論文：生物環境における合成自己組織化材料（2016）

Synthetic Self-Assembled Materials in Biological Environments

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27042774/

フランク・ヴァースルイス、ヤン・H・ヴァン・エッシュ、リエンク・イールケマ*1

1. はじめに

本報告は、イメージングや治療薬としての応用が期待される、生体環境における合成分子の自己組織化に関するものである。自己組織化とは、分子構成要素が規則正しい構造へと自発的に組織化されることと定義され、近年、生物活性材料の開発に向けて非常に成功したアプローチであることが証明されている。その主な理由は、自己組織化が、ナノスケールで秩序立った分子構造を作製するための最も実現可能な方法だからである[1]。これらの構造は非共有結合的な相互作用によって保持されているため、集合体内の分子内相互作用と分子間相互作用のバランスを注意深くとることで、外部からの刺激に適切に応答する能力を保持しながら、比較的堅牢な材料を形成することができる。[さらに、自己組織化は非常に柔軟であり、様々な類似の自己組織化ビルディングブロックを混合することによって、形成される構造を制御することができる、脂質膜、アクチンフィラメントなど）は、自然のシステムを理解し、他の方法では達成できなかった特性を持つ新規材料を開発するために、科学者に合成自己組織化システムの設計を促した。これらすべての要因を考慮すると、方法論としての自己組織化は、薬物送達システム、細胞プロセスに影響を与える根本的な方法、生体内の分子イメージングなど、生物学や医学における無数の応用を約束するものである。しかし、報告されているほとんどの研究は生体外で行われており、生体環境における合成自己組織化システムの最初の例が現れ始めたのはごく最近のことである。その主な理由は、分子成分の自己組織化を、試験管内の制御され希釈された条件から、生体システムの高度に複雑で動的な環境に変換することは、自明な問題ではないからだ。

生体系で合成自己組織化を行うには、いくつかの課題があり、使用できる構成要素の範囲が制限される。第一に、自己組織化は生物学的に直交的で生体適合性のある方法で行われる必要があり、自己組織化プロセスや生物学的機能のいずれをも妨害することなく、合成物と生体物質との望ましい相互作用を選択的に提供する必要がある。第二に、自己組織化分子や凝集構造は、急速な分解を受けにくいことが望ましいが、自己組織化自体は一般的に、タンパク質分解に対する分子成分の化学的安定性を高める。第三に、自己組織化プロセスの正確な空間制御がしばしば要求される。その結果、目的の部位での集合を誘導するという課題が生じる。濃度、pH、光[4]、切断可能な自己組織化阻害基[5]の組み込み[6]、あるいは化学反応[7]など、不活性種を自己組織化分子に変えるための様々な戦略が開発されてきた。in situ自己組織化法が採用される場合、ビルディングブロック自体の生体内分布、取り込み、循環、毒性が非常に重要になる。重要なことは、in vivo/in vitroの自己組織化の取り組みが近年初めて登場し、生体環境における合成自己組織化の空間的制御が可能になったことである。さらに、生理的条件下で行われ、一般的な生体分子[8]と非選択的に反応することなく、自己組織化を誘発する反応の開発は極めて重要である。

私たちは、生物環境における自己組織化が応用される分野として、イメージング剤と治療剤という2つの主要な分野を特定した。イメージングのセクションでは、細胞システムにおいて蛍光強度の高いコントラストを得るための自己組織化に基づくアプローチについて議論する。まず、酵素が前駆体から保護基を除去し、秩序構造を形成する自己組織化分子を得る例について述べる。続いて、オン／オフ蛍光プローブとして効果的に機能する系について議論する。興味深いことに、一方のタイプは自己組織化によって蛍光を発するようになるが、もう一方のタイプは「サイレント」凝集体の分解によって蛍光を発するようになる。治療薬のセクションでは、まず特定の細胞タイプの周囲に合成細胞外マトリックスを形成する方法について述べる。次に、効率的で高負荷のドラッグデリバリービークルとして、自己組織化薬物コンジュゲートに基づくシステムについて論じる。最後のセグメントは、治療薬として作用するペプチド-両親媒性繊維の使用に関するものである。各セグメントを紹介するにあたり、以下のような自己組織化システムが示す多くの特徴に重点を置く： 1)何が自己組織化を引き起こすのか、2)生物学的影響による分子設計の制約は何か、3)一般的にどのような構造が形成され（ミセル、繊維など）、その形態がどのように機能を助けるのか。

ここでは、イメージングツールや治療薬として使用できる材料の形成に向けた、自己集合に基づくアプローチの最近のエキサイティングな例に焦点を当てる。組織工学[9]や、多価相互作用によって細胞と結合できる超分子システム[10]など、「生物学的環境における合成自己組織化」の枠内に入る他の研究分野については、最近の総説が利用可能であるため、ここでは触れない。この進捗報告では、ケミカルバイオロジーと医学における自己組織化の利用がなぜ注目に値するのか、方法論と応用に関して現状はどうなっているのか、そして最後に、今後数年間でどのような進展が期待できるのかを明らかにしたい。

2. イメージング剤

蛍光イメージングは、生物学的構造、機能、メカニズムを解明する上で非常に重要である[11]。生きた生物系の高解像度画像を得るためには、関心領域とその周囲のコントラストを高い比率で得ることが極めて重要である。そのためには、生物学的標的の局所的な蛍光基の濃度を高くし、周囲は静寂に保つ必要がある。以下の段落では、この複雑なタスクを実行するための、自己組織化に基づく2つの方法について述べる。第一のアプローチでは、保護基の酵素的切断後に自己集合する蛍光前駆体を用い、自己集合を酵素近傍に限定する。第二のアプローチでは、タンパク質リガンドを含む両親媒性物質が水性媒体中で凝集し、自己消光により非蛍光性凝集体を与える。リガンドがタンパク質に結合すると、凝集体は分解し、自己消光が緩和され、標的タンパク質が照らされる。

2.1. 酵素トリガー自己組織化

イメージングツールを開発するための非常に強力な戦略は、酵素による保護基の切断によって自己集合を起こす前駆体分子を使用することである。非自己組織化前駆体を水性媒体中に分散させると、弱く均一な蛍光溶液が得られる。保護基の酵素的切断により、蛍光分子は自己組織化され、例えば繊維状になる。このとき、蛍光は凝集体に厳しく制限され、高い周囲環境をもたらす（図1）。

難しいが極めて重要な目的は、自己集合を目的の領域に特異的に起こさせることである。保護基が酵素的に切断されると、自己集合は酵素の近傍で起こり、自己集合の正確な空間制御が可能になる。興味深いことに、この保護基を調整することで、様々な酵素を選択的に標的とすることができ、細胞内構造や細胞プロセスのイメージングが可能になる。このイメージング技術の重要な前提条件は、前駆体分子が自己集合しないことである。一方、保護基の酵素的切断は、（酵素の位置で）高蛍光凝集体への迅速な自己集合をもたらす。この効果は、親水性の高い保護基を用いることで達成されることが多く、保護基を除去すると、残りの分子の親水性が大きく低下する。これからの例では、この方法論を使って細胞部分構造と細胞プロセスを可視化できることを示す。

生細胞における酵素トリガー自己組織化の非常に興味深い例は、Raoのグループによって報告された。2010年の最初の報告では、2-シアノベンゾチアゾール（CBT）とD-システインの化学反応が、生理的条件下で進行する自己組織化の引き金として用いられた（図2）[12]。システインのチオール基とアミノ基は、それぞれジスルフィド結合とペプチド配列RVRRを介して保護された。最後に、リンカーR3を用いてビオチンを導入することで、ストレプトアビジンでコートしたゴールド粒子や蛍光レポーター基の添加による高分解能TEMイメージングが可能になった。試験管反応により、著者らは、アミノまたはチオールで保護された1にフリンまたはトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を加えると、オリゴマー生成物が得られ、その後、繊維や雪の結晶などさまざまな形態に自己組織化することを示した。

