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When is mRNA not really mRNA?
rwmalonemd.substack.com/p/when-is-mrna-not-really-mrna?s=r
シュードウリジンとは何か、なぜ注入されるのか、そしてなぜ気にする必要があるのか
ロバート・W・マローン医学博士、MS
3月29日
「千の太陽の輝きが一度に空に炸裂するならば、それは強大な者の輝きのようなものである」「 今、私は世界の破壊者である死となった」
J. ロバート・オッペンハイマー（マンハッタン計画科学部長）（バガヴァッド・ギーターより引用
昨年1月、スチュワート・ピーターズ氏は、一過性の「遺伝子治療」法として合成mRNAを使用するアイデアを開発し実践に移した私の先駆的な仕事の結果として、COVID-19 mRNAワクチンによる罹患と死亡の責任は私にあるとの論文を展開することにした。 このことは、これらのmRNAワクチンに関連する嘘や有害事象について、誰かのせいにしようとする多くの怒れるソーシャルメディア上の論者によって反響を呼んだ。 このSubstackのエッセイでは、このような批判を念頭に置き、当初想定されていたものと、現在我々の身体に注入されている分子との違いに焦点を当てる。このエッセイの最初のセクションでは、遺伝子治療という考え方がどのように発展してきたかを（一般読者向けに）要約し、それが薬としてのmRNAやワクチン反応を起こす方法という考え方にどのように、そしてなぜつながっていったかを説明することで、舞台を整えている。第2章はかなり専門的で、科学者向けの詳細な情報を提供している。結論は、一般読者向けに書かれている。
遺伝子治療、トランスヒューマニズム、そして薬物やワクチンとしてのmRNAの起源
1987年から1989年にかけての私の仕事から生まれた9つの特許の核となる考え方は、1972年にリチャード・ロブリン博士と学術小児科医のセオドア・フリードマン博士が最初に思い描いた永久「遺伝子治療」の考え方に、複数の重要な問題があるというものであった。 この概念の現代的な具体化は、「トランスヒューマニズム」やCRISPR/Cas9遺伝子編集技術の使用に関するWEFやその他の多くの著作に見ることができる。 これらのことを本当に理解するためには、「遺伝子治療」の歴史と論理を簡単に旅することが必要である。
2015年1月のUCサンディエゴニュースの中心記事「Friedman Recognized for Pioneering Gene Therapy Research」と題する記事。School of Medicine professor received prestigious Japan Prize」と題された記事には、フリードマンとロブリンが構想した「遺伝子治療」の根底にある論理がうまくまとめられている。
フリードマンとロブリンは、「良いDNA」を使って、遺伝性疾患を持つ人々の欠陥DNAを置き換えることができると示唆する新たな考え方、新しい研究、データの増加を挙げ、質問として出されたものの、その答えはイエスであると固く信じている。
「我々の考えでは、遺伝子治療は将来的にヒトの遺伝性疾患を改善する可能性がある」と彼らは書いている。このため、遺伝子治療のための技術開発に向けた研究は継続されるべきであると考える” と書いている。
フリードマンによれば、この論文に対する最初の反応は「圧倒的なものではなかった」が、今では、この論文は遺伝子治療研究の科学的始まりにおける重要なマイルストーンとしてよく知られている。
遺伝子治療のアイデアは、瞬く間に人々の想像力をかきたて、その魅力的でわかりやすいアプローチと、フリードマンが「明白な正しさ」と表現するものによって後押しされた。病原性のあるウイルスを不活性化し、良性化する。このウイルスの粒子に正常なDNAを詰め込む。そして、そのウイルス粒子を異常な遺伝子を持つ患者に注射し、欠陥のある標的細胞の中に治療材料を送り込む。理論的には、正常なDNAは欠陥のある遺伝子の異常な機能を置き換える、あるいは修正し、以前は障害があった細胞を完全で正常かつ健康な状態にする。病気は治る。
