタントZhu、WIV）。サブタスク5.5 概念実証試験の有効性を評価する（EHA、UNC、DNUS）。

マイルストーンサブタスク5.2-55に基づく試験の開始と完了。試験集団からのベースライン免疫学的データとウイルス排出データ。生物学的介入導入の概念実証。試験集団における免疫調節とウイルス排出の導入後の指標。概念実証の有効性に関する報告。

セクション H H, スケジュールとマイルストーン

表2 スケジュールとマイルストーンを参照のこと

セクションH

このプロジェクトの技術は、両段階を通じて複数の潜在的ユーザーに移行する。パートナーであるPARCとUSGS国立野生動物衛生センターは、国防総省やUSGS（コウモリ関連の疾病対策）などの政府顧客や可能性のある製造業者を含め、フェーズ1の12カ月以内にエアロゾル展開装置の移行のための計画を開始する。これらの取り組みの知的財産権は DARPAと交渉される。フェーズ1が完了する前に、完全に配列された新型ウイルスのパネル、パンデミック予測のためのin silicoモデル、治療薬の評価に使用できる動物モデルがDARPAと共有され、国防総省の医療コミュニティや他のUGS機関などの国防総省ユーザーへの早期配布について共同で合意され、最終的には一般公開される予定である。DARPAの要請がない限り、あるいはプロジェクト・パートナーの要請がありDARPAの承認がない限り、この情報に関して特許を取得したり、知的財産を制限したりする計画はない。フェーズ 2 で実験的に配備され評価される提案技術は、DARPAと共有され、国防総省医療コミュニティや他の UGS 機関などの国防総省ユーザーへの早期配布について共同合意される。DARPAが要求するか、プロジェクト・パートナーが要求し、DARPAが承認しない限り、この情報に関して特許を取得したり、知的財産を制限したりする計画はない。

民間企業パートナー（大企業）としてのPARCは、ゼロックス・コーポレーションの完全所有子会社であり、さまざまな商業パートナーへのさまざまな用途空間に対するIPライセンスを通じて、FEA技術の商業化に尽力している。PARCは、DEFUSEで開発される可能性のある標的送達技術の最終的な移行のために、バイオテクノロジーおよびバイオメディカル分野の潜在的なライセンシー（OEM）に関与しており、今後も関与していく予定である。PARCはすでに、バイオテクノロジーおよびバイオメディカル分野において、大企業（ファウチュン500、ファウチュン1000）、中小企業、新興企業など、FEAを広範囲・大面積の薬物送達デバイスとして移行させるパートナーとなりうるビジネス関係の既存のネットワークを持っている。加えて、DEFUSEパートナーの拡大ネットワークやDARPAと協力し、特に野生動物の健康管理（EHAやUSGS-NWHCと協力）や新興脅威の抑制（CDCなどの政府機関と協力）など、我々の送達技術に対する既存の政府ニーズをさらに特定する。PARCはこの知識を活用し、潜在的パートナーと共にニーズに基づいた商業化計画を策定する。

Project DEFUSEのパートナーは、学術機関、政府機関、民間企業、民間非営利団体から構成され、研究成果、データ、およびこの研究で開発されたあらゆる技術の一貫した移行計画を策定する。

