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Antibiotic ivermectin preferentially targets renal cancer through inducing mitochondrial dysfunction and oxidative damage
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28847725/
2017年8月24日に受諾
要約
腎細胞癌（RCC）は泌尿器系癌の中でも最も侵攻性の高い癌であり、現在利用可能な治療法に対して非常に抵抗性が高い。本研究では、抗寄生虫剤イベルメクチンの腎細胞癌に対する効果とそのメカニズムを検討した。その結果，イベルメクチンは，組織型や変異の状態が異なる複数の腎細胞癌細胞株において，増殖を有意に抑制し，アポトーシスを誘導することを明らかにした。
重要なことに、イベルメクチンは腎細胞癌細胞と比較して正常腎臓細胞では有意に少ないか、または効果がないことが示され、腎細胞癌に対するイベルメクチンの優先的な毒性が示された。イベルメクチンはまた、生体内で腎細胞癌腫瘍の増殖を有意に阻害する。
メカニズム的には、イベルメクチンはミトコンドリア膜電位、ミトコンドリア呼吸、ATP産生を低下させることでミトコンドリア機能不全を誘導する。ミトコンドリア機能障害の結果として、イベルメクチン処理した腎細胞癌細胞と異種移植マウスモデルにおいて、酸化ストレスと損傷が検出された。
アセチル-L-カルニチン（ALCAR、ミトコンドリア燃料）や抗酸化物質N-アセチル-L-システイン（NAC）によるイベルメクチンの効果の救済は、腎細胞癌細胞におけるイベルメクチンの標的がミトコンドリアであることを確認した。
腎細胞癌細胞は正常腎臓細胞と比較してミトコンドリアの質量、呼吸、ATP産生が高く、これがイベルメクチンの腎細胞癌に対する優先的な毒性を説明している可能性がある。以上の結果から、イベルメクチンは腎細胞癌治療の有望な候補であり、ミトコンドリア代謝を標的とすることが腎細胞癌の代替治療法であることが示唆された。
1. はじめに
腎細胞がん（腎細胞癌）は、ネフロンの近位尿細管由来の上皮性腫瘍であり、化学療法および放射線療法に抵抗性である [1,2]。転移性腎細胞癌患者の臨床転帰は標的治療によって有意に改善されたが、患者は病勢が進行すると再発することがある[3]。したがって、手術後に再発した患者や転移性腎細胞癌患者に対しては、新規で効果的な治療戦略が必要とされている。最近の研究では、多くの癌が成長と生存のためのエネルギー需要を満たすために酸化的リン酸化に高度に反応していることが示されている[4,5]。分化した腫瘍細胞と比較して、腫瘍幹細胞は解糖よりもミトコンドリア代謝に依存している[6]。これらはすべて、ミトコンドリア代謝に対する癌細胞の特異的な依存性が治療的に利用できることを示唆している。
イベルメクチンは、ヒトにおける薬理学、安全性、毒性のプロファイルが知られている抗寄生虫剤である。イベルメクチンは、ストロンギロイダ症、オンコセルカ症、およびその他のワーム感染症の治療のために認可されている [7]。イベルメクチンは、線虫の塩化物イオンチャネルに結合して活性化することで寄生虫を死滅させる [8]。最近、様々な癌（卵巣癌、白血病、膠芽腫など）に対するイベルメクチンの抑制効果が実証されており、その作用機序には、WNT-TCF経路の阻害、発癌性キナーゼPAK1の不活性化、P2X4受容体の調節などが含まれている[9e12]。また、NS3ヘリカーゼ活性を標的としたフラビウイルスの複製を阻害することも知られている[13]。
我々の研究では、腎細胞癌細胞株を用いて、イベルメクチンが試験管内試験で腎細胞癌に対して優先的な活性を示し、臨床的に達成可能な濃度で生体内試験で腫瘍の増殖を遅らせることを実証した。メカニズム的には、イベルメクチンはミトコンドリア機能不全を誘導し、エネルギー危機と酸化ストレスを引き起こす。さらに、腎細胞癌細胞は正常な腎臓細胞よりもミトコンドリアの生合成とATPレベルが高く、これが腎細胞癌に対するイベルメクチンの優先的な毒性に寄与している可能性がある。