素晴らしい理論だ。何が間違っているのか？ この記事はこう続ける。
「1968年、メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所で、故ジェイ・ゼグミラー（医学部の創設メンバー）らと研究していたフリードマンは、レッシュ・ナイハン症候群の患者の培養細胞に外国のDNAを加えることによって、稀ではあるがこの破壊的な神経障害を引き起こす遺伝子欠陥を修正できることを明らかにした。この疾患は、1964年にカリフォルニア大学サンディエゴ校の小児科教授であるウィリアム・ナイハン医学博士と医学生マイケル・レッシュによって初めて報告されたものである。
この偉業は強力な概念実証となったが、その後、この研究をヒトの臨床試験に進めようとする努力は行き詰まった。1969年に医学部の教授になったフリードマンは、「このアイデアを人に応用するのは、非常に難しいことだと思い始めた」と語った。
1990年、アデノシドデアミナーゼ（ADA）欠損症と呼ばれる先天性疾患を持つ4歳の少女が、遺伝子治療による最初の患者となった。この少女から白血球を採取し、正常なADA遺伝子を操作して無効化したウイルスで挿入し、細胞を再注入した。当初は成功したと言われたが、結局この実験は失敗に終わったとフリードマン氏は言う。この少女の病気は治らず、研究成果も不十分であることが判明した。
国立衛生研究所のハロルド・バーマス所長から依頼された報告書は、遺伝子治療分野全体と特にADAの取り組みを厳しく批判し、研究者が「成功という誤った認識を広めている」と非難した。フリードマンは、このヴァーマス報告書を「個人的に」受け止めたという。ひどい気分であった。20年以上にわたって、遺伝子治療の可能性について自分自身や同僚を欺いてきたような気がしてならない」。しかし、彼はまた、「悪党よりも、遺伝子治療の研究をしている多くの善良な人々」がいることを知っており、勤勉かつ良心的に自身の研究を追求し続けた。
それでも、一部の科学者の熱狂的な意見もあり、遺伝子治療に対するメディアの注目と誇大広告は続いていた。1999年、ペンシルバニア大学の臨床試験中に、肝臓の遺伝性疾患を患っていた18歳の患者ジェシー・ゲルジンガーが死亡し、事態は大混乱に陥った。ジェルジンガーさんの死は、遺伝子治療が直接の原因とされる最初のケースだった。その後の調査で、実験デザインに多くの問題があることが明らかになった” 。
ヴァーマスレポートの経緯から、NIHと米国保健省における物事の進め方をいち早く垣間見ることができる。 この科学者こそ、私の大学院時代の恩師であるインダー・バーマ博士であった。彼は長い間、遺伝子治療の主要な推進者の一人であり、その後、数十年にわたる倫理的欠陥と呼ぶべき記録によってソーク研究所から辞任を余儀なくされた人物である。しかし、この科学者は、NIHの総局長から、この分野の科学的厳密性とメリットを「独立して」調査するように任命された科学者であったのだ。 片方の手でもう片方を洗う。
本来の「遺伝子治療」のコンセプトのどこが問題なのか？ 問題はいくつもあるが、ここではそのいくつかを紹介しよう。
1）遺伝物質（「ポリヌクレオチド」）を人体の大部分の細胞の核に効率よく取り込み、あらゆる遺伝的欠陥（あるいはトランスヒューマンな遺伝的改良）を作ることができるかどうか
一言で言えば、「ノー」である。 人間の細胞（と免疫システム）は、外部のポリヌクレオチドによる改変に抵抗するために、何種類ものさまざまなメカニズムを進化させてきた。 そうでなければ、我々はすでに様々な形態の寄生的なDNAやRNA（ウイルスやその他のもの）に蹂躙されていることだろう。 このことは、「トランスヒューマニスト」たちが、人類という種に神を演じようとする熱狂的な、しかしナイーブな衝動に駆られて見過ごし続けている、技術上の大きな障壁のままだ。 ポリヌクレオチドとは何か？ 基本的には、4つのヌクレオチド塩基（DNAの場合はATGC、RNAの場合はAUGC）からなる長鎖ポリマーで、（我々が知っている）すべての遺伝情報を時を越えて運ぶものである。
2) 免疫系についてはどうか？