次に、生きた細胞内で酵素をトリガーとした1の誘導体の自己組織化を試みた。可視化を目的として、リジンリンカー（R3）をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で機能化した。このモノマーを培養MDA- MB-468細胞に加え、2時間培養した後、蛍光画像を記録した（図2C）。重要なことは、縮合反応がゴルジ体（ゴルジ体マーカーで別に染色）付近で起こることがわかったことである。このゴルジ体はFurinの優勢な場所であることが知られている[13]。保護ペプチド配列をスクランブルしてFurinによる切断を受けなくした対照実験では、細胞全体に非常に弱い均一な蛍光が見られた。これらの知見は、酵素トリガーによる自己組織化が、酵素の位置を明らかにし、細胞内精度で自己組織化をターゲットにできることを示している。

Raoグループによる次の投稿[14]では、1の誘導体をガドリニウム（Gd）錯体で標識し、著者らはジスルフィド結合を用いてチオール基を保護した。この化合物をMDA-MB-468細胞に拡散させると、グルタチオン（GSH）によってジスルフィド結合が還元され、その後の自己集合によってGdを豊富に含むナノ粒子が得られた。これらのナノ粒子は、分子的に分散した成分に比べてT1緩和性が高いため、その後MRI（磁気共鳴画像法）を用いて画像化することができた。1の誘導体を使用する際の欠点は、CBT基が内因性のシステインとも反応することであった。CBTの代わりに2-シアノ-6-ヒドロキシキノリン（CHQ）を用いると、遊離システインに対する2次速度定数が480倍低下した[15]。さらに、分子内環化を促進するためにグリシンリンカーを導入すると、縮合生成物は繊維状構造に自己組織化した。以前の研究と同様に、著者らはチオール基とアミノ基を保護し、得られた化合物を生細胞に添加した。フリンとGSHによるブロック基の切断が分子内縮合を引き起こし、ゴルジ体の近くで自己集合した。次に、この大環状化戦略を用いて、還元性（例えば細胞内）環境でGdリッチ粒子を組み立てた[16]。全体として、これらの研究は、内因性酵素によって切断可能な保護基を用いることで、生細胞内での自己集合を制御できることをうまく示している。自己組織化の結果、局所的に高濃度のプローブが得られ、生体試料中で優れたコントラストが得られる。

このセクションで論じた例は、特定の酵素が特定のオルガネラに多く存在するという概念に基づき、特定の細胞内構造に限定された凝集体の形成に、酵素トリガー自己組織化が利用できることを示している。これらの凝集体は高濃度の蛍光基を含むため、優れたイメージングツールとなる。次のセクションでは、このアプローチをさらに一歩進め、特定の細胞プロセスの可視化を可能にする。

Raoの研究グループは、酵素トリガー自己組織化法をさらに発展させ、生体内の細胞プロセスをリアルタイムで可視化することに成功した[17]。対象とした細胞プロセスはアポトーシス（細胞死）であり、抗がん剤の有効性を詳細に調べることができるため、非常に関連性が高い。一般的なアプローチを図3に示す。C-SNAFと名付けられた分子では、カスパーゼによるペプチドセグメントDEVDの切断とジスルフィド結合の還元により、C-SNAFのシアノベンゾチアゾール（CBT）基とシステイン基の間で環化反応が起こった[17]。重要なことは、カスパーゼはアポトーシスに伴って活性化されるため、環化と自己組織化のためのこれら2つのトリガーの組み合わせにより、C-SNAFの自己組織化はアポトーシス細胞内でのみ起こりうるということである。自己組織化すると、蛍光プローブCy5.5の局所濃度が著しく上昇し、アポトーシス細胞と細胞外空間のコントラストが得られる。興味深いことに、凝集体は長時間細胞内に留まるのに対し、単量体種はカスパーゼを発現していない細胞の内外に速やかに拡散する。したがって、アポトーシス細胞に入った前駆体は、さらに前駆体がアポトーシス細胞に入ると凝集体に捕捉される。このメカニズムにより、標的細胞内には高濃度の蛍光性凝集体が生じるが、健康な細胞には蛍光性前駆体はほとんど存在しない。

C-SNAFがアポトーシスがん細胞を特異的に標識できるかどうかを調べるため、HeLa細胞にスタウロスポリン（STS）を添加してアポトーシスを誘導した。その後、C-SNAFを添加し、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡で可視化したところ、アポトーシス状態のHeLa細胞で特異的に自己集合が起こることが明らかになった。生存可能なHeLa細胞はC-SNAFでは可視化できず、コントロール化合物（ペプチド切断を阻害するか、チオールをメチル化する）を用いて、1）ペプチド切断、2）ジスルフィド切断、3）環化、4）自己組織化という提案されたメカニズムが実際に起こっていることを確認した。次の段階として、担癌マウスを抗癌剤DOXで治療し、C-SNAFを静脈内投与した。C-SNAFの位置と凝集状態を決定するために、非侵襲的な経時的蛍光イメージングが用いられた。著者らは、蛍光強度が主にDOX投与マウスの腫瘍組織に集中することを観察したが、DOXを投与しなかった腫瘍マウスではこの効果は観察されなかった。全体として、この研究は、C-SNAFがアポトーシス細胞内で酵素を介した自己組織化を起こし、生体内で非侵襲的にリアルタイムで可視化できることを説得力を持って示している。続く論文で、Raoグループはこの原理をGdベースのMRIプローブに拡張できることを示した[18]。ここでは、カスパーゼがMRIプローブの自己集合の引き金となる。細胞内で自己組織化されると、r1緩和度の増大と磁気共鳴信号の増強が観察され、このMRI感応性物質が生体内の細胞プロセスを可視化できることが示された。同様の戦略を用いて、Raoのグループは、生きた細胞内で酵素触媒による自己集合を起こすことができる18F標識分子を合成した[19]。担癌マウスを用いて、この化合物が活性化可能な陽電子放射断層撮影（PET）トレーサーとして使用でき、DOX処理マウスのアポトーシス細胞を可視化できることが示された。結論として、酵素を利用した自己組織化は、生体内での細胞アポトーシス過程を追跡できることが示された。自己集合のための前駆体上の保護基を注意深く選択することで、瀕死の細胞における特定の酵素の活性化に基づき、自己集合をアポトーシス細胞に局在させることが可能であった。自己組織化により、モノマーを目的の細胞内の凝集体の中に効率よく捕捉することができ、イメージング材料の選択的ターゲティングが可能となった。さらに、基本的な分子設計は、保護基を変えることによって、様々なタンパク質を標的とするように変更することができる。この戦略により、他のタンパク質や細胞プロセスにアクセスすることができる。

2.2. 酵素トリガー自己組織化ベースのオン／オフプローブ

前節では、蛍光分子の自己集合によって、蛍光性の高い凝集体が生成されることを説明した。しかし、ある種のプローブでは、高濃度になると自己消光が起こることが観察されている[20]。このプロセスを防ぐために、分子分散時には消光し、凝集時にのみ発光する特異的な蛍光プローブが開発されてきた。これらのプローブは凝集誘導放出（AIE）プローブと呼ばれ、凝集状態でのみ蛍光を発するため、優れたコントラストを与えることができる[21]。この現象はテトラフェニルエチレン誘導体を用いた場合に観察され、凝集状態におけるこの構成体の分子内回転の制限に基づいていると考えられている。この効果により、放射以外のメカニズムによるエネルギー散逸が禁止され、凝集状態での量子収率が高くなる。従って、制御された標的化された方法で蛍光をオンにするためには、分子構築体が高い水溶性を持ち、標的認識に先立って凝集とそれに伴う蛍光の増加を防ぐことが基本条件となる。したがって、AIEプローブの凝集と蛍光をオンにするには、前述のように親水性保護基を酵素で切断する必要がある。