2. 材料と方法
2.1. 細胞と薬
ヒト腎細胞癌（腎細胞癌）細胞株、SW-839,Caki-2,786-O、A-498およびACHNをAmerican Type Culture Collectionから購入し、10%ウシ胎児血清（Hyclone、UK）および2mM L-グルタミン（Invitrogen）を添加したRPMI 1640培地で培養した。HRPT（ヒト腎近位尿細管)HRE（ヒト腎上皮)HRCE（ヒト腎皮質上皮）を含むヒト正常腎細胞をLona, Inc.から購入し、血清を添加したヒト腎臓一次細胞培養培地（Celprogen, US）で培養した。イベルメクチン（Abcam, US)アセチル-L-カルニチン（ALCAR; Sigma, US）及びN-アセチル-L-システイン（NAC, Sigma, US）をDMSOに溶解した。
2.2. 細胞増殖およびアポトーシスアッセイ
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit (Abcam, US)を用いた増殖活性分析の前に、細胞を72時間薬剤で処理した。APOSTRAND™ ELISA アポトーシス検出キット(Enzolifesciences Inc. US)を用いたアポトーシス分析の前に、細胞を24時間薬剤で処理した。
2.3. ATP、活性酸素、酸化的DNA損傷の測定
ATPレベルは、ATP Bioluminescence Assay Kit HS II (Roche) ac-cordingメーカーの指示に従って測定した。活性酸素レベルは、10 mM CM-H2DCFDA（アメリカ食品医薬局）（Life Technologies, US）で処理した細胞を37℃で1時間インキュベートすることにより測定した。DNEasy Mini Kit (Qiagen, US) を用いて DNA を抽出し、OxiSelect Oxidative DNA Damage ELISA Kit (Cell Biolabs) を用いて 8-ヒドロキシ-20-デオキシグアノシン (8-OHdG) 量を定量した。450 nm での吸光度は Spectramax M5 マイクロプレートで測定した。
2.4. ミトコンドリア膜電位の測定
その後、細胞を5,50 ,6,60 -テトラクロロ-1,10,3,30 -テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物（JC-1, Invitrogen）で30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、染色した細胞をPBSに再懸濁し、Beckman Coulter FC500を用いてフローサイトメトリーで分析した。分析はFlowJoバージョン7.7.1（TreeStar、Ashland、OR）を用いて行った。
2.5. ミトストレスアッセイ
酸素消費率（OCR）は、製造者の指示に従って、シーホースXF24細胞外フラックスアナライザー（シーホースバイオサイエンス、米国）上のミトストレスアッセイキットを使用して測定した[14]。24時間の薬物処理後、細胞培地を、CO2を含まないインキュベーター中で37℃で、非緩衝化XFアッセイ培地（Seahorse Bioscience、US）に交換した。細胞を Seahorse XF24 細胞外フラックス分析装置に移し、基底状態で、ミトコンドリア阻害剤であるオリゴマイシン（0.5 mM）またはアンチマイシンA（0.25 mM）の存在下で、またはミトコンドリアアンカプラーFCCP（0.5 mM）の存在下で、ミトコンドリア呼吸の最大値を評価するために分析を行った。
2.6. ミトコンドリアの質量測定
