Contents
Effect of two different sublingual dosages of vitamin B12 on cobalamin nutritional status in vegans and vegetarians with a marginal deficiency: A randomized controlled trial
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29499976/
Open AccessPublished:2018年2月15日
概要
背景と目的
ベジタリアンやビーガンはビタミンB12欠乏症になりやすく、巨細胞性貧血、認知機能低下、神経障害、うつ病などの深刻なリスクがある。簡単で簡単な補給方法としては、1週間に1回2000μgを摂取することが挙げられる。しかし、ビタミンB12の単回大量経口摂取は吸収が悪い。本研究では、2種類のビタミンB12の舌下投与量（350μg/週と2000μg/週）を用いて、限界欠乏症の菜食主義者と菜食主義者におけるシアノコバラミン（ビタミンB12）の栄養状態を改善する能力を評価した。
方法
12週間の無作為化二重盲検対照並行介入試験を実施した。限界的ビタミンB12欠乏症の40人の被験者を登録し、無作為に2群に分けた：試験群Ld（低用量、350μg/週）と対照群Hd（高用量 2000μg/週）のビタミンB12補充。ベースライン時と介入から15日後、30日後、60日後、90日後に血液サンプルを採取し、ビタミンB12,関連代謝マーカー、血球数を測定した。
結果
双方向分散分析では、ベースラインと比較して90日後に増加したビタミンB12の血清濃度（LdとHd）について、時間（P < 0.0001）と時間×治療の相互作用（P = 0.012）の有意な効果が示された。どちらのサプリメントもホロトランスコバラミン、コハク酸、メチオニン、ウェルネスパラメータのレベルを増加させ（P < 0.0001,時間効果)メチルマロン酸、ホモシステイン、葉酸のレベルをベースラインと比較して減少させ（P < 0.0001,時間効果)ビタミンB12のレベルを増加させた。群間（Ld vs Hd）では差は認められなかった。ビタミンB6および血球数には効果は認められなかった。
結論
我々の実験条件では、両方のサプリメントは、ビタミンB12の適切な血清濃度を回復し、限界的な欠乏を持つ被験者の関連する代謝血液マーカーのレベルを改善することができた。この結果は、このターゲット集団におけるビタミンB12の栄養的に十分な状態に到達するためには、週2000μg/週（単回投与）ではなく、50μg/日（350μg/週）のコバラミンの舌下投与量を使用することを支持するものである。
本研究は www.isrctn.org に ISRCTN75099618 として登録された。
キーワード
ビタミンB12、代謝物、舌下サプリメント、ビーガン、ベジタリアン
1. 序論
ビタミンB12（シアノコバラミン）は、赤血球の形成、中枢神経系の維持、認知機能に関与する重要かつ必須の水溶性栄養素である[1]。シアノコバラミンは、肉類、内臓肉、貝類、卵、牛乳、その他の乳製品などの動物性食品に多量に含まれている。植物性食品には、強化されていない限りビタミンB12は含まれていない（例：朝食用シリアルなど）。ビタミンB12の生理的吸収は、糖タンパク質内在性因子（IF）によって媒介される。吸収には、IF-B12複合体の形成と回腸を介したビタミンB12の輸送が必要である[1, 2]。吸収されると、ビタミンB12は主に肝臓に蓄積され、使用前に何年も貯蔵される [1, 2]。
ビタミンB12の推奨摂取量は国や個人によって大きく異なる[3]。通常、通常の雑食の健康な人では、ビタミンB12の適切なレベルを維持するには、1日に数マイクログラムのビタミンB12を摂取するだけで十分である[3, 4]。イタリアでは、エネルギーと栄養摂取レベルの国家基準（LARN）は、成人のための1日2.4μgの平均的な要件を特定し、妊娠中と授乳期にそれぞれ2.6μgと2.8μgまで、[4]。ビタミンB12の欠乏は、消化器疾患、セリアック病、クローン病、遺伝的多型の結果として、この栄養素の不吸収を引き起こす可能性がある[1, 2]。しかし、このような状態になる頻度は低く、高齢者や菜食主義者は肉製品の摂取量が限られているため、ビタミンB12欠乏症になりやすい[5, 6]。逆に、動物性食品を食事から排除している菜食主義者では、ビタミンB12欠乏症になることが多い。この点に関して、最近のシステマティックレビューでは、ベジタリアン食とビーガン食を実践している人のビタミンB12欠乏症の有病率が評価されている[7]。著者らは、菜食主義者の食生活は、菜食主義者と比較してビタミンB12欠乏症のリスクの増加と関連していることを報告している[7]。これらの知見は、他の著者によって報告された観察結果と一致していた[8, 9, 10, 11]。