これは、1980年代後半に私が発見したブレイクスルーの1つである。 テッド（フリードマン）が当初思い描いたのは、もし子供が先天的な遺伝的欠陥によって、重要なタンパク質に欠陥がある、あるいは生成されない場合（レッシュ・ナイハン症候群やアデノシンデアミナーゼ欠損症など)その欠陥を補完する「良い遺伝子」を与えることで簡単に修正できる、という単純な発想であった。しかし、このような子供たちの免疫システムは、発達の過程で、「悪いタンパク質」を正常なものとして認識するか、あるいは欠落したタンパク質を正常なものとして認識しないように「教育」されていることが理解されていなかった。 つまり、「悪玉遺伝子」を人の体に導入すると、本質的に「異物」であるタンパク質が生成され、その結果、「善玉遺伝子」を持つ細胞が免疫学的に攻撃され、殺されてしまう。
3）うまくいかず、「良い遺伝子・タンパク質」が毒性を示した場合はどうなるのだろうか？
現在のワクチンの状況では、これが本質的に「スパイクタンパク質」の問題だ。 RNAワクチンを体内から排除するにはどうしたらいいか」という質問をよく受けるが、「何もしない」と答えるしかない。 この合成された「mRNAのような」分子を体内から排除する技術は、私の知る限りではない。 現在使われている多くの「遺伝子治療」の方法についても同じことが言える。 免疫システムがポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を攻撃し、細胞に有害なタンパク質を作らせる原因となる大きな分子を分解する（噛み砕く）ことを期待するしかない。 現在の「遺伝子治療」の方法は事実上すべて非効率的であり、基本的に遺伝物質を小さな細胞の部分集合にランダムに送り込むため、散在する比較的まれな遺伝子導入細胞を外科的に除去する現実的な方法はない。 細胞性免疫系（T細胞）による遺伝子改変細胞の除去が、外来の遺伝情報を取り込んだ細胞を除去するための現在唯一の実行可能な方法である（mRNAやDNAの場合は「トランスフェクション」、ウイルスベクター遺伝子の場合は「トランスダクション」）。
4）「良い遺伝子」がゲノムの「悪い場所」に着地したらどうなるのか？
我々のゲノムの構造は高度に進化しており、現在の理解レベルでは、我々はまだ相対的な初心者であることが判明している。 ヒトゲノムの塩基配列が決定されたにもかかわらず。挿入型突然変異誘発法」（ウイルスDNAなどの形で遺伝情報を貼り付ける）という方法は、ミバエ、カエル、魚、マウスに至るまで、遺伝学の新しい知見を生み出す有力な方法の一つとして、長い間利用されてきた。 新しいDNAが染色体に挿入されると、予期せぬことがたくさん起こる。 例えば、癌の発生などである。そのため、「RNAワクチン」に使われるmRNAのようなポリヌクレオチドが、逆転写（RNA→DNA）の後に核（DNA染色体が存在する場所）に移動して細胞ゲノムに挿入・再結合する可能性が非常に懸念されている。 通常、DNAを用いた遺伝子治療技術では、このような理由からFDAは遺伝子毒性試験を要求するが、「mRNAワクチン」技術は遺伝子治療製品として扱われなかった。
このようなリスクを考慮した上で、mRNAを薬剤（遺伝子治療やワクチン目的）として使用する際の本来の考え方は、mRNAは一度製造されたり細胞内に放出されると通常かなり急速に分解されるということだ。mRNAの安定性は「ポリAの尾」の長さを含む多くの遺伝子要素によって制御されているが、通常1/2から2時間程度の範囲になる。 したがって、通常の酵素で分解される天然または合成のmRNAを体内に取り込んでも、ごく短時間しかもたないはずである。 そしてこれが、ファイザー、バイオテック、モデルナが医師に「注射したmRNAは注射後どのくらいもつのか」と質問したときの答えであった。
しかし今、合成ヌクレオチドであるシュードウリジンを組み込んだファイザー／バイオエヌテック／モデルナのワクチンからの「mRNA」は、注射後少なくとも60日間はリンパ節に留まることが分かっている。 これは自然界に存在するものではなく、また本当のmRNAでもない。 これらの分子は、天然のmRNAと同様の遺伝的要素を持っているが、天然のmRNAを通常分解する酵素に対して明らかにはるかに耐性があり、長期間にわたって高レベルのタンパク質を生産することができ、体内で通常観察されない外来タンパク質を生産する細胞を排除する通常の免疫機構を回避するように思われる。
