pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34483925/
Ivermectin has New Application in Inhibiting Colorectal Cancer Cell Growth
Front. Pharmacol. 2021年8月13日
概要
大腸癌（CRC）は、世界で3番目に多い癌であり、未だに有効な治療法がない。抗寄生虫薬であるイベルメクチンは、抗炎症作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用を有することが示されている。しかし、イベルメクチンがCRCに影響を与えるかどうかはまだ不明である。
本研究の目的は、CRC細胞株SW480およびSW1116を用いて、イベルメクチンのCRCへの影響を評価することである。細胞生存率の測定にはCCK-8アッセイを、細胞形態の測定には光学顕微鏡を、細胞のアポトーシスの測定にはアネキシンV-FITC/7-AADキットを、カスパーゼ3/7活性の評価にはカスパーゼ3/7活性アポトーシスアッセイキットを、アポトーシス関連タンパク質の発現量の測定にはウェスタンブロットを、活性酸素種（ROS）レベルと細胞周期の測定にはフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を用いた。
その結果、イベルメクチンは、大腸がんのSW480およびSW1116の細胞増殖を用量依存的に阻害し、続いて細胞のアポトーシスを促進し、カスパーゼ-3/7活性を増加させた。さらに、イベルメクチンは、プロアポトーシスタンパク質であるBaxと切断型PARPの発現を増加させ、アンチアポトーシスタンパク質であるBcl-2の発現を低下させた。
メカニズム解析の結果、イベルメクチンは用量依存的に総活性酸素とミトコンドリア活性酸素の産生を促進したが、CRC細胞にN-アセチル-L-システイン（NAC）を投与することでこれを除去することができた。NACを投与すると、イベルメクチンによる細胞増殖の抑制が回復した。
最後に、イベルメクチンを低用量（2.5および5μM）で投与すると、CRC細胞の停止が誘導された。以上、イベルメクチンは、活性酸素によるミトコンドリアのアポトーシスを促進し、CRC細胞のS期停止を誘導することで、細胞増殖を抑制した。このことから、イベルメクチンは、ヒトの大腸がんやその他のがんに対する新たな抗がん剤治療の可能性が示唆された。
はじめに
大腸がん（CRC）は、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸、直腸に発生する悪性腫瘍で、世界的に最も多い悪性腫瘍の一つである。世界のすべての悪性腫瘍の中で、CRCは発生率で3位、死亡率で2位となっている(Siegel et al 2020)。CRCは、国や個人に大きな経済的負担をもたらしている（Maida er al 2017）。現在、CRCの治療は、主に手術をベースに、放射線治療、化学療法、標的療法などを組み合わせた包括的な治療を採用している（Modest er al 2019）。しかし、CRCの発生・発症・転移のメカニズムは複雑であるため、CRC治療のための特効薬はまだ不足している。
イベルメクチンは、16員環マクロライド化合物であるアバメクチンの誘導体であり、抗寄生虫薬として初めて臨床現場で広く使用された（Laing er al)。 イベルメクチンは、γ-アミノ酪酸受容体またはグルタミン酸-塩化物イオンチャネル（Glu-Cl）の活性を高め、塩化物イオンの流入を増加させ、細胞膜の過分極を引き起こすことで、神経細胞と筋肉の間の信号伝達を遮断し（Martin et al 2021)抗寄生虫作用を発揮する。イベルメクチンは、抗寄生虫薬としてだけでなく、フラビウイルス、HIV-1ウイルス、SARS-CoV-2ウイルスなどの抗ウイルス剤としても利用できる可能性がある（Mastrangelo et al 2012,Wagstaff et al 2012,Caly et al 2020）。さらに、イベルメクチンが様々な腫瘍細胞に対して抑制効果を持つことが研究で明らかになっており、広域抗腫瘍薬としての可能性がある（Juarez er al 2020）。（Juarez et al 2020）は、イベルメクチンが乳がん細胞MDA-MB-231,MDA-MB-468,MCF-7,卵巣SKOV-3に対して最も感受性が高く、一方、前立腺がん細胞株DU145に対してはイベルメクチンが最も非感受性であることを示している。