ビタミンB12欠乏は、大球性貧血、高ホモシステイン血症、心血管、脳血管、神経障害などのいくつかの代謝障害と関連している[6, 12, 13, 14]。しかしながら、ビタミンB12欠乏症および関連する合併症を発症するリスクが高いにもかかわらず、多くの菜食主義者はサプリメントの摂取は不要であると考えている。欠乏症は、肝臓に存在するビタミンのストックが原因で、長期間の枯渇（人によっては数年かかることもある）の後に現れる [15]。B12の血清レベルが150pmol/L未満の人は欠乏と考えられている[15,16]。この特定の状況では、非経口経路によるビタミンB12の統合が必要である。しかし、このアプローチは、結果が痛みを伴い、高価である[19]だけでなく、経口製剤で代用されるため、あまり受け入れられていない。しかし、これは、嘔吐または下痢に苦しんでいるか、または経口治療に耐えられない被験者には効果的ではない[20]。さらに、高用量のビタミンB12を経口投与した場合、ごく一部の割合しか吸収されないようである。最近では、ビタミンB12の舌下投与が開発されている[20]。吸収を良くするためには舌下投与が推奨されることが多いが、低用量と高用量のビタミンB12の投与効果については一貫性のない結果が得られている。
本研究の目的は、限界欠乏症の菜食主義者と菜食主義者のグループにおけるシアノコバラミンの栄養状態を改善するための2つの異なる用量（350μg/週 vs 2000μg/週）の舌下サプリメントの能力を評価することであった。低用量（Ld）は1日50μg（350μg/週）のビタミンB12を提供する7つの舌下錠で構成され、高用量（Hd）は1つの舌下錠（2000μg）で1週間全体を構成されていた。後者は、経口または非経口経路で投与される場合でも、最も一般的な補給方法である。この点に関して、いくつかの研究では、高用量の摂取後の吸収が低いことが示されている[1,21]。さらに、この方法は被験者によっては忍容性が低い場合がある;例えば、軽度および中等度のアルツハイマー病患者に1mg/日のビタミンB12を補給した場合の副作用（多汗症や目のかすみなど）を発見した著者もいる[22]。我々の仮説は、シアノコバラミンの低用量（350μg/週）と高用量（2000μg/週）の舌下投与は、両方とも限界欠乏症に影響を受ける菜食主義者やベジタリアンで90日以内にビタミンB12の栄養的妥当性を回復することができることである[23,24,25]。
2. 材料と方法
2.1 対象者の募集
参加者のスクリーニングは 2015年3月から 2016年7月の間に、掲示板の広告、電話、電子メールなどで実施した。被験者は、医師による日常的な健康診断を受け、試験参加資格を評価するために受診した。参加資格の評価は、糖尿病、腎不全、アレルギー、慢性便秘、下痢、またはその他の消化器疾患などの疾患を有する被験者を除外するために、医師による正確な検査と健康・医学的質問票によって行われた。さらに、ビタミンB12の栄養状態を把握するために少量の血液を採取した。被験者は、以下の包含基準に従って選択された：限界的ビタミンB12欠乏症（<220pmol/L）または完全なビタミンB12欠乏症（<150pmol/L）の状態にある菜食主義者および菜食主義者の被験者、非喫煙者または軽喫煙者（最大5～6本/日)および中等度のアルコール消費量（最大14杯/週のワイン/ビール）。心血管疾患、冠動脈疾患、糖尿病、肝疾患、腎疾患、または消化管疾患を有する被験者は除外された。実験開始の少なくとも1ヶ月前に薬物、薬物、および/またはサプリメントを使用していた場合、被験者は除外された。さらに、実験開始の少なくとも1年前にビタミンB12のサプリメントを服用している場合、被験者は除外された。本研究は 2013年ヘルシンキ宣言に定められた倫理基準に従って実施され、ミラノ大学の倫理委員会によって承認された（2015年3月4日、参考文献11/15）。本研究は www.isrctn.org で ISRCTN75099618 として登録された。参加者全員がインフォームドコンセントフォームに署名した。