ゲノムDNAは、DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, US)を用いて細胞から抽出した。相対的なミトコンドリアDNA(mtDNA) ND1コピー数をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)により決定し、以前に記載されたようにプライマーを用いて核内DNA(HGB-1)と相対的に比較した[15]。ミトコンドリア質量は、ミトトラッカーグリーン（Invitrogen, US）で細胞を30分間染色することによって決定し、その後、フローサイトメトリーを用いて分析した。中央値の蛍光強度を、ミトコンドリア質量の推定値としてフォワード散乱測定で割った。
2.7. SCIDマウスの腎細胞癌キセノグラフトと免疫組織化学
すべての動物実験は、長江省のInstitu-tional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。SCIDマウス（上海実験動物センター、中国科学院）に106 786-0細胞とMatrigel（BD Biosciences）の混合物100mlを接種した。触知可能な腫瘍の発生に続いて、マウスをビヒクルコントロールとイベルメクチンを5mg／kg／日で腹腔内投与した。4週間の治療後に腫瘍を分離した。腫瘍切片のスライドを4%パラホルムアルデヒドで固定し、抗HEL抗体（Santa Cruz, US）でインキュベートし、次いでワサビペルオキシダーゼ-DAB（3，30-ジアミノベンジジン）と共役した第二抗体を用いた。核をヘマトキシリンで染色した。染色の定量はImage Jソフトウェアを用いて行った。
2.8. 統計解析
データは平均および標準偏差（SD）で表される。統計解析は、無対のStudentのt検定を用いて行い、p値<0.05を統計的に有意とみなした。
3. 結果
3.1. イベルメクチンは腎細胞癌を選択的に標的とし、正常な腎臓細胞を温存する
腎細胞癌におけるイベルメクチンの効果を解析・確認するために、SW-839,Caki-2,786-O、A498およびACHNなどの腎細胞癌細胞株を用いて、薬剤投与後の増殖およびアポトーシスアッセイを行った。これらの細胞株は、透明細胞と乳頭状腎細胞癌の最も多いサブタイプを示し、異なる病期（原発性とメタスタティック）を示している。さらに、これらの細胞株は遺伝的に異なり、VLH、cMET、TP53,その他の変異を含む様々な癌の変異状態を有している[16]。また、イベルメクチンが腎細胞癌と正常腎臓細胞の間で優先的選択性を有するかどうかを決定するために、HRPT（ヒト腎近位尿細管)HRE（ヒト腎上皮)HRCE（ヒト腎皮質上皮）を含む正常腎臓細胞に対するイベルメクチンの効果を分析した。その結果、イベルメクチンは、5,10,15mM の用量依存的な方法で、すべての試験を行った 腎細胞癌 細胞株の増殖とアポトーシスを有意に抑制し、IC50 の範囲は 3e10mM であった（図 1）。一方、15mM のイベルメクチンは、5mM や 10mM ではなく、15mM 以上の IC50 で HRPT, HRE, HRCE 細胞の増殖とアポトーシスを有意に抑制した（図 1）。これらの結果から、イベルメクチンは正常腎細胞と比較して、腎細胞癌細胞に対して優先的に細胞毒性を示すことが示された。
3.2. イベルメクチンは腎細胞癌のミトコンドリア機能障害と酸化ストレスを誘導する
イベルメクチンの抗癌活性の分子機構は、WNT-TCF経路の阻害、発癌キナーゼPAK1の不活性化、P2X4受容体の調節を介していることが報告されており[10,11,17]、その基礎となる機構は癌の種類によって異なることが示唆されている。特筆すべきは、イベルメクチンはNS3ヘリカーゼ活性を特異的に標的とするフラビウイルス複製の強力な阻害剤であることである[13]。DNAまたはRNAの複製を事前に阻害する多くの駆虫薬または抗生物質は、哺乳類細胞のミトコンドリアを標的としている[11,24]。我々は、腎細胞癌のミトコンドリアがイベルメクチンの標的であるかどうかを調べた。