TangとLiuのグループは共同でアポトーシスを可視化することを目指し、AIE蛍光プローブを用いて、Raoのグループが先に述べたのと同様の全体的な戦略を用いた[22]。AIE部分のテトラフェニルエテン（TPE）は、カスパーゼによって切断されるDEVDKペプチドセグメントに共有結合した。カスパーゼはアスパラギンとリジンの間のペプチド結合を切断し、残ったK-TPEの自己集合を誘発する。アポトーシスを起こしたMCF-7細胞は、ペプチド-TPE結合体とインキュベートした後、強い蛍光を発した。そのメカニズムがカスパーゼによるペプチドの切断に基づくものであることを示すために、健常細胞もカスパーゼ阻害剤で処理した細胞も、蛍光強度はほとんど示さなかった。重要なことは、ペプチド-TPEが凝集していない状態では無声であるため、洗浄工程が必要なかったことである。これらの結果は、この化合物がin vitroでのアポトーシス誘導剤のスクリーニングに使えることを示している。分子設計では、リジン残基を除去し、TPEプローブをテトラフェニルエテンピリジニウム（PyTPE）に置き換えた[23]。TPEの励起波長が312 nmであるのに対し、PyTPEは405 nmで励起され、この波長の光は生きている被験者への害がはるかに少ないため、in vivoイメージングが可能となった。担癌マウスにDEVD-PyTPE結合体を注射し、アポトーシス誘導剤スタウロスポリン（STS）も加えた。正常組織では蛍光レベルが低いのに対し、腫瘍領域では蛍光が明瞭に認められることが観察された。STSの添加を省略すると、腫瘍組織と正常組織の蛍光レベルは同程度となった。これらの結果は、プローブが生きたマウスの細胞内に入り、アポトーシスを起こしている腫瘍細胞で特異的にペプチドの切断が起こることを示している。その後、PyTPEセグメントの自己集合が起こり、高蛍光凝集体が得られる。このプローブはアポトーシス細胞を可視化するのに有効である。この原理の別の例として、Liu、YangとDingは、AIEプローブが細菌タンパク質の可視化に使えることを示した[24]。ここでは、遠赤外／近赤外（FR/NIR）プローブが、2つのタンパク質（TIP-1とULD-TIP-1）に結合できる2つのペプチドセグメントに結合された。プローブ単体ではほとんど蛍光を発しないが、タンパク質に結合すると蛍光が劇的に増大する。この化合物を、TIP-1またはULD-TIP-1を発現する大腸菌に添加したところ、大腸菌でのみ顕著な蛍光が観察された。興味深いことに、TIP-1にはプローブとの結合部位が1つあり、複合体は球状の凝集体に自己組織化した。一方、ULD- TIP-1には結合部位が4つあり、プローブを添加すると、プローブがタンパク質ユニット間の架橋剤として働き、ファイバーネットワークが観察された。

2.3. タンパク質を介した分解によって蛍光プローブをオンにする

前述のように、特別に設計されたAIEプローブは凝集すると蛍光を発するようになる。しかし、より一般的には、蛍光両親媒性分子の自己集合は、プローブ分子の局所濃度が高いため、ある程度の蛍光の自己消光を引き起こす。凝集誘起消光（AIQ）は一般に厄介なものと見なされているが、濱地グループはこの効果を巧みに利用した。効率的な自己消光によって凝集体が生成されるが、凝集体が分解されると自己消光は解除され、蛍光モノマーが放出される。分解を引き起こすために、タンパク質リガンドが設計に組み込まれ、タンパク質の結合によって蛍光プローブがオンになる。一般的に、この種の物質が形成する凝集体はミセル型でなければならない。ミセルはよりダイナミックであるため、集合体の迅速な分解とタンパク質の効率的なターゲティングが可能になる。組み立てと分解の両方を容易にするためには、プローブの全体的な疎水性が重要である。強固な凝集と効率的な自己消光を確実にするために、分子は非常に疎水性である必要があり、しかも標的タンパク質に到達した時点で分解できる必要がある。

葉酸受容体に親和性のあるリガンド（メトトレキサート、MTX）と疎水性蛍光プローブBODIPYを含む分子コンストラクトを用いて、水溶液中に分散させると、BODIPYの蛍光が凝集によって効果的に消光することが観察された。葉酸レセプターを添加すると、凝集体の分解により蛍光は23倍増加した。しかし、細胞に添加すると、BODIPY-MTX結合体は細胞膜を透過することができ、葉酸に依存しない蛍光の増加を通じて細胞膜への非特異的結合が観察された。これらの結果は、コンストラクト全体が疎水性であるため、細胞膜に存在するレセプターを特異的に検出できないことを示している。しかしながら、親水性フルオレセインプローブに切り替えると、凝集が減少し、蛍光の効率的な消光を示さないコンジュゲートが得られた。リンカー領域に疎水性ジペプチド（ジ-（4-トリフルオロメチル-フェニルアラニン）を追加すると、凝集が促進されるため、蛍光を効果的に消光するには十分であった。重要なことは、葉酸レセプターを加えると、レセプターへのMTX結合が起こり、凝集体の解離と蛍光の8倍増加が起こったことである。生きたKB細胞（HeLa細胞のサブライン）にBODIPY-ジペプチド-MTXを添加すると、強い蛍光を発する膜が観察された（図4）。この結果が非特異的結合によるものではないことを示すために、競合する葉酸レセプターを添加したところ、細胞膜の蛍光強度が劇的に減少した。この例は、分子構成要素の設計に基づいて自己組織化物質の物理的特性を制御できるという、自己組織化の重要な特徴を浮き彫りにしている。腫瘍で過剰発現するもう一つの膜タンパク質である炭酸脱水酵素も、同様の分子構築物を用いて標的とした。著者らは、ベンゼンスルホンアミド配位子を利用して、これらのタンパク質も可視化できることを示している[25]。

図4. AIQに基づくプローブのオン・オフスイッチングとその化学構造を模式的に示す。凝集時にはプローブは沈黙しているが、ターゲットが認識されると凝集体が分解し、蛍光がオンになる。[25] Copyright 2012, American Chemical Society.

続く寄稿で、濱地グループは、上述のアプローチを用いていくつかの細胞内タンパク質の可視化を試みた。原理的には、この分子設計により、さまざまなタンパク質のリガンドを組み込むことができるため、蛍光出力に基づいてタンパク質の有無を調べることができる。さらに、蛍光プローブと酵素との結合が蛍光の増大によって観察されれば、これらの物質と酵素との強い結合は蛍光強度の大幅な減少につながるため、このアプローチは、様々な物質と細胞内タンパク質との相互作用のスクリーニングに用いることができる。この寄稿では、MTXリガンドとテトラメチルローダミン（TMR）蛍光団を疎水性スペーサーで連結した分子を合成した[26]。このリガンドは細胞質酵素ジヒドロ葉酸還元酵素（eDHFR）に結合し、GFP融合eDHFRを過剰発現するHeLa細胞株（HeLa-DG）を用いてプローブ分子を添加すると、細胞全体で強いTMR蛍光が得られた。GFP-eDHFRを過剰発現していない通常のHeLa細胞を用いた対照実験では、非常に弱い蛍光が観察された。驚くべきことに、eDHFRに強く結合するトリメトプリムを添加すると、プローブ分子の蛍光はほとんど消失した。この発見は、プローブ分子がeDHFRの結合部位から除去されるだけでなく、生きた細胞内で再組立可能であることを示している。次に、内因性の細胞質タンパク質hCAIIを標的とした。MTXの代わりに、hCAIIに特異的に結合するベンゼンスルホンアミドリガンドを用いた。この新しい化合物の自己組織化とそれに伴う蛍光消光を確認し、自己組織化した物質を、hCAIIを天然に発現しているMCF-7細胞に添加した。4時間培養後、細胞は明るく点灯し、分子プローブの細胞への取り込みと凝集体の分解を示した。蛍光の増加がプローブリガンドとhCAIIとの特異的結合によるものであることを確認するため、このタンパク質に対する強力な阻害剤を加えたところ、蛍光はほぼ完全に消失した。この物質の明らかな細胞内再集合は、分解がリガンドと酵素の特異的相互作用によって引き起こされたことを示している。最後に、このプロセスを繰り返すことで、腫瘍に関連するHSP90タンパク質の標的化が可能になった。