2.2 実験デザイン
研究にもサンプル解析にも関与していない研究者が、センターのデータベースから入手した無作為化リストに従って、患者を異なる治療法に割り振るように任命された。各群に無作為に割り付けられた被験者の数、研究終了率、主要アウトカムを分析した患者の数を図 1 に示す。12週間の二重盲検（参加者とアウトカム評価者)無作為化、対照、並行食事介入試験のために、40人の被験者が登録され、それぞれ20人ずつの2つのグループに無作為に割り振られた。試験は2015年5月から 2016年10月の間に実施された。一方のグループは低用量（Ld;50μg/日、350μg/週に相当）でサプリメントを摂取し、他方のグループ（対照）は高用量（Hd;1回の摂取で2000μg/週に相当）でサプリメントを摂取した。ビタミンB12は、試験開始時に1ストックでボランティアに提供した。各被験者は、盲検状態で1週間分の用量を含む13箱を受け取った。すべての錠剤は、単回用量ブリスターに包装され、番号が付けられていた（1から7まで）。被験者には、番号の順序に従って、1日1錠を朝、朝食前に飲み込むように指示した。Ld群はシアノコバラミンの舌下錠7錠/週（各50μg、350μgに相当）を摂取したが、Hd群はビタミンB12の舌下錠1錠（2000μg）とプラセボの舌下錠6錠のみを摂取した。両群（Ld、Hd）ともビタミンB12の錠剤は、マンニトール、トウモロコシデンプン、植物性ステアリン酸マグネシウム、ビートジュース、スクラロースで構成されていた。プラセボ錠は、ビタミンB12サプリメントの形状、大きさ、色、味、組成に一致していた。舌下ビタミンB12錠剤は、厳格な菜食主義者の食事要件に適合する製造プロセスを有する細菌から得た。錠剤の調製には、シアノコバラミンの結晶形を使用した。
図1患者の選択と登録、2つの試験群への割り付け、試験終了率を示すフローチャート
Ld：低用量ビタミンB12投与群（350μg/週)Hd：高用量ビタミンB12投与群（2000μg/週）。
被験者には、登録前に宣言された通りの食生活および生活習慣を維持するよう指導された。さらに、ビタミンB12の摂取源（スピルリン、酵母、強化食品など）を控えるように指導された。食事の指示に従っているかどうかを確認するために、採血前日に各ボランティアが24時間食事の記録をとった。2週間ごとに、被験者は空のブリスター（錠剤を消費した証拠として）を返却し、新しいサプリメントを受け取った。また、実験期間中に3日間の食事記録と週1回の直接面接を無作為に行い、食事指示書の遵守状況を確認し、錠剤の消費を確認した。実験当日、一晩絶食した後、被験者は空の水疱をミラノ大学の研究室に報告した。血液サンプルは、ベースライン（時間0）および介入15,30,60,90日後に採取した。
2.3 研究変数
ビタミンB12の血清レベルの改善を主要エンドポイントとした。研究対象の他の変数は、ホロトランスコバラミン、メチルマロン酸、コハク酸、メチオニン、ホモシステイン、ビタミンB6,葉酸、および全血球数であった。サプリメントを通じて提供されたコバルトの量は、循環血中濃度に関して無視できる程度であったため、この変数は評価されなかった。
2.4 生化学的パラメータのサンプリングと分析
血液は、午前中に瀉血師によって採血された。サンプルは、K2EDTAの有無にかかわらず、真空管に引き込まれた。血清は1時間以内に分離し、血漿は遠心分離（4℃で2300×gで15分）により採取後30分（分）以内に分離した。血漿と血清を分注し、分析まで-80℃で保存した。すべてのサンプルを盲検で分析した。血球数は、ルーチンラボの評価により評価した。
ビタミンB12レベルは、このビタミンに特異的なIFを用いた競合試験原理により測定した。ビタミンB12は、コバスイムノアッセイアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティックス、北米）を用いた電気化学発光イムノアッセイ（ECLIA）により分析した。また、血清葉酸の評価は、Cobas immunoassay analyzers（Roche Diagnostics, North America）を用いたelectrochemiluminescence immunoassay（ECLIA）で行った。