イベルメクチンは、JC-1染色のフローサイトメトリーで評価されるように、ミトコンドリア膜電位を用量依存的に低下させることがわかった（図2A）。また、イベルメクチンは酸素消費量の基底値および最大値を有意に抑制し（図 2B および C)イベルメクチンが 腎細胞癌 細胞のミトコンドリア呼吸および呼吸能力を抑制することを示した。次に、イベルメクチン処理細胞における呼吸阻害に対する応答として、ミトコンドリア呼吸と解糖の時間経過（2,6,12,24時間）解析を行った。イベルメクチンは、2時間の処理から時間依存的にミトコンドリア呼吸を有意に減少させることを見出した（補足図S1AおよびB）。一方、解糖能と予備量は6時間処理で増加したが、24時間処理では減少した（補足図S1CおよびD）。このことは、イベルメクチンによるミトコンドリア呼吸阻害が第一の効果であり、解糖レベルの変化が第二の効果であることを示唆している。イベルメクチン処理した腎細胞癌細胞では、一貫してATPレベルの有意な低下が検出された（図2D）。さらに、イベルメクチンは細胞内の活性酸素と8-OHdGレベルを有意に増加させた（図2E、F）ことから、腎細胞癌細胞における酸化ストレスとDNA損傷の増加が示唆された。アセチル-L-カルニチン（ALCAR）はミトコンドリアの生合成を刺激し、ミトコンドリア燃料として知られている[18]。我々は、ALCARまたは抗酸化剤NACが、腎細胞癌の増殖および生存に対するイベルメクチンの阻害効果を廃止することを発見した（図2GおよびH）。これらのデータは、イベルメクチンがミトコンドリアの機能不全を誘導し、エネルギー危機と酸化ストレスを引き起こすことを介して腎細胞癌に作用することを確認した。
3.3. 腎細胞癌細胞は、正常な腎臓細胞よりもミトコンドリアの生合成が増加している
我々のこれまでの結果は、腎細胞癌細胞が正常腎臓細胞よりもイベルメクチンに対して感受性が高く、腎細胞癌細胞ではミトコンドリアがイベルメクチンの標的となっていることを示している。我々は、腎細胞癌細胞と正常腎臓細胞の間でミトコンドリア生合成のベースラインレベルが異なっているという仮説を立てた。腎細胞癌のミトコンドリア膜電位と質量、ミトコンドリア呼吸を正常腎臓細胞と比較して測定した。腎細胞癌と正常腎臓細胞（HRPT、HRE、HRCE）では、安静時のミトコンドリア膜電位に有意な差は見られなかったが（図3A)細胞のエネルギー需要量の推定に用いられるミトコンドリア質量とmtDNAコピー数は、腎細胞癌の方が正常腎臓細胞よりも高い値を示した（図3B、C）。さらに、腎細胞癌細胞では、基底値、最大酸素消費量、ATPレベルが正常腎臓細胞よりも高くなってた（図3D～E）。これらのデータは、腎細胞癌細胞が正常腎臓細胞よりも高いレベルのミトコンドリア生合成を有していることを示唆している。
3.4. イベルメクチンは生体内試験で腎細胞癌腫瘍の増殖と酸化ストレスを有意に阻害する
腎細胞癌 における有効性と分子機構をさらに確認するために、SCID マウスの脇腹に 786-O 細胞を皮下注射することにより 腎細胞癌 異種移植マウスモデルを作成し、イベルメクチンの生体内での効果を調べた。イベルメクチンを5mg／kg／日の腹腔内注射で4週間投与しても、マウスの体重、外観および行動で評価されるような毒性は認められなかった（図4Aおよびデータは示していない）。しかし、イベルメクチンは治療期間中ずっと腫瘍の成長を強力に抑制し、27日目にはイベルメクチン投与群の腫瘍体積は対照群に比べて有意に小さくなった（図4B〜C）。さらに、酸化ストレスマーカーHELの免疫組織化学分析により、イベルメクチンは腫瘍の酸化ストレスレベルを増加させることが示された（図4EおよびF）。これらの結果は試験管内試験のデータと一致しており、腎細胞癌におけるイベルメクチンの有効性と生体内試験での酸化ストレス誘導能が確認された。
4. 考察