これらの感受性の高いがん細胞に対するイベルメクチンのこの効果は、G0/G1での細胞周期停止の誘導が媒介となっている。さらに、イベルメクチンは、p21-activated kinase 1 (PAK1)によるオートファジー、カスパーゼ依存性アポトーシス、または免疫原性細胞死が、Hippo経路、Akt/mTOR経路、WNT-TCF経路などのシグナル経路を調節することで、がん細胞の増殖を抑制することができる（Liu er al 2020）。知られているように、活性酸素は、酸化ストレスによるアポトーシスに重要な役割を果たしている。活性酸素は、正常なミトコンドリア呼吸の副産物である。感染症、乾燥、寒さ、紫外線などの刺激は、細胞内の活性酸素の増加をもたらす。そして、蓄積された活性酸素は、細胞のミトコンドリア機能障害を誘発し、細胞のアポトーシスを促進する可能性がある（Sinha er al)。 イベルメクチンによるアポトーシスは、活性酸素の生成と密接に関係していることが明らかになっている。現在、大腸がんにおけるイベルメクチンの研究報告はほとんどない。
さらに、旧薬の新規使用（つまり、ドラッグ・リロケーション）は、旧薬を拡大して新規使用法を開発する戦略であり、研究開発費が少なく、開発期間が短いという利点がある（Pushpakom er al)。 イベルメクチンのドラッグ・リロケーションの研究は、新しい抗腫瘍剤を開発するための近道である。このようなことから、我々は、イベルメクチンがCRC細胞の増殖とアポトーシスに与える影響とそのメカニズムを探る研究を企画した。
材料と方法
【省略】
考察
大腸がんの発生率は長い間減少しているにもかかわらず、治癒的切除を受けた患者の3分の1以上が局所および全身性の再発を経験する（Wu er al)。 そのため、大腸がんは、効果的な新しい治療法のアンメットニーズが高い領域にある。さまざまなアプローチの中で、大腸がん治療のための古い薬剤の新しい使用が重要性を増している。抗寄生虫化合物として広く使用されている旧薬のイベルメクチンは、抗がん剤として再利用するための薬剤候補である（Alout and Foy, 2017）。イベルメクチンは、乳がん、消化器系がん、泌尿器系がん、血液系がん、生殖器系がん、脳神経膠腫、呼吸器系がん、メラノーマに対して抗がん作用があることを示す証拠が蓄積されている（Tang er al 2021）。
大腸がん細胞に対するイベルメクチンの細胞毒性を評価するために、CCK-8アッセイを用いて、異なる濃度のイベルメクチンが大腸がん細胞の生存率に及ぼす影響を評価した。その結果、イベルメクチンは、濃度依存的かつ時間依存的に大腸がん細胞の増殖を効果的に抑制することがわかった。薬剤濃度と培養時間の間には有意な相互作用が認められた。異なる濃度で処理した後、大腸がん細胞は光学顕微鏡で細胞増殖の抑制を示した。
細胞死には、アポトーシス、オートファジー、細胞壊死という3つの経路がある（D’Arcy, 2019）。現時点では、アポトーシスを標的にすることが、手術に加えてがんを治療する最も成功した方法である（Pfeffer and Singh, 2018）。細胞死の本質的な方法として、アポトーシスには、一連のステレオタイプを伴う形態変化、DNAの梯子状の断片、ホスファチジルセリン（PS）の常在化、ミトコンドリアの膜貫通電位の低下、カスパーゼ3の活性化などがある（Kaczanowski, 2016; Majtnerová and Roušar, 2018）。そこで、これらのアポトーシスのランドマークとなるイベントを検出することで、イベルメクチンが大腸がん細胞のアポトーシスに関与しているかどうかを検出した。まず、本研究ではAnnexin V-FITC/7-AAD Apoptosis Kitを用いてPS eversionを検出した。正常な細胞では、PSは主に細胞膜の細胞質側に存在している。アポトーシスが始まると、PSは細胞膜の内側から外側に移動する（Zhang er al 2018b）。アネキシンVはPSとの親和性が高く、細胞外環境にさらされたPSに結合することができる。我々の研究では、アネキシンV-FITC/7-AADキットとフローサイトメトリーを組み合わせて、大腸がん細胞のアポトーシスに対する異なる濃度のイベルメクチンの効果を検出した。フローサイトメトリーの結果、イベルメクチンは用量依存的に大腸がん細胞のアポトーシスを誘導し、イベルメクチンのアポトーシス効果をさらに確認することができた。