ホロトランスコバラミン濃度は、免疫酵素アッセイキット（BIOHIT HealthCare、ヘルシンキ、フィンランド）を用いて血清中に決定した。簡潔に言えば、マイクロタイタープレートのウェルを、BIOHITアクティブB12（ホロTC）に対する高特異性モノクローナル抗体でコーティングした。最初のインキュベーションの間、ホロTCは抗体でコーティングされた表面に特異的に結合した。その後、結合していない成分を除去するためにウエルを洗浄し、基質とのインキュベーション後にholoTCを検出した。分析の前に、停止溶液を添加し、405nm（mod. F200 Infinite, TECAN Milan, Italy）で吸光度を測定した。
血清ビタミンB6濃度は、関連する市販キット（Chromsystems Instruments & Chemicals, Munich, Germany）を用いた高速液体クロマトグラフィー法により評価した[26]。ホモシステイン（HCy)メチオニン（Met)メチルマロン酸（MMA)コハク酸（SA)トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP-HCl)メタノール、およびギ酸は、Sigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。水はMilli-Q装置（Millipore, Milford, MA）から入手した。HCy、Met、MMA、およびSAの決定は、わずかな修正を加えて、Fuら[27]に従って行った。簡潔に言えば、ヘパリン化血漿200μLを100μLの水および100μLのTCEP-HCl（0.1 M）に添加した。混合物を10秒間ボルテックスし、室温で15分間インキュベートし、Amicon 10 K Daフィルターに移した。フィルターを90000gで30分間遠心分離し、濾液をマイクロバイアルに移し、5μLをウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー（UPLC）-高分解能（HR）-質量分析計（MS）に注入した。分析は、エレクトロスプレーイオン化のためのHESI-IIプローブとコリジョンセル（HCD）を備えた高分解能フーリエ変換質量分析計（Orbitrap）モデルExactive（Thermo Scientific）と結合したUHPLCモデルAcquity（Waters）で行った。カラムは1.8 μm HSS T3 C18（150×2.1 mm、Waters)流量は0.45 mL/min、溶離液は0.1%ギ酸を水（A）とアセトニトリル（B）に溶解したものを用いた。カラムは60℃、サンプルは15℃に保持した。UHPLC分離は、Aを100%で5分間、Bを0〜100%で1sで、Bを100%で2分間、Bを100%から0%で1分間、アイソクラティックで2分間という線形溶出グラジエントで行った。
HCyおよびMet（0〜3.2分）については、操作条件は、スプレー電圧+3.0kV、シースガス流量55,補助ガス流量20,キャピラリー温度320℃、キャピラリー+47.5V、チューブレンズ+110V、スキマー+20V、ヘザー温度120℃であった。取得は、範囲（m／z）+60〜180uのフルスキャンモードで行った。
MMAとSA（3.2-5分）の場合、操作条件は、スプレー電圧-3.0 kV、シースガス流量55,補助ガス流量20,キャピラリー温度320 °C、キャピラリー-35 V、チューブレンズ-70 V、スキマー-16 V、およびヒース温度120 °Cでした。取得は、範囲(m/z)-60〜130 u、ロックマスとして使用したギ酸二量体[2M-H]-に対応するm/z 91.0038のイオンをフルスキャンモードで行った。分離窓、自動利得制御目標、注入時間、質量分解能、エネルギー、衝突セル内のガスは、それぞれ±2ppm、1×106,100ms、50K、20V、N2であった。MSデータは、Xcaliburソフトウェア（Thermo Scientific）を用いて処理した。ピークの同一性を確認し、正確な質量とコリジョンセルで得られたフラグメントを評価した。検量線は、HCy、Met、MMA、およびSAについて、それぞれ0.15〜14.8,0.13〜33.5,0.17〜42.5,および0.25〜44μモルの範囲であった。最後に、ウェルネスパラメータをFedosov式[28]に従って計算した。”ウェルネスパラメータ」：w = log10(holoTCn) + log10(B12n) – log10(MMAn) – log10(HCyn) ここで、濃度は正規化されている（例えば、MMAn = MMA/MMAn normal）。