セクション II J. 事前のリスク軽減計画

リスク：人の安全、バイオセーフティ、公衆衛生および動物の安全に対するリスクの軽減動物の使用と安全：野生のコウモリを用いた作業はすべて、エコヘルスアライアンスのスタッフと武漢ウイルス学研究所が中国で実施する。捕獲とサンプリング技術は、NIH NIAID賞{Daszak, PI}のもと、タフツ大学獣医学部IACUCの承認を得ている。コウモリやトランスジェニックマウスを使った実験作業は、WIV、Duke-NUS、UNC、NWHCのBSL-3ラボで行われる。各パートナー機関は、それぞれのIACUCに動物実験の承認を申請し、承認を得る。エコヘルス・アライアンスが中国で実施するすべての動物実験は、WIVのIACUCとタフツのIACUCの両方によって監督される。各パートナー機関は、エコヘルス・アライアンスによって文書化される実験従事者の訓練と安全を確保する責任を負い、各パートナーは、このプロトコルに記載されている実験動物実験の技術と手順について、豊富な経験と安全性の記録を持っている。野外での安全性：放し飼いのコウモリは、ミストネットかハープトラップのいずれかを用いて捕獲する。捕獲の全期間中、網のシステムには2人の人間がつき、コウモリが絡まったらすぐに網から外し、ストレスを最小限に抑えて怪我を防ぐ。私たちの経験では、1回の捕獲につき、3人のチームで最大20～30匹のコウモリを安全に捕獲・処理することができる。捕獲期間は捕獲率によって異なるが、コウモリは小さな布袋に入れられ、サンプルが採取されるまで枝や柱に吊るされる。コウモリは最大6時間拘束される。現場担当者は、各現場サンプリング期間の前と各場所で危険度評価を実施する必要がある。バイオセーフティと個人防護具：咬傷や引っかき傷から保護する専用の衣服、ニトリル手袋（二重構造）、N95呼吸器、網や罠からコウモリを取り出すときやコウモリをサンプリングするときには、安全眼鏡または顔面シールドを着用する。外部の衣服とすべての器具は現場でビルコンを使って除染し、バイオハザード廃棄物はバイオハザード袋とシャープス容器に入れ、WIVまたは雲南省CDCの施設で焼却する。人員は、サンプル採集や画像採集（LiDARなど）のために洞窟に入るときは、水不伝染性のタイベックスーツ、ゴム長靴、動力式空気清浄呼吸器（PAPR）を着用し、洞窟から出るときはPPEを脱いで廃棄し、PAPRを消毒する。すべての現場職員は狂犬病の予防接種を受け、CDCのガイドライン132に従って現在（6カ月以内）の防御力価を証明する。

PPEの訓練を受けておらず、狂犬病の予防接種を完了していない職員は、コウモリを扱うことも、調査洞窟に入ることも許可されない。調査洞窟の地図を作成するためのLiDARの使用は、ケイビングの経験を持つ訓練を受けた職員が行う。

一般市民へのリスク：提案されている作業は、サンプリングが洞窟の近くで行われるため、一般市民へのリスクは最小限である。われわれのチームには豊富な経験がある。

セクションIG. 倫理的、法的、社会的影響

このプロジェクトにおけるすべての活動は、中国政府と地元当局の許可を得て、米国と中国の法律を厳守して行われる。特にこの地域ではコウモリの消費習慣が一般的であるため（リスク軽減戦略も参照）、地元の野生生物当局や文化指導者に対して教育的な働きかけを行い、私たちが何をしているのか、なぜそれを行っているのかを一般に理解してもらう。これらの薬剤はヒトに対するテストは行われていないが、様々な実験動物モデルにおいて安全であることが示されている。MPを含む液体にヒトがさらされることに関連するリスクは最小限である。私たちは、この研究を開発する際に考慮したリスク軽減策と安全性データ、そしてこれが地域社会にどのような利益をもたらすかを説明する。また、この薬剤がウイルスのシェディングを減少させるのに有効であれば、地域社会に利益をもたらす可能性もある。ウイルス性人獣共通感染症に対する野生動物への予防接種はこれまで限定的であったため、このプロジェクトが社会に与える影響は大きい。しかし、このプロジェクトによって、既知の高リスク病原体のリザーバーとなる動物に、リスクの高い時期に「免疫」を与え、ヒトによる感染症の発生数や規模を減少させることができる可能性がある。これは、動物の感染源からヒトや家畜集団へのウイルス流出のタイミングを解明した生態学的研究に、貴重な対抗策を加えることになる。生物学的免疫調整剤の配備のために開発・試験された技術の詳細が公開され、他の種類の医療介入や病原体にも適応できるようにする計画を立てる。野生生物の感染源は公衆衛生に対する脅威が少ないと考えられるため、公衆衛生対策として地域個体群を駆除・絶滅させる必要性が低くなる。