非常に興味深い説明として、ヤンのグループは、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）と凝集の消光効果を組み合わせた[27]。蛍光団FITCは、その蛍光を消光するダブシルと結合した。このFRET対の間のリンカーとして、カスパーゼ（アポトーシス細胞によって産生される）によって認識され切断されるペプチド配列が含まれ、これらの化合物の蛍光がカスパーゼ酵素作用に反応するようにした。凝集を開始させ、その程度を制御するために、フェニルアラニン残基の数を変化させてスペーサー配列に加えた。著者らは、強く凝集する化合物の蛍光が、凝集しない化合物よりも効果的に消光されることを観察し、AIQ効果を実証した。予想通り、ダブシル基は効率的に蛍光を消光し、蛍光消光に対するFRET効果と凝集効果の組み合わせは、個々の効果よりも強いことが観察された。これらの化合物をアポトーシス細胞に添加すると、ダブシル基とフェニルアラニンが蛍光基から切断され、両方の消光効果がなくなるため、細胞は明るく発光した。

全体として、自己組織化に基づく戦略は、イメージングツールの開発に非常に有望である。最も重要なことは、凝集誘起発光と凝集誘起消光を利用することで、効率的にオン・オフできる蛍光プローブが作成されたことである。従来の蛍光プローブは、例えばタンパク質の認識だけに頼っていたため、結合していないプローブによるバックグラウンド蛍光が比較的多かった。例えば膜タンパク質をターゲットとする親水性プローブを使用する場合、これは洗浄ステップを使用することで改善できるが、細胞内や生体内で使用する疎水性プローブの場合、この解決策は実行不可能である。これらの問題は、自己組織化ベースのオン／オフプローブを使えば克服できる。さらに、自己組織化阻害基の切断によって蛍光をオンにできる酵素がいくつか同定されている。このアプローチにより、酵素活性をin vivoで可視化することが可能となり、特定のタンパク質の位置や、あるいはアポトーシスのような細胞プロセスを明らかにすることができる。

3. 治療薬

自己組織化に基づく方法を用いると、3つの根本的に異なるメカニズムで治療効果を得ることができる。第1部では、細胞内または細胞外の線維性ネットワークを形成するシステムについて述べる。繊維は、可溶性前駆体から親水性保護基を酵素で切断すると、その場で形成される。細胞内やその周囲で高密度のネットワークが自己形成されることで、細胞内での生体分子の拡散が抑制されると考えられている。細胞と小器官間のコミュニケーションは細胞の生存に不可欠であるため、代謝活性の低下は細胞死につながる可能性がある。第二の治療メカニズムは、生体外で形成されたペプチド両親媒性繊維と細胞膜との相互作用に基づく。ペプチドは容易に合成でき[28]、その相互作用はかなりよく理解されているので[29]、ペプチド-両親媒性分子の集合体が細胞の生存能力、分化、増殖に及ぼす影響を系統的に調べることができる。最終的なメカニズムは、タンパク質、糖質、DNAなどを標的にした、より伝統的な有機低分子薬剤の使用と、自己集合の有利な特性を組み合わせたものである。通常、薬物分子は疎水性であるため、親水性部分（例えばペプチド）を共有結合させることで、自己組織化が可能な両親媒性分子が形成される。難溶性のリンカーを用いることで、薬物を高充填し、細胞内へ効率的に送達するドラッグデリバリーシステムを開発することができる。

3.1. ファイバーネットワークを使って悪性細胞を選択的に殺す

治療材料を構築するための自己組織化に基づく最も魅力的な方法の一つは、細胞内や細胞周囲にファイバーネットワークをin situで形成することである。水性溶媒に分散させると、これらの化合物は自己集合して長い繊維になり、最終的にはネットワークを形成して周囲の溶媒をゲル化する。原理的には、ゲル化を防ぐ保護基を使って、ゲルネットワークの形成位置をコントロールすることができる。自己組織化阻止基が切断されると、ゲル化剤が形成され、自己組織化が起こる。前駆体分子は直接標的化剤を含まないので、すべての細胞に拡散する。しかし、ブロッキング基は、悪性細胞（例えば、ガンやバクテリア）にのみ存在する酵素によって切断されるように選択することができる。標的とする細胞に侵入したときにのみ、前駆体はそのブロッキング基を取り除かれ、細胞外に拡散できない繊維が形成される。したがって、このアプローチは標的細胞内に繊維を蓄積させることを可能にする。さらに、細胞膜に存在する酵素を標的とすることで、細胞周囲に繊維ネットワークを形成することができ、これは細胞内外への分子の拡散や他の細胞とのコミュニケーションを妨げると考えられるため、細胞死につながることも予想される。

通常、リン酸基はブロッキング基として使用されてきた[30a]。リン酸基は1）負電荷を帯びるため分子の親水性が飛躍的に高まり、自己組織化を妨げる。生細胞内での合成ナノ構造の自己組織化を探ることは、抗がん治療薬や抗生物質を開発するための魅力的な戦略を提供する可能性があり、非常に興味深い。

3.2. その場ハイドロゲル化で細胞を殺す

2007年、Xuのグループは、酵素をトリガーとした生体内における繊維ネットワークの自己組織化を開拓した。彼らの最初の貢献では、リン酸で保護されたナフタレン-Phe-Phe-Tyrハイドロゲル化剤を用いて、生きたバクテリアの体内でハイドロゲルを形成することを目指した（図5）[31]。

著者らはまず、アルカリホスファターゼが前駆体2からリン酸基を切断し、3に基づくハイドロゲルを生成できることを生体外で示した。次に、この前駆体を、ホスファターゼを過剰発現するように遺伝子改変した大腸菌に添加し、24時間培養した。続いて細胞を溶解し、最小ゲル化濃度以上の濃度で3が存在することを明らかにした。次に、超音波処理で細胞を懸濁し、懸濁液は容易にハイドロゲルを形成した。このサンプルのTEM分析から、生体外で観察されたのと同様の寸法の繊維が存在することが明らかになった。さらに、コンゴーレッド（繊維状物質を染色することが知られている色素）で染色できたのは、2とインキュベートしたバクテリアだけであった。ハイドロゲル化の結果として、前駆体2はホスファターゼを過剰発現する大腸菌に対して強い毒性を示すことが示され、そのIC50値は20μg mL1。

Xuグループの同様の研究では、HeLa細胞がハイドロゲル化の標的とされた。ここでは、ヒドロキシ由来のナフタレン-Phe-Pheハイドロゲル化剤とエステル部分を介して片側で結合した、負に帯電したコハク酸保護／可溶化基が用いられた。HeLa細胞は高レベルのエステラーゼを産生するため、この設計により、HeLa細胞に特異的にファイバーネットワークを形成することができる。この場合も、細胞の存在下でハイドロゲル化が観察され、細胞の生存率に悪影響を及ぼすことが判明した。逆に、健康な哺乳類細胞（NIH3T3）は、細胞質エステラーゼのレベルが低いため、影響を受けなかった[32]。

これら2つの例は、自己組織化阻害基の選択によって、細胞特異的なナノ構造を形成できることをうまく示している。しかしながら、前駆体の細胞内侵入のメカニズム、自己集合の場所（膜または細胞内）、そしてこれらのファイバーネットワークがアポトーシスを誘導するメカニズムについては言及されなかった。この点を改善したのが、Xuグループの次の寄稿で、ファイバー形成が可視化された[33]。この目的に向けて、著者らはハイドロゲル化のための蛍光標識前駆体を合成した（図6）。培養HeLa細胞にハイドロゲル化剤前駆体を500μMの濃度で添加すると、わずか5分後に細胞内に高密度の繊維ネットワークが形成された。この驚くべき結果は、この陰イオン種がエンドサイトーシスを迂回し、細胞膜上を単純に拡散するのに十分な親油性であることを示している。興味深いことに、自己組織化構造の空間プロファイルは、異なる細胞全体で一貫しており、ナノファイバーは核の近傍と小胞体（ER）の領域に存在していた[34]。自己組織化がERに由来することを確認するために、ERに存在することが知られているホスファターゼPTP1Bを阻害した。阻害剤と前駆体を1時間共インキュベートした後、PTP1Bを阻害すると、NBD蛍光が有意に低下した。これはNBD蛍光が疎水性線維内で増加することから、線維形成が減少していることを明確に示している。全体として、これらの結果は、ホスファターゼPTP1Bが脱リン酸化とそれに続くナノファイバーへの自己集合に重要な役割を果たしていることを示している。