2.5 統計的分析
血清ビタミンB12濃度の有意差を検出するために、先行研究に基づいてサンプルサイズを推定した [23, 24, 25]。1群あたり16人の被験者は、補充後のビタミンB12レベルが少なくとも70%改善したことを示すのに十分であると考えられ、p値は0.05,検出力は80%であった。計算は、平均±標準偏差（SD）ベースラインのビタミンB12濃度が140±40μmol/Lであり、治療によりシアノコバラミンのレベルが240μmol/Lまで上昇するという仮定に基づいていた。この値は、イタリアの血液ドナー集団で見出された平均値を表している [4]。
すべての解析は、STATISTICAソフトウェア（StatSoft Inc. 結果は、平均±SDまたは平均の標準誤差（SEM）として表される。データは、Shapiro-Wilk 検定によって分布の正規性を検定した。正規分布した変数は、従属変数として治療法（350μg/週 vs 2000μg/週）および時間（0,15,30,60,および90日）を考慮した二元配置分散分析（ANOVA）で分析した。正規分布していないデータは、対数変換した。対数変換されたデータは、ノンパラメトリックFriedman 検定によって分析された。差は、p < 0.05で有意とみなされた;最小有意差検定を、治療法間の差を示すために、ポストホック分析と同様に適用した。統計的有意性のレベルは、p < 0.05で固定した。
3. 結果
3.1 調査集団のベースライン特性
各群に登録された被験者のベースライン特性を表1
に報告する。4人の被験者（各群2人）は、個人的な理由により追跡期間中に死亡した。すべての被験者（n = 36）は、ビタミンB12の限界的な欠乏（<220pmol/L）を示した[3]。コバラミンの状態の他のバイオマーカーについて：36人中27人が750nmol/L（コバラミン欠乏症と診断されるカットオフ）以上のMMAの血清レベルを有し、36人中14人が血漿中総ホモシステイン（HCy-pt）値が15μmol/L以上で中等度の高ホモシステイン血症（範囲17.6～33.8μmol/L）を記録した[3]。さらに、6人の被験者は葉酸値（範囲7～9nmol/L）が10nmol/L未満であり、葉酸欠乏症を示唆していた[29]。2人の被験者はビタミンB6の低値（<21.3 nmol/L）を示し、1人の被験者はまた、ホロトランスコバラミンの低値（<21 pmol/L）を有していた[3]。血球数の異常は認められなかった。年齢、性別、ヘモグロビン値、血小板・白血球数、平均コルプス容積、血清コバラミン値は群間で有意差はなかった（表1）。
表1試験開始時の被験者の特徴a
原文参照
3.2 コンプライアンス
被験者は介入への参加意欲が高く，錠剤の消費を確認した。コンプライアンスは、既報のように週1回の直接面接で確認し、空のブリスターを返却することで確認した（コンプライアンス100%）。補給後に副作用を宣言した参加者は一人もいなかった。
3.3 ビタミンB12の総体、活性型、不活性型の血清レベルに対するサプリメントの効果
ベースライン（時刻0日)およびサプリメント開始から15,30,60,90日後に測定した総ビタミンB12の血清濃度を図1に報告する。被験者は、我々の仮説に従って、総ビタミンB12の血清濃度を240pmol/L以上に増加させた。全体として、反復測定ANOVAでは治療の有意な効果は認められなかったが、治療後に増加した総ビタミンB12の循環濃度については、時間（P = 0.008）および時間×治療の相互作用（P = 0.012）の有意な効果が認められた。特に、ポストホック分析では、サプリメント摂取開始から15日後に有意な増加が認められた（Ld群で+51.7%、Hd群で+74.2%;P < 0.0001）。この値は時間の経過とともに増加し、実験期間終了までの30日後には群間で有意に異なるように見えた（P＜0.01）。図2AおよびBは、ベースラインで測定したビタミンB12の活性型(ホロトランスコバラミン、（HoloTC)（2A）および不活性型(2B)のレベルを、補給開始から15日および90日後に示している。15日後および90日後の分析は、ビタミンB12で観察された顕著な吸収に基づいて行われた。全体として、ANOVAでは、治療と時間×治療の相互作用は有意な効果を示さなかったが、治療中に増加した活性型および不活性型ビタミンB12の血清循環レベルに時間の効果（P < 0.0001）が認められた。