Katharina Röltgenらによるこのブレイクスルー研究から得られた主要な知見は以下の通りである。
シュードウリジンとmRNAについて
シュードウリジン（略号：Ψ）とは何か？
シュードウリジンは、天然のヒトmRNAに広く存在する修飾ヌクレオチドmRNAサブユニットであり、その生物学的意義や修飾過程の制御については、現在も解明が進められている。 この修飾は、我々の体の細胞内で、高度に制御された形で自然に起こっている。これは、モデルナやPfizer/BioNTech（CureVacではない）COVID-19「mRNA」ワクチンの製造工程で起こる、合成シュードウリジンのランダムな組み込みとは全く対照的である。天然のシュードウリジン修飾の生物学に対する理解の「最先端」は、Erin K BorchardtらによってAnnual Review of Genetics誌に掲載されたこの優れたレビューで 2020年後半頃に要約されている。これから、免疫学、分子生物学、細胞生物学に踏み込んでいくので、少し待ってほしい。
要旨は以下の通り。
「シュードウリジン検出の最近の進歩により、ヒトの細胞にはメッセンジャーRNAと多様なクラスのノンコーディングRNAを含む複雑なシュードウリジンランドスケープが存在することが明らかになった。RNAのコンフォメーションを安定化させたり、様々なRNA結合タンパク質との相互作用を不安定化させるなど、シュードウリジンの分子機能が知られていることから、RNAのシュードウリジル化はRNA代謝や遺伝子発現に広く影響を及ぼす可能性があることが示唆されている。ここでは、ヒトのシュードウリジン合成酵素の標的RNA、異なるRNA配列を認識する根拠、制御されたRNAプソイドウリジル化のメカニズムについて、まだ分かっていないことが多いことを強調する。また、スプライシングや翻訳におけるノンコーディングRNAのシュードウリジル化の役割についても検討し、治療用mRNAを含むタンパク質生産におけるmRNAのシュードウリジル化の潜在的影響についても指摘する。” 。
Molecular Cell誌に掲載された、より最近の(ピアレビューされた)出版物が、天然のシュードウリジン修飾に関連する作用メカニズムのいくつかに光を当てている。 自然界では、高度に制御された様々な細胞酵素（例えばPUS1,PUS7,RPUSD4）が、細胞内で作られている間に特定のmRNAおよびそのmRNA内の特定の場所に作用し、通常のウリジン核酸サブユニットを修飾してシュードウリジンを形成すると考えられている。 これらの修飾は、スプライスされたRNA領域に関連する場所で起こり、スプライス部位の近くに濃縮され、RNA結合タンパク質の数百の結合部位と重なっている。 最新のデータでは、プレmRNAのシュードウリジン化は、ヒトの細胞によって、プレmRNAの代替処理によってヒトの遺伝子発現を制御するために利用されていることが示されている。
これは、これらのワクチンに使用されている合成「mRNA」が患者のリンパ節組織で60日以上持続することを証明する、上に引用したCellの論文と一致している。
「エキサイティングな可能性は、制御されたmRNAのシュードウリジル化が、変化する細胞状態に対応してmRNAの代謝を制御していることだ。」
これは、技術的に正確な言い方で、シュードウリジンの組み込みが、mRNAが体内でどれくらいの期間留まるかを制御する1つの要因であると言っている。
この総説は、次のような驚くべき（ワクチン目的で使用される分子へのΨの無秩序な組み込みという文脈から）記述で進んでいる。