続く論文で、Xuのグループは、細胞周囲、すなわちHeLa細胞の周囲にファイバーネットワークを形成することを報告した[35]。ここでは、小さなD-ペプチド誘導体（ナフタレン-Phe-Phe-Tyr）を用い、負に帯電したリン酸基で修飾した（図7）。むしろ驚くべきことに、nap-Phe-Phe-Lys(NBD)-Tyr（すべてL-アミノ酸）をHeLa細胞に添加すると、5分以内に細胞内に緻密な線維ネットワークができることが以前に観察された[33]が、ここでは構造的に類似したD-ペプチドがHeLa細胞の周囲に細胞周囲の線維ネットワークをもたらした。この違いは、NBDで官能基化されたリジン残基、あるいは立体化学の違いによって生じたのかもしれない。典型的な実験では、化合物D-1を表面および分泌性ホスファターゼを過剰発現していることが知られているHeLa細胞に添加した。これらの酵素はリン酸基を認識し、その後切断する能力があるため、D-1をがん細胞に添加すると、細胞膜の近くにハイドロゲル化剤D-2が形成され、細胞の周りに合成繊維ができる。HeLa細胞周辺でのゲル形成は肉眼で観察できたが、同濃度のD-2をHeLa細胞に添加してもゲル形成は起こらなかった。この結果は、D-1が主に細胞表面でD-2に変換され、ハイドロゲル化剤の濃度を局所的に上昇させ、この化合物の繊維への自己集合を可能にしていることを強く示している。クライオSEMとTEMを用いて、HeLa細胞周囲の繊維状構造が可視化され、平滑な表面を示す典型的なHeLa細胞と、細胞表面に多孔性構造が存在することが明らかになったD-1をインキュベートした細胞との違いが強調された。重要なことは、非がん細胞（すなわちEct1/E6E7）は、共焦点顕微鏡で確認されたように、細胞膜周辺での繊維形成を触媒しなかったことである。

図7. A) 酵素触媒による細胞膜近傍での繊維形成。B) 自己組織化前駆体（D-1）と自己組織化剤（D-2）の分子構造。[35] Copyright 2014, Wiley-VCH.

これらの細胞は表面ホスファターゼ活性がはるかに低いため、この発見は、酵素触媒による繊維形成が提案されていることを裏付けている。興味深いことに、HeLa細胞の細胞膜周辺にファイバーが形成されると、DNA結合色素DAPI（核マーカー）は細胞内に入ることができなくなった。未処理のHeLa細胞はDAPIを容易に核内に取り込む。特にDAPIの分子量が低い（277g mol1）ことを考えると、この結果は、人工細胞周囲ハイドロゲルの形成によって、細胞膜を越える分子の輸送が著しく妨げられることを示している。さらに、細胞周囲のゲルには大量の分泌タンパク質が含まれており、これらのタンパク質が培養液に入るのを防いでいることがわかった。全体として、ハイドロゲルは小さな分子の輸送さえも効果的にブロックし、遊走、接着、増殖などさまざまな細胞プロセスに大きな影響を与える。

Pires、Ulijnと共同研究者らによる後の論文[36]では、芳香族炭水化物両親媒性物質（図8）のナノファイバーへの自己組織化挙動を利用して、がん細胞の細胞膜にナノファイバーを形成するために同様の戦略が用いられた。

実験デザインはXuグループと同様である。表面および分泌型ホスファターゼによって、前駆体から負に帯電したリン酸基が切断されると、ハイドロゲル化剤が局所的に形成される。この研究では2つの細胞株、すなわちSaOs2とATDC5を用いたが、前者は高レベル、後者は低レベルのホスファターゼを発現している。この2つの細胞株に前駆体を添加すると、SaOs2がん細胞の細胞生存率は10％まで低下したが、ATDC5細胞はほとんど影響を受けなかった。この結果は、細胞周囲のゲル形成が効率的かつ特異的にがん細胞を死滅させることを示しているが、その生物学的効果の正確なメカニズムは詳しく調べられていない。自己組織化がフォスファターゼによって引き起こされたことを確認するため、SaOs2細胞にピアスフォスファターゼ阻害剤を添加した。阻害剤を添加したところ、SaOs2細胞は前駆体の影響を受けなかったことから、ナノファイバー形成のメカニズムには表面および細胞外のホスファターゼが必要であることが明らかになった。膜結合型ホスファターゼと細胞外ホスファターゼの影響を分離するために、それぞれの活性を個別に測定した。その結果、膜結合型ホスファターゼ活性は2つの細胞株で著しく異なる（すなわち15～20倍）のに対し、細胞外ホスファターゼ活性は1.5～2.0倍しか違わないことがわかった。したがって、細胞膜に結合したホスファターゼによる脱リン酸化が、細胞膜近傍での糖鎖のナノファイバーへの自己集合に大きく寄与している可能性が高い。

村山のグループは、脂質化ペプチドを基に自己集合のための前駆体を設計した（図9）[37]。腫瘍の転移に関与するタンパク質MMP-7は、ER-C16のLeu-Ala-Arg-Lysのペプチドセグメントを切断し、ゲル化剤G-C16を生成することができる。特異的プロテアーゼの使用は、細胞の特異性を高め、自己組織化した繊維ネットワークの位置を合理的に制御できる可能性があるため、興味深い発展である。G-C16は、アルキル鎖間の疎水性相互作用と残りのペプチドセグメントの水素結合により、水性溶媒中で繊維状に自己組織化する。対照的に、ER-C16は酵素による切断の前に正電荷を帯びたアミノ酸が存在するため、繊維状に自己組織化しない（代わりにミセル構造が形成される）。

ER-C16とG-C16の毒性を調べるために、HeLa細胞と微小血管内皮（MvE）細胞が選択された。前者はMMP-7を排泄することが知られているが、後者は排泄しない。興味深いことに、どちらの化合物を添加してもHeLa細胞は細胞死を誘導したが、G-C16だけがMvE細胞の生存率を有意に低下させることができた。これらの結果は、G-C16のみがそれ自体で毒性を示すのに対し、ER-C16の添加は酵素をトリガーとするゲル化によって細胞死を引き起こすことを示している。その後、前駆体ER-C16を様々ながん細胞に添加したところ、これらの細胞の生存率に有害であることが示されたが、MMP-7をはるかに低いレベルで含む2つの健康な細胞株（MvEとPE）はほとんど影響を受けなかった。自己組織化構造の動態を調べるために、蛍光標識した繊維の光脱離実験を行った。その結果、蛍光は40分間回復しないことが観察され、生体分子の輸送を制限する可能性のある高度に静的な構造であることが示唆された。ゲル化の場所について著者らは、MMP-7は細胞から排泄されるため、G-C16は細胞の周囲に形成されるが、ゲル化は細胞内で起こると主張している。しかしながら、共焦点画像は、繊維が主に細胞膜に存在することを示しているようだ。

in situハイドロゲル化の最後の例は、悪性細胞の除去を目的としたものではなく、マイクロメートルサイズの血管の縫合を補助することを目的としたものであった。研究者らは、-ヘアピン相互作用に基づいてハイドロゲルを形成するペプチドハイドロゲルターを構築した。興味深いことに、シアーをかけると、ペプチドが展開してハイドロゲルが溶解する。さらに、シアーを取り除くと、ネットワークはすぐに回復する。これらの特性により、研究者らは切断した血管の両端にハイドロゲルを注入し、血管径を広げて縫合の準備をすることができた。縫合後のハイドロゲルの除去は、ペプチドのコアにグルタミン酸残基を配置することで実現した。当初、このアミノ酸残基は光脱離基で保護されていたが、ハイドロゲルに放射線を照射するとブロック基が除去され、不安定なハイドロゲルネットワークが得られた。マウスに適用したところ、光照射後、縫合した血管を通る優れた血流が観察された。