図2 2つの介入群（Ld vs Hd）における総ビタミンB12の血清循環濃度に対するサプリメントの効果
濃度は、ベースライン（T0）および15,30,60,90日後に測定した。各群のN=18人。a,b,c,d,e文字の異なるデータは、同一治療法内で有意差を示す（時間効果;P < 0.05）。∗,§,#記号の異なるデータは治療法間で有意に異なる(治療効果; P < 0.05)。
3.4 メチルマロン酸およびホモシステインの血清レベルに及ぼすサプリメントの影響
MMAおよびHCyの血清レベルは、ベースライン（時間0日）およびサプリメントの開始から15,30,60および90日後に測定され、図3AおよびBに報告されている。ANOVAは、両方の治療法に続いて時間の経過とともに減少したMMAおよびHCyの血清循環レベルの時間の有意な効果（P < 0.0001）のみを明らかにした（図4を参照）。
図3 2つの介入群（Ld vs Hd）におけるビタミンB12の活性型（A）と不活性型（B）の血清循環濃度に対するサプリメントの効果
濃度は、ベースライン（T0)およびサプリメント投与から15日後と90日後に測定した。データは平均±SEMで表した。各群のN=18名。
大きな画像を見る 図ビューアを を(PPT)
図のサムネイルgr4
図4 2つの介入群（Ld vs Hd）におけるMMA（A）およびtHcy（B）の血清循環レベルに対するサプリメントの効果
濃度は、ベースライン時（T0）とサプリメント投与から15日後と90日後に測定した。各群のN=18。データは、平均±SEMとして表される。MMA、メチルマロン酸;tHcy、総ホモシステイン。
3.5 メチオニン、コハク酸、ビタミンB6,葉酸の血清濃度、血球数、ウェルネスパラメータに及ぼすサプリメントの影響
ベースライン（時間0日）で測定したMet、SA、ビタミンB6,および葉酸の血清レベルは、補給開始から15日、30日、60日、および90日後に測定し、表2に報告されている。ANOVAは、葉酸（P < 0.0001)Met（P < 0.0001）およびSA（P < 0.0001）の血清循環レベルの時間の有意な効果のみを明らかにした。特に、葉酸は経時的に有意な減少を示したが、MetとSAは有意な増加を示した。
表2ビタミンB6,葉酸、メチオニン、コハク酸、ウェルネスパラメータ（n = 18）1の血清レベルに対するビタミンB12補充（Ld vs Hd）の効果。
変数は、ベースライン（T0）で、補充から15,30,60,90日後に測定した。Ld、低用量、Hd、高用量。
P値は、治療、時間、および全体的な二元配置ANOVAでの治療と時間の間の相互作用に対応している。
a,b,c 異なる文字を持つデータは、治療の間および治療の間で有意に異なる。
1 データは平均値±SDで表す。
表2では、ベースライン（時刻0日）で測定したウェルネスパラメータの値と、サプリメント開始から15日後と90日後に測定したウェルネスパラメータの値が報告されている。指標は、ホロTCのレベルも考慮した式に由来するので、このパラメータは、ホロTCのレベルが検出された時間にのみ測定された。全体として、反復測定ANOVAは治療の有意な効果を示さなかったが、時間の有意な効果（P < 0.0001）と時間×治療の相互作用（P = 0.046）を明らかにした。特に、ポストホック分析では、特定の独立した時点でのみグループ間の差があり、両方のサプリメントを摂取した後の時間の経過とともに有意な改善が文書化された。
ビタミンB6の血清循環レベルと血球数には効果は認められなかった（データは示されていない）。
4. 考察
本研究では、菜食主義者と菜食主義者のグループにおけるコバラミンの限界的な欠乏を是正し、ホロTC、MMA、およびHCy（コバラミンの状態のバイオマーカー）を改善するためには、週350μgのビタミンB12の補給が十分であることを文書化した。得られた結果は、このターゲット集団におけるコバラミンの状態を改善するための効果的で非侵襲的な方法として、低用量の舌下サプリメントの使用を支持するものである。