「Ψの生物学的効果は、UとΨの化学的差異に由来するものでなければならず、それは主としてRNAバックボーンのコンフォメーションと塩基対の安定性に影響を与える。ΨはAに加えてG、C、Uとも安定な対を形成できるため、「普遍的」塩基対形成パートナーとして提唱されてきた。短い合成RNAオリゴにおけるΨの構造的効果に関する集中的な研究にもかかわらず、より長いRNAにおける部位特異的なRNAシュードウリジル化の構造的結果を予測することは今のところ不可能である。Ψを含む二重鎖の安定性に対する配列コンテキストの効果を系統的に調べることは、正確な予測に向けた重要なステップである。細胞内でのRNA疑似ウリシル化の構造的帰結を明らかにすることが重要であり、これは生体内でRNA構造をプローブする改良された方法を用いれば可能である。」と述べている。
さらに
「機能性タンパク質の収量に対するΨの効果は、使用される特定のコドンに強く依存する。この配列依存性の根底にあるメカニズムは不明であり、細胞におけるmRNAのシュードウリジル化の翻訳上の結果について、いかに多くのことが解明されていないかが強調されている。」
最後に、複数回のmRNAワクチンブースター後に観察される免疫抑制(これは、後天性免疫不全症候群またはエイズ病と呼ばれることが多くなっている)に関連して、Borchardtらは、以下のように教えている。
「自然免疫
細胞には、様々なToll様受容体（TLR)レチノイン酸誘導タンパク質（RIG-I)プロテインキナーゼR（PKR）などの自然免疫センサーが備わっており、外来核酸を検知している。RNA修飾は、「自己」のRNAと「非自己」のRNAを識別するメカニズムになると考えられており、実際に、外来RNAにシュードウリジンなどのRNA修飾を組み込むことで、自然免疫による検出を回避することが可能である。このため、RNA修飾は、RNAが免疫反応を引き起こすことなく細胞内に取り込まれ、治療目標を達成するのに十分な時間安定であることが求められるRNA治療薬分野において、強力なツールとなる。さらに、ウイルスのゲノムRNAに修飾されたヌクレオシドが存在することで、感染時の免疫回避に寄与している可能性もある。
TLRs Toll-Like Receptors (TLR) は、様々な病原体関連分子パターン (PAMPS) を検出し、その後炎症性サイトカインの産生を刺激する膜結合型タンパク質である。RNAを感知するTLR、TLR3,TLR7,TLR8はエンドソーム膜に存在する。TLR3は二次RNAを認識し、TLR7とTLR8は二次RNAを認識する。標的を認識すると、TLRはシグナル伝達カスケードを活性化し、炎症性サイトカインとインターフェロンの発現をもたらす。In vitro transcribed RNA は、いずれかの TLR を発現するように操作した HEK293 細胞にトランスフェクトすると免疫刺激性を示し、RNA にΨを含めるとこの反応が抑制される（TLR7 と TLR8 で最も顕著に）。
RIG-I Retinoic Acid Inducible Protein (RIG-I) は細胞質自然免疫センサーで、5′-triphosphate または 5′-disphosphate 基を持つ短いdsRNA または ssRNA を検出する（様々なRNA ウイルスに共通する特徴）。RIG-Iが活性化すると自己抑制が解除され、CARDドメインが解放されてMAVSと相互作用し、最終的に免疫因子の発現につながるシグナルカスケードが開始される。5′-三リン酸でキャップされたRNAにΨが含まれると、RIG-Iの活性化はなくなり、シュードウリジンが自然免疫活性化を抑制するもう一つのメカニズムが示されることになった。さらに、HCVゲノムのポリU/UC領域もRIG-Iの強力な活性化因子であり、このRNAのUをΨで完全に置換すると、下流のIFN-β誘導が完全に無効になる。Durbinらは、pseudouridylated polyU/UC RNAに結合したRIG-Iが、下流のシグナル伝達を活性化するために必要な構造変化を起こさないという生化学的証拠を提示している。