腎細胞癌のより良い臨床管理のためには、新しい治療戦略が必要である。薬物の再利用は、その迅速なトランスレーショナル・ポテンシャルのため、魅力的なアプローチとなっている。抗 腎細胞癌 活性を有する既知の薬剤を同定するために、我々は薬剤のライブラリを作成し、増殖およびアポトーシスアッセイを用いて複数の 腎細胞癌 細胞株でこのライブラリをスクリーニングした。このスクリーニングの結果、イベルメクチンは最も強力なFDA（アメリカ食品医薬局）承認薬であり、正常な腎臓細胞を温存しながら腎細胞癌細胞に優先的に毒性を示すことがわかった。
イベルメクチンの試験管内試験での有効性を実証するために、異なる組織学的サブタイプと突然変異の状態をカバーする5つの腎細胞癌細胞株を選択した。イベルメクチンは、低マイクロモル濃度ではすべての試験対象細胞株の増殖を有意に抑制し、アポトーシスを誘導した（図 1）。また、5mg/kg/日のイベルメクチンは、生体内での腎細胞癌腫瘍の増殖を有意に遅延させた（図4BeD）。イベルメクチンは抗寄生虫薬であるが、その抗がん作用は多くの前臨床モデルで様々ながんで実証されている[9e12]。また、イベルメクチンは白血病に対しても抑制効果を示す可能性があることが臨床研究の事例報告から示唆されている[20]。これまでの研究と同様に、イベルメクチンの抗腎細胞癌活性を実証したのは我々が初めてである。重要なことに，イベルメクチン 200 μg/kg を単回投与して寄生虫を駆除した患者では，血漿中濃度 3 μg/ml が達成されており[7]，イベルメクチンの抗 腎細胞癌 濃度は薬理学的に達成可能である可能性が高いことが示唆された。
同濃度では、イベルメクチンは正常な腎臓細胞では有意に効果が低い（図1）。また、抗腎細胞癌活性を有するイベルメクチンの濃縮物は、マウスにおいて良好な忍容性を示している（図4A）。これは、1.6mg/kgのイベルメクチンを週2回、最大12週間投与しても毒性がなく、6gのイベルメクチンを1年かけて50回投与してもイベルメクチンによる毒性が認められなかったという報告と一致している[21,22]。我々の研究は、これまでの報告を支持し、イベルメクチンの潜在的な治療範囲が広いことを示唆している。
メカニズム的には、イベルメクチンはミトコンドリアの機能障害を誘導することで腎細胞癌を標的としていることが示唆された。イベルメクチンはミトコンドリア膜電位を有意に低下させ、ミトコンドリア呼吸を阻害し、2つの腎細胞癌細胞株においてATP枯渇と酸化ストレスを引き起こした（図2AeF）。ミトコンドリア燃料であるALCARや抗酸化剤NACは、イベルメクチンの阻害効果を逆転させ（図2G、H)腎細胞癌細胞におけるイベルメクチンの標的がミトコンドリアであることをさらに確認した。さらに、腎細胞癌細胞は正常腎臓細胞に比べてミトコンドリアの生合成とATP産生が高いことを示した（図3）。この知見は、腎細胞癌細胞のイベルメクチン処理に対する優先的な毒性を説明している可能性がある。多くの癌（白血病、リンパ腫、乳癌など）は、正常細胞よりも代謝が活発でミトコンドリア機能に応答して増殖や生存に関与するため、ミトコンドリアを標的とした薬剤に対して正常細胞よりも感受性が高いことが研究で示されている[15,23,24]。さらに、これらの薬剤は正常細胞への毒性が少なく、抗がん剤治療の副作用を軽減する可能性がある[23,25]。我々の研究はこれまでの研究と一致しており、ミトコンドリアの生合成と代謝が腎細胞癌の増殖と生存に必要であることを証明している。
結論として、抗寄生虫薬イベルメクチンが腎細胞癌を優先的に標的とすることを初めて報告した。イベルメクチンの抗腎細胞癌活性は、ミトコンドリア機能を阻害し、酸化ストレスを誘発することに起因する。腎細胞癌におけるイベルメクチンの選択的有効性は、腎細胞癌の代謝活性が高いことに起因しており、ミトコンドリア機能障害を誘導することは、腎細胞癌を標的とする新しい方法であることを示している。イベルメクチンの薬理学的および薬機学的プロファイリングが知られており、腎細胞癌における前臨床試験での有効性を考慮すると、イベルメクチンは有望な候補であり、腎細胞癌の標準治療との併用療法として評価される可能性がある。