全体として、自己組織化した繊維状ネットワークをがん細胞の内部や周囲に特異的に構築する戦略は、抗がん剤治療法を開発する上で非常に興味深いアプローチであることが示された。しかしながら、ファイバー形成がどのようにしてアポトーシスを誘導するのかの解明や、ファイバーネットワークの位置（細胞内または膜）を制御する合理的なアプローチなど、いくつかの問題には注意を払う必要がある。

3.3. 治療用ペプチド両親媒性繊維

ペプチドの分子間相互作用は、自己組織化によってナノスケールの秩序構造を形成するために調整することができるため、材料化学におけるペプチドの利用は非常に有益である[3a,39]。ペプチド両親媒性物質は通常、単一のアルキルテールに共有結合した親水性ペプチドから構成されている。通常、1本のアルキルテールを持つ両親媒性ペプチドは、球状のミセルに自己集合するが、通常、ペプチドはアルキル鎖の近くにβシートドメインを含むため、しばしば伸長した繊維が形成される。従って、ペプチド-ペプチド相互作用を調整して、凝集体の全体的な形態を制御することができる。さらにアミノ酸を組み込むことで、繊維のコロナを形成し、それによって例えば繊維上の結合エピトープや電荷を通して、ペプチド両親媒性繊維と細胞膜やタンパク質との相互作用を制御することができる。ペプチド両親媒性繊維を生物活性材料として研究した最近の研究について、主に細胞毒性、生体内注入時の生体内分布、治療用ペプチドのデリバリーについて述べる。前節とは対照的に、ここで取り上げるペプチド両親媒性繊維は生体外で形成され、ゲルネットワークを形成しない。ペプチド両親媒性分子の組織工学的応用に関する進展については、最近の優れた総説があるので、ここでは触れない[9]。

興味深い貢献として、Stuppのグループは、ペプチド両親媒性（PA）ナノファイバー内の凝集力が、哺乳類細胞に対する毒性に及ぼす影響を調べた[40]。

PA1もPA2もC16疎水性尾部を持ち、水溶液中に分散させるとPAの凝集を引き起こす。さらに、両ペプチド両親媒性物質は、C末端に3つのリジン残基を持ち、ペプチド構造体に正電荷を与え、PAファイバーと負電荷を持つ細胞膜との間の静電的相互作用を可能にする。PA1がコアにグリシン残基を含むのに対し、PA2はβシート形成を促進するバリンを含む。培養したMC3T3-E1細胞にPA1を添加すると、細胞の生存率が強く低下した。重要なことは、ペプチドセグメント単独でも、PA1のアニオン性アナログでも毒性がないことがわかったことである。さらに、アルキルテールを減少させ（炭素原子数16から12へ）、リジン残基を1つ取り除くと、細胞毒性が減少した。興味深いことに、PA2は自己組織化構造が似ているにもかかわらず、無毒性であることがわかった。著者らは、毒性が減少したのはペプチド鎖間の分子間相互作用が強くなったためだと仮定した。これを確認するための直接的な調査は行われなかったが、X線と電子常磁性共鳴（EPR）測定から、PA2が強く安定したH結合を示すのに対し、PA1はより動的で拡散性の散乱パターンを示すことが明らかになった。

Stuppグループによる別の貢献では、pH感受性の繊維やミセルに自己集合するペプチド両親媒性分子が、がん細胞に対する毒性、薬物をカプセル化する能力、マウスに注射したときの生体内分布について研究された（図10、PA3とPA4）[41]。ヒスチジン残基のイミダゾール側鎖のpKaは6.0であるため、わずかに酸性の条件下では、両方のペプチド両親媒性分子のβシート水素結合が破壊され、その結果、分解が起こると予想された。デザインは似ているが、PA3は繊維状に自己組織化したのに対し、PA4はpH7.5で球状ミセルを形成した。クライオTEMとSAXSのデータから、pHを6.0に下げると、PA3とPA4は溶解することがわかった。これら2つの集合体のがん細胞に対する毒性のpH感受性を調べるため、異なるpHで培養したMDA-MB細胞に化合物を添加した。興味深いことに、PA3繊維（pH7.5）は無毒性であったが、モノマー（pH6.0）は強い毒性を示した。これは、pH6.0の正電荷がペプチド-両親媒性膜相互作用を可能にするのに対し、中性の繊維は比較的安定であるため不活性であるためと考えられる。しかし驚くべきことに、PA4は逆の傾向を示し、pH6.0では毒性を示さず、pH7.5ではわずかな毒性を示した。

7.5. 球状ミセル（PA4）と繊維状ミセル（PA3）の毒性の違いは、自己組織化構造の形態が生体膜との相互作用に影響を与えていることを示唆しているが、そのメカニズム的背景を解明するには詳細な調査が必要である。さらに、正電荷を帯びたPA3モノマーに毒性があり、PA4モノマーに毒性がない理由は不明である。最後に、PA3およびPA4を含む溶液を担癌マウスに注射し、凝集体の形態がこれらのPAの生体内分布に及ぼす影響を調べることができた。ここでは、形態が大きな影響を及ぼし、繊維状のPA3集合体は主に腎臓、肝臓、腫瘍に集積したのに対し、ミセル状のPA4集合体は主に肝臓に集積した（注射後12時間）。これらの結果は、クリアランスと循環挙動は自己組織化物質のサイズと形態に大きく依存し、粒子が小さいほど安定性が低く、腎系による濾過を受けやすいことを示している。

Stuppグループは、C16アルキルの尾部に共有結合したペプチド（KLAKLAK）2を含むペプチド両親媒性物質を開発した[42]。このペプチド配列は非常にプラスに荷電しているため、がん細胞は健康な細胞よりもマイナスに荷電していることから、抗腫瘍治療薬としての可能性がある。KLAK PAは、TEMイメージングで示されるように、水性溶媒に分散させると繊維状に自己組織化する。このペプチド両親媒性のがん細胞に対する毒性を調べるため、集合体を乳がん細胞に添加した。PAのIC50値はマイクロモル領域であるのに対し、ペプチド単体では無毒性であることがわかった。PA繊維は繊維表面に高濃度の(KLAKLAK)2ペプチドを局所的に含んでいるため、毒性を引き起こすメカニズムであることが判明している膜溶解を助けると考えられる。続く論文[43]では、KLAK PAを、アルキル尾部、中性ペプチド、PEG鎖を含むPAと混合し、PEG PAを得た。PEGは、治療ペプチドの分解を防ぐスクリーニング効果や、炎症反応を防ぐサイレンシング効果を示すことがよく知られている。興味深いことに、混合集合体（1:1 KLAK PA/PEG PA）はタンパク質分解加水分解に対してより優れた抵抗性を示したが、がん細胞に対する有効性は維持された。最後に、混合集合体を担癌マウスに添加した。その結果、KLAK PAとKLAK/PEG PA投与の両方が、対照群よりも有意に腫瘍を小さくすることが観察された。この混合PA系は、自己組織化の大きな長所の一つである、2つ以上の成分を混合することによって新しい材料特性を容易に開発できるということを、エレガントに明らかにしている。ここで観察されたように、均一な集合体は、集合体の混合物を用いて形成することができる。将来的には、複数の機能性を持つ混合集合体を設計・開発することが可能になり、生物学的プロセスへのより高度な介入や、細胞の挙動を正確に指示することができるようになるだろう。