PKR RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）は、細胞質常在の自然免疫センサーである。外来RNAを検出すると、PKRは翻訳開始因子eIF-2αをリン酸化することにより翻訳を抑制する。PKRを活性化する分子は様々であるが、分子内または分子間で形成される二本鎖RNA、5′三リン酸基などが挙げられる。様々なPKR基質にΨが含まれていると、未修飾のRNAに比べてPKRの活性化と下流の翻訳抑制が軽減される。例えば、47ntの短いssRNAは、Uで合成された場合はPKRを強力に活性化するが、Ψでは活性化しない（Ψでは約30倍減少）。この短いRNAを相補的な非修飾RNA 170にアニールすると、ΨはまたPKR活性をわずかに低下させた。同様に、試験管内試験で転写された非修飾tRNAは、シュードウリジンで転写されたtRNAよりもはるかに強力なPKRの活性化因子として作用した。ただし、完全にシュードウリジン化されたtRNAが正規のフォールディングをとるかどうか、このことがこの基質のPKR認識にどのような影響を及ぼすかについては不明であることに注意が必要である。最後に、修飾されていないmRNAをトランスフェクションすると、完全にpseudouridyl化された同じmRNAと比較して、細胞培養における細胞全体のタンパク質合成がより減少した。この結果と一致するように、完全にpseudouridyl化されたmRNAは、PKRの活性化およびそれに続くeIF-2αのリン酸化を減少させた。」
治療またはワクチン目的の薬剤としてのmRNAの使用に対する結果について、Borchardt達は、以下のように結論付けている。
「シュードウリジンは、おそらく、いくつかのメカニズムによる免疫刺激の減少、シュードウリジン含有RNAの半減期の延長、および翻訳フィデリティと効率に対するΨの潜在的に有害な効果など、mRNAの機能の多面的な側面に影響を与える。」
結論
これらの情報に基づくと、Katharina Röltgenらによるリンパ節生検組織で観察された免疫抑制、DNAウイルスの再活性化、合成「mRNA」分子の著しい残存は、Pfizer/BioNTechおよびモデルナ SARS-CoV-2ワクチンに用いられた合成mRNA様分子にシュードウリジンがランダムに広く組み込まれたことが原因ではないかと私には思える。 これらの副作用の多くは、Kariko, Weissmanらが2008年に発表した論文「Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability」（プソイドウリジンをmRNAに導入することにより、翻訳能力と生物学的安定性が向上した優れた非免疫原性ベクターが得られる。）で報告しており、規制当局や毒性学の専門家が、本当に未熟でまだ試験されていない技術を緊急使用承認し、広く（世界的に）展開する前にこれらの知見を検討すれば予見できたはずである。 したがって、FDA、NIH、CDC、BioNTech（カリコ博士を副社長として雇用している)モデルナのいずれも、真の無知を主張することはできない。 私の目には、我々が見たものは「意図的な無知」に分類されるのがより適切であると映る。
結論として、これらのデータに基づくと、 私たちの多くが投与されている「mRNA」様分子に、シュードウリジンが無作為かつ無秩序に挿入され、天然のmRNAに類似したポリマーの集団が形成されているというのが私の考えである。しかし、臨床的に重要な様々な側面で区別される様々な特性を持っている。 これらの特性や活性が、この新しいクラスのワクチンに関連した、珍しい効果、珍しい安定性、顕著な有害事象の多くを説明することができる。これらの分子は天然のmRNAではなく、また天然のmRNAのように振る舞うこともない。
この時点で、私を最も悩ませ、当惑させる問題は、ランダムなシュードウリジンを組み込んだ「mRNA」様の分子を世界中の人々に広く投与する前に、なぜこれらの修飾と関連する臨床的副作用の生物学的影響が徹底的に調査されなかったのか、ということだ。 生物学、特に分子生物学は、非常に複雑で、マトリックス的な相互関係がある。 ここで何か一つを変えれば、向こうで何が起こるかを予測するのは本当に難しい。だからこそ、非臨床と臨床の研究を厳密にコントロールしなければならない。今回もまた、エリート科学者、医師、政府の「公衆衛生」官僚の傲慢さが常識を覆し、確立された規制規範が無視され、その結果、患者が不必要に苦しんでいるように私には思われる。
我々はいつになったら学ぶことができるのだろう。