次に、本研究ではCaspase 3/7 Apoptosis Kitを用いてCaspase-3の活性化を検出した。アポトーシスの初期段階では、Caspase-3は上流のシグナル分子によって活性化される。それは、下流のアポトーシスの重要なタンパク質を切断し、最終的に細胞のアポトーシスを導くことができる(Porter and Jänicke, 1999)。本研究では、イベルメクチン濃度の増加に伴い、カスパーゼ3/7活性が上昇することが示された。
周知のように、アポトーシスの経路は主に外因性経路と内因性経路に分けられる(Carneiro and El-Deiry, 2020)。薬剤の刺激下では、Bcl-2ファミリータンパク質がミトコンドリアの膜変化の伝染性を調節する。そして、cyt cが細胞質に放出され、カスパーゼのカスケード反応を誘発し、最終的に細胞死に至る（Elmore, 2007）。
かなりの証拠が、プロアポトーシスおよびアンチアポトーシスのBcl-2ファミリータンパク質の両方が、イベルメクチンによって誘導されるアポトーシスに関与していることを示している。（Song et al 2019）は、イベルメクチンが、p53およびBaxの発現をアップレギュレートし、Bcl-2をダウンレギュレートし、切断型カスパーゼ-3,および切断型カスパーゼ-9を活性化することで、グリオーマ細胞のアポトーシスを誘導することを明らかにした。（Zhang et al 2019）は、イベルメクチンによるHela細胞のアポトーシスにおいて、細胞質内のBax/Bcl-2の比率が増加することを観察した。本研究では、予想通り、イベルメクチンがアポトーシスタンパク質Bcl-2を阻害し、アポトーシスタンパク質BaxとCleaved PARPの発現を増加させたことから、イベルメクチンが内在性アポトーシス経路に関与している可能性が示唆された。
細胞内の活性酸素は、アポトーシスや細胞周期の調節に関与し、細胞内のさまざまなシグナル伝達経路に参加している（Yang er al)。 Deng et al 2018）は、イベルメクチンが細胞内ROSの含有量を増加させ、増加したROSがTFE3依存性オートファジー経路を活性化することを見出した。同様に、Singh and Czaja（2007）は、ROSがカスパーゼ依存性のアポトーシス経路を介して最終的に肝細胞死を誘発する可能性があることを見出した。本研究では、DCFH-DAとMitoSOXを用いて、総活性酸素とミトコンドリア活性酸素の変化を検出した。その結果、イベルメクチンは用量依存的に総活性酸素とミトコンドリア活性酸素を増加させた。フローサイトメトリーの結果から，NACはイベルメクチンによって誘導された活性酸素をある程度除去できることがわかった。
次に、CCK-8の結果から、NACがイベルメクチンによる細胞死を抑制することが明らかになった。
細胞周期の進行は、健康な組織や正常な細胞におけるホメオスタシス維持の重要なシグナル伝達機構の一つである（Zhang er al 2018a）。そのため、がん細胞における細胞停止の誘導は、抗がん剤開発のための貴重な戦略である（Dominguez-Brauer et al 2015）。いくつかの研究は、イベルメクチンが一部のがん細胞においてG0/G1期の細胞周期停止をもたらすことを支持している。
例えば、（Song et al 2019）は、イベルメクチンがC6およびU251グリオーマ細胞の細胞周期をG0/G1相でブロックできることを見出した。さらに、イベルメクチンは、胆管癌細胞のS期での停止を引き起こすこともできた（Intuyod er al 2019）。本研究では、イベルメクチンがSW480細胞およびSW1116細胞のS期停止を誘導することが示された。細胞周期に対するイベルメクチンの効果をより明確にするためには、CDK4およびサイクリンA（S期制御因子）の発現に関するイベルメクチンのさらなる特性評価が必要である。
結論として、イベルメクチンは、大腸がん細胞を抑制するために、活性酸素の産生を増加させ、S期の細胞周期を阻害することで、アポトーシス経路において重要な分子であるCaspase-3,Bax、Bcl-2,PARP、Cleaved-PARPの発現を調節する可能性があることを示した（図11）。したがって、現在の結果は、イベルメクチンがヒトの大腸がんやその他のがんを治療するための新しい抗がん剤の可能性を示している。