サプリメントからのビタミンB12の吸収は、摂取量や頻度だけでなく、対象者の健康状態にも依存することが報告されている。特に、胃や小腸の切除、炎症性腸疾患、その他の腸管吸収に関連する合併症を有する被験者では、不足する可能性があることが広く認識されている[30]。さらに、吸収能力は、可飽和活性輸送および特異的経路の効率に厳密に依存している。この点に関して、様々な研究により、導入量が少ない場合にビタミンB12の吸収能が高いことが示されている。例えば、異なる用量（1μg、10μg、50μg、500μg、1000μg）のビタミンB12の経口投与では、それぞれ56%、16%、3%、2%、1.3%の効率で吸収されることが示されている[31]。ビタミンB12と関連する心血管マーカーのレベルにサプリメントの効果を調査した研究の茄多;しかし、それらのほとんどは、高齢者[6]、高ホモシステイン血症[32,33]と栄養不足の子供[34,35]で行われ、非常に少数のベジタリアンおよび/または菜食主義者が関与している間。菜食主義者を対象とした最近の12週間の無作為化プラセボ対照試験では、ビタミンB12強化歯磨き粉（歯磨き回数に応じて約100μg/g）の使用により、コバラミンおよび関連するマーカーの血清および血漿中濃度が改善されたことが報告されている[36]。Yajnikら[25]は、ビタミンB12（500μg/日）を6週間にわたって補給すると、健康なラクト・ベジタリアン女性のグループにおいて、血漿中ビタミンB12濃度（125から215pmol/L）が有意に上昇することを発見した。改善は介入後2週間以内に観察され、レベルは4週間まで安定していた。Sharabiと共同研究者は、B12欠乏症の被験者に500μgのコバラミンを舌下および経口投与した後に同様の所見を文書化した[37]。
我々の実験条件では、コバラミンの低用量および高用量（350μg/週 vs 2000μg/週）の補充は、ビタミンB12の循環血清レベルを有意に改善し、ビタミン（> 240 pmol/L）のレベルを回復するために両方のサプリメントの効率と有効性を示唆している[3]。しかし、カットオフポイントを超えるビタミンB12の血清レベルは、必ずしも十分な栄養状態を示しているとは限らない。実際、シアノコバラミンの基準値の特定に関しては、科学者の間で矛盾がある。今後の研究では、個人差（年齢、性別など）や生活習慣（菜食主義者、ベジタリアンなど）に応じてカットオフ値を特定する必要がある。ホロトランスコバラミンは、コバラミンを標的細胞に届けるビタミンB12の代謝活性型を表する。最近では、コバラミンの状態異常を識別するための早期かつ信頼性の高いマーカーとして認識されている[38]。しかし、欠乏症を診断するためにこれらのカットオフ値をどのように適用し、どのように割り当てればよいのかについては意見の相違が残っている。さまざまな集団や基準に基づいて、21～45pmol/Lのカットオフ値が「最適ではない」と提案されている [3]。我々の研究では、被験者は正常範囲内のホロTCのレベルを示した。これは、限界的なコバラミン欠乏症を持つ個人のみを含む我々の集団の特性と一致している。両方の用量での補足は、有意にホロTCのレベルを増加させた。治療法の効果ではなく、時間の効果のみが観察されたため、改善はグループ間で比較可能であった。ビタミンB12の補給がホロTCのレベルに与える影響は、さまざまな研究で評価されている[39, 40]。プラセボ対照二重盲検試験では、1000μgのビタミンB12または1000μgのビタミンB12+400μgの葉酸を12週間および24週間補充すると、高齢者被験者におけるホロTCのレベルと同様にコバラミンのレベルが有意に上昇した[39]。Britoら[40]は、チリの高齢者27人を対象に、10mgのビタミンB12（100mgのピリドキシンと100mgのチアミンを含む）を1回の筋肉内注射で、4ヵ月後に血清ビタミンB12とホロトランスコバラミンのレベルが有意に上昇したことを報告している。
コバラミンの状態を示す他のバイオマーカーには、血液学的変化、代謝物であるMMAとHCyが含まれる。これらの変数は、B12ステータスの評価のための血清ホロTCおよび/またはコバラミンと組み合わせて、貴重な情報を追加することができる。MMAは、メチルマロニル-CoAムターゼの機能における役割に関して、コバラミン機能のバイオマーカーと考えられている。血清MMA濃度は、コバラミンの供給が不足すると上昇する。以前に報告されたように、750nmol/L以上の値はコバラミン欠乏を識別するために使用される[3]。