L/Dペプチド線維の安定性、生体内分布、毒性に関する詳細な研究が、Ding、Kong、Liuと共同研究者らによって行われた。TEM分析の結果、どちらのペプチドも繊維状に自己組織化することがわかった。血漿中で繊維を形成させたところ、D-ペプチド繊維は24時間まで非常に安定であったのに対し、L-ペプチド繊維の密度は同じ時間中に強く減少した。次に、線維の生体内での安定性を評価した。線維をナイルブルーで染色し、健康なマウスに注射した。注射の0.5時間後と1時間後に血液を採取すると、共焦点顕微鏡で多数のD-ペプチド線維が確認できたが、L-ペプチド線維は観察されなかった。しかし、注射後6時間経過してもD-ファイバーは観察されず、その後、両ペプチドのチロシン残基に結合した125I標識から放出されるガンマ線を分析することによって、ファイバーの生体内分布を調べた。驚くべきことに、ペプチド繊維のキラリティは、これらの自己組織化構造の運命に劇的な影響を与えた。D-ファイバーが主に肝臓で終わるのに対し、L-ファイバーは主に胃に存在する。重要なことは、12時間後にはどちらのタイプの線維もマウスから排出され、代謝分解が速いことが明らかになったことである。自己組織化構造の一過性の性質は、反復投与による毒性作用の蓄積は期待できないことを示している。次に著者らは、健康なマウスに繊維を5日間連続で静脈内投与し、毒性を評価した。潜在的なダメージ効果を調べるため、生化学的指標のライブラリーをモニターした。その結果、L繊維もD繊維も肝臓や腎臓の機能に変化を起こさず、炎症反応も起こさないことがわかった。Uchegbuの研究グループは、血液脳関門（BBB）を越えて治療用ペプチドを送達するのに使用できるペプチド両親媒性物質を構築した。TEM測定で示されたように、これらのペプチド両親媒性物質は自己組織化して線維状凝集体になった。驚くべきことに、ダラルギン自体は血漿中で急速に分解されるのに対して、LCMS分析によって、ペプチド両親媒性物質は血漿、肝臓、そしてさらに重要なことに脳で追跡できることが明らかになった。しかも、その濃度は薬理学的反応を引き起こすのに十分であった。これらの知見を説明するために、X線、線形二色性（LD）、分子動力学シミュレーションがこれらのペプチド両親媒性繊維に用いられた。その結果、ペプチド部分は繊維のコアにしっかりと巻きつき、分解から保護されていることがわかった。全体として、この結果は、これらのペプチド両親媒性物質がBBBを通過する能力があり、エステラーゼによるエステル結合の加水分解によって放出される治療用ペプチドのリザーバーとして機能することを示している。

このセクションで述べた例は、自己組織化ペプチドの多用途性と（かなりの程度）プログラム可能性を示している。アミノ酸配列に基づいて、ペプチド間の相互作用を制御することができ、繊維膜相互作用の制御が可能になる。さらに、親水性と電荷を調整することもでき、例えばペプチドが細胞に取り込まれるか、細胞膜を撹乱できるかを制御することができる。

3.4. 薬物送達のための両親媒性薬物複合体

生物医学の分野では、治療薬の効率的な送達が主な課題の一つである。この分野の中心的な問題は、多くの薬物の水溶性の低さ、酵素による薬物の分解、血流からの薬物の迅速な除去である。これらの問題を解決するために、リポソーム[46]、高分子ナノ粒子[47]、無機材料[48]などの担体の利用が、ここ数十年で非常に普及してきた。しかし、これらの担体には重大な欠点があり、最も重要なことは、担体の分解、代謝、排泄の過程で、低い薬物担持能（通常2～5wt％）と副作用（毒性や炎症など）に悩まされることである。ここ数年、ナノ凝集体への薬物コンジュゲートの制御された自己集合に基づく、別の薬物送達戦略が開発されている。薬物分子を親水性の自己組織化セグメント[49]（例：ペプチドやゲル化剤）に共有結合させることで、制御された自己組織化により、最大50wt％の薬物を含み、タンパク質分解から薬物を保護し、血流中での滞留時間を延長する凝集体が得られる。興味深いことに、全体的な分子構造に基づいて、様々な凝集体の形態や粒子径を得ることができ、これらは細胞内への取り込みに影響を与えることが知られている。さらに、薬物と親水性セグメントとの間に（生体）分解性リンカーを使用することで、酵素作用に基づく薬物の標的放出を可能にすることができる。本節の残りの部分では、最近の文献例を用いて、このアプローチの分子的詳細と有効性を評価する。

Cuiのグループはまず、薬物-ペプチド結合体の自己組織化と、生物学的環境におけるその特性を研究した[50]。疎水性抗がん剤カンプトテシン（CPT）を、分解性リンカー（酪酸ジスルフィル、BUSS）を介して、-シート形成ペプチドに結合させた。この基本設計に基づき、1、2、4個のCPTユニットを含む3つの誘導体が合成された（図11A）。従って、薬物-ペプチドの薬物含量は23、31、38wt%であり、一般的に数wt%の含量に制限される従来の担体方法論と比較して、このアプローチの主な利点のひとつが明らかになった。これらのコンジュゲートを水溶液に分散させると、CPTコアとペプチドコロナを持つすべての化合物について、ファイバーへの自己集合が起こった（図11B）。

図11. A）薬剤両親媒性物質の模式図と分子図、（B）水性媒体への薬剤両親媒性物質の分散による繊維形成の漫画。50] Copyright 2013, American Chemical Society.

興味深いことに、CPT分子の数が増えるにつれて繊維は短くなった。これはCPTユニット間の- 相互作用の数が増えたためと思われる。薬物ユニットはペプチドセグメントによって遮蔽されているため、ここでの自己集合は薬物の分解を防ぐ働きをする。さらに、酪酸ジスルフィルの還元による薬物の放出は、集合体の安定性によって制御できる可能性がある。著者らは、自己組織化材料にGSHを添加すると、テトラCPTを用いた場合はCPTの放出が遅くなり、ジCPTまたはモノCPTを用いた場合は放出が速くなることを示している。興味深いことに、自己組織化構造を3つのがん細胞株（MCF-7、9L、F98L）に添加したところ、diCPT誘導体が最も高い効果を示し、次いでtetraCPT、最後にmonoCPTとなった。化合物の有効性は、特に親水性／疎水性比の複合関数である可能性が高い。この比率は、薬物-ペプチド結合体の細胞内取り込みと、自己組織化構造の安定性、結果として生じる薬物の遮蔽と分解速度の両方を制御する。TetraCPTは疎水性であるため細胞に取り込まれやすいが、リンカーは自己組織化構造の安定性が高いため、GSHによる分解から保護される。したがって、中間構造のdiCPTは抗癌剤として最も有効である。薬物-ペプチド結合体はいずれも、この条件下では純粋なCPTほどがん細胞に対して有効ではなかったが、半減期時間や細胞への取り込みから、in vivoでの性能は純粋な薬物よりも優れている可能性がある。

薬剤両親媒性分子の有効性を向上させるため、Cuiグループは、薬剤-ペプチド結合体の抗がん作用の最適化を目指して、リンカー部分を調整した続報を発表した。ジスルフィルブチレートを炭酸塩ベースのリンカーに交換することで、CPTの放出速度が増加し、純粋な薬物の効力が回復した。さらなる貢献として、このペプチドは、GSH感受性リンカーで連結された疎水性抗がん剤パクリタキセルと共有結合した。純粋な薬剤と比較して、薬剤両親媒性化合物は細胞培養条件下で同程度の細胞生存率を示した。

続く研究で、Cui研究グループは、抗がん治療薬の局所送達を目的とした別の自己組織化材料を探索した。ここでも、疎水性薬剤としてCPTが用いられた。しかし、ここでは、2つのリジン残基（陽性）または2つのグルタミン酸残基（陰性）で末端をキャップしたβシート形成ペプチドを用いて、陽イオン性薬物と陰イオン性薬物のコンジュゲートが合成された[53]。さらに、CPTとペプチドセグメントは、還元可能なジスルフィドリンカーを介して連結され、GSHによる還元によって薬物が放出されるようにした。CPTを1残基、2残基、4残基含む両親媒性物質が合成されたが、中でも4官能化された両親媒性物質（qCPT-Sup35-K2/E2）が最も興味深く、36％の薬物を含有していた。これらの両親媒性化合物（アミンとカルボン酸のモル比はそれぞれ1：3）をMeCNとH2Oの1：1混合溶媒中で混合すると、幅約100nm、長さ数μmのチューブ状構造が観察された。しかし、個々の両親媒性化合物は、幅およそ6nmの繊維状の構造に集合した。カタニオンチューブには36％の抗がん剤が含まれており、ジスルフィド結合の切断後に放出される可能性があることから、これらの自己組織化構造は、ゆっくりと放出される薬剤分子のリザーバーとして機能する可能性がある。このドラッグデリバリービークルのin vivoでの有効性をテストするため、この材料の溶液をマウスの腫瘍に注入した。チューブをCy7.5で蛍光標識したところ、自己組織化物質のかなりの量が腫瘍組織内に36時間以上存在したのに対し、遊離の蛍光プローブはもっと急速に消失した。これらの結果は予備的なものであり、両親媒性薬物構造体の有効性を完全に調査したわけでも、生体内におけるラグの放出を示したわけでもないが、これらのカタニオン性ナノチューブがCPTの耐性かつ安定した貯蔵庫として機能する可能性を示しており、腫瘍局所治療に役立つ可能性がある。

この設計を達成するために、CPTはジスルフィドリンカーを介して、重合可能なメタクリレートハンドルで共有結合的に修飾された。RAFT重合により、この化合物はPEGセグメントから重合された。得られたブロック共重合体（図12）の自己組織化は、まずブロック共重合体を有機溶媒に溶解し、次いで水をゆっくりと加えることで開始した。驚くべきことに、有機溶媒の選択と水の添加速度によって、円盤、千鳥状ラメラ、大型複合小胞（LCV）、球状ナノ粒子という4つの異なる集合形態が得られた（図12）。分子を有機溶媒に溶かして粒子を調製し、後でゆっくりと水性溶媒を加える方法では、これらの粒子が真の自己組織化によって形成されるのか、むしろ沈殿型のプロセスなのか、完全には明らかではない。ここで、粒子内の分子成分の分子スケールでのパッキングを知る必要がある。しかし、そのようなデータは現時点では入手できないため、これらの粒子が本当に自己組織化された凝集体であるかどうかは不明のままである。それにもかかわらず、この例とそれに続くいくつかの例では、観察された粒子の形と大きさは、使用した両親媒性分子の化学的・物理的特性を考慮すると、典型的な自己組織化プロセスから予想されるものである。

図12. ポリプロドラッグコポリマー、自己組織化によりアクセス可能な様々な形態、およびこれらの集合体の細胞内取り込みのメカニズムを模式的に示す。[54] Copyright 2013, American Chemical Society.

すべての集合体は50wt％以上の薬物を含んでおり、その形態の影響を調べるために、HepG2細胞による自己集合体の取り込みが研究された。興味深いことに、千鳥状のラメラもLVCもエンドサイトーシスを避けて細胞に入った。したがって、これらの自己組織化構造体によって細胞質領域全体がアクセスされた。対照的に、滑らかな円盤と球体はどちらもエンドサイトーシスを介して細胞に入り、その結果、これらの集合体は培養の初期段階でエンドソームやリソソームに捕捉された。生細胞内は還元的な環境であるため、著者らはCPTユニットだけでなくポリマー骨格にも蛍光プローブを導入し、細胞内薬物放出を調べた。平滑円盤、スタッガード・ラメラ、LVCを細胞とインキュベートすると、ジスルフィド還元によりこれらの蛍光色素が明確に分離し、CPTの運命は主に細胞核に、ポリマー骨格は細胞質に留まることが明らかになった。重要なことは、がん細胞に対する集合体の毒性は、球体を除いて純粋なCPTと同等であったことである。最後の研究では、集合体を健康なラットに注射して、生体内での血液安定性をテストした。重要なのは、細胞質のGSH濃度がmMの範囲にあるのに対し、血漿にはμM濃度のGSHしか含まれていないことである。その結果、自己組織化構造の半減期はかなり長くなった。さらに、千鳥状ラメラの半減期時間（7.62時間）は、滑らかな円盤（2.92時間）やLVCや球体（1時間）よりも有意に長いことがわかり、その優れた安定性が示された。

薬物分子の自己組織化を薬物送達に利用するという興味深いアプローチが、Zhu、Yanとその共同研究者らによって提案された。彼らの研究では、2種類の抗癌剤（すなわち、イリノテカンとクロラムブシル）を加水分解性エステル結合を介して共有結合させた[55]。イリノテカンは親水性であり、クロラムブシルは疎水性であるため、薬物結合体は水中で自己組織化し、直径約100nmのナノスフェアを形成する。次に、イリノテカン-クロラムブシルの毒性を測定し、遊離イリノテカン、遊離クロラムブシルおよびそれらの混合物と比較した。興味深いことに、臨界凝集濃度（CAC）以下では、イリノテカン-クロラムブシル結合体はイリノテカンおよびイリノテカン／クロラムブシル混合物よりも優れていた。しかし、CAC以上では、両親媒性薬物結合体はMCF-7とHeLaの両細胞に対して有効性を示した。この所見は、両親媒性薬物のナノ粒子への自己集合が、細胞への取り込みと全体的な効率を助けていることを強く示している。次に、多剤耐性（MDR）細胞（MCF-7/ADR）に対するイリノテカン-クロラムブシルの殺傷効率を評価した。一般に、ナノ粒子は活性型排出（すなわち、MDR細胞が示すような、細胞からの治療薬の積極的な除去）を防ぐことができる。MDR細胞では、遊離のイリノテカンの取り込みが50ないし60倍減少したのに対し、イリノテカン-クロラムブシル結合体の細胞内取り込みは2倍しか減少せず、イリノテカン-クロラムブシル凝集体の排出に対する有効な抵抗性を示した。この結果は、イリノテカン-クロラムブシルと遊離薬のIC50値をMCF-7とMCF-7/ADR細胞で測定したときにも確認された。MDR細胞では凝集体のIC50が13μMから15μMに増加しただけであったのに対し、遊離の薬剤では薬剤が活発に排出されたためにIC50値が20倍に増加した。その後の研究では、両親媒性のイリノテカン-クロラムブシルまたは遊離の薬物をマウスに注射した。まず、イリノテカンチロラムブシルがナノ凝集体に自己集合するため、遊離の薬物に比べて保持時間が有意に延長することが示された。その結果、両親媒性薬物結合体の腫瘍に対する有効性は、腫瘍体積がイリノテカン／クロラムブシル混合物よりも約2倍小さく、陰性対照群よりも約3倍小さかったことから、遊離薬物よりもはるかに高かった。

ブロックコポリマーの集合体は、治療や診断の目的で広く応用されている。最近、Gianneschiと共同研究者らは、パクリタキセルを腫瘍組織に選択的に送達するための興味深い自己集合に基づくアプローチを考案した[57]。研究者らは、パクリタキセル（疎水性）と、がん細胞で過剰発現しているマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）によって認識・切断されるペプチド（親水性）を含む両親媒性ブロックコポリマーを構築した。この化合物は自己集合してミセルとなり、その外側にペプチド部分を持つ。がん細胞内に拡散すると、ペプチドユニットが除去され、大きな自己組織化構造が形成された。これが起こると、自己組織化構造は悪性細胞内に捕捉される。パクリタキセルはエステル結合を介してポリマーに共有結合していたため、この結合が加水分解されると遊離の薬物が得られる。MMP応答性ナノ粒子の有効性をマウスで試験し、著者らは、この材料が主に腫瘍組織内に留まり、がん細胞に対するナノ粒子の有効性はパクリタキセル単独と同等であることを示した。しかし、この効果が薬物の放出のみによるものなのか、凝集体のサイズの増大によるものなのかは明らかにされなかった。

全体として、安定な凝集体に自己集合する治療薬を含む両親媒性分子の使用は、薬物送達デバイスとして大きな可能性を示している。この戦略は、タンパク質分解に対