血漿中HCyは、葉酸、コリンおよびベタインなどの食事因子、ならびに腎不全、生活様式因子（例：アルコール消費）および年齢にも影響を受けるため、コバラミンの状態の特異的なマーカーではない [41,42,43]。しかし、血漿HCy濃度の上昇は、コバラミン欠乏症の被験者では一般的に観察される。我々の実験条件では、ほとんどの被験者がカットオフ値を超えるMMAおよびHCyのベースラインレベルを示したが、葉酸の低レベルを示した被験者はわずかであった。これらの理由から、これらのバイオマーカーは、葉酸、ビタミンB6,MetおよびSAのレベルとともに、菜食主義者および菜食主義者におけるコバラミンの栄養状態の評価のための有効なサポートと考えることができる。実際、我々はMMAとHCyのレベルが統計的に有意に減少し、MetとSAのレベルが有意に増加したことを文書化することができた。これらの結果は、コバラミン補給後の一般的な改善を示す他の著者によって得られたものと一致していた[25, 35, 39, 41]。コバラミンの栄養状態の改善およびHCyおよびMMAの低下は、心血管リスクおよび神経障害の予防にも有効であるかもしれない。しかし、いくつかの研究では、HCyレベルの有意な変調を観察することができなかった。例えば、Sharabiら[37]は、コバラミン欠乏症の被験者に500μg/日の舌下および経口B12投与による介入を8週間行った後のHCyおよびMMAの低下を文書化していない。
以前に報告されたように、ビタミンB12と葉酸との間には相互関係がある;特に、ビタミンB12欠乏はメチオニン合成酵素のレベル低下をもたらし、その結果、葉酸欠乏が生じ、5-メチル誘導体の割合が増加する。私たちの実験条件では、5-メチル誘導体のレベルを定量しなかったが、有意に減少した葉酸のみコバラミン補充後。これらの結果を説明するのは複雑である。B12状態の改善は、MMAおよびHCyの観点からも、コバラミン欠乏を補うために多量の葉酸を必要としなかったのではないかという仮説が立てられるかもしれない。しかし、全体的なビタミン状態が正常範囲内に維持されていたため、これらの変動が主に生理的変化に起因するものであることを排除することはできない。
シアノコバラミンの状態を示す最近の頑健な生化学的指標は、Fedosovによって考案されたウェルネスパラメータであり、総B12形および活性B12形のレベルとMMAおよびHCyのレベルを考慮に入れている[28]。ウェルネスパラメータを識別するためのカットオフは、欠乏度w = -1.49,移行度w = -0.516,正常度w = -0.0,優秀度w = +0.445となっている。ビタミンB12の補給により、両群ともにウェルネスパラメータは有意に改善した。
最後に、血球数については、研究開始時（表1参照）と介入後の両方で有意な効果は認められなかった（データは示されていない）。我々の被験者はビタミンB12欠乏症のステージ2-3であり、この状態は平均コルプスキュラーボリュームとヘモグロビンのレベルに影響を与えないので、これらの結果は驚くべきことではない[42]。
5. 研究の限界
この研究の限界として考えられるのは、実際の対照群（サプリメントを摂取していない限界欠乏症の菜食主義者/菜食主義者）がないことである。しかし、私たちの被験者が限界的なビタミンB12欠乏症の影響を受けていたことを考慮すると、倫理的な理由から、本物のプラセボ群（サプリメントを摂取していない菜食主義者/菜食主義者）を含めることは不可能であったであろう。この研究の第二の限界は、ビタミンB12と関連する代謝マーカーのレベルの変化を検証するために、サプリメント摂取後のフォローアップ期間がないことである。
6. 結論
結論として、得られた結果は、両方のサプリメントがビタミンB12のレベルを限界的な欠乏状態から適切な栄養状態に持っていくことができたことを示している。特に、ビタミンB12およびホロTCの血清濃度の上昇、およびビタミンB12代謝のマーカーとしてのMMAおよびHCyの減少を文書化した。これらの結果は、栄養学的ビタミンB12の状態の改善をさらに支持するウェルネスパラメータの上昇と一致している。
我々の観察は、限界欠乏症の菜食主義者および菜食主義者における補充の重要性を強調しているが、このターゲットグループでは薬理学的用量の使用は不要であることを強調すべきである。さらに、ビタミンB12のカットオフ値に関するコンセンサスがなく、個人差が大きいことから、菜食主義者や菜食主義者の真のニーズを特定することは困難である。我々の知見を確認し、重度の欠乏症を持つ菜食主義者やベジタリアン、およびビタミンB12の吸収不良や代謝障害の影響を受けている人々の舌下補給の効果を検証するためには、さらなる研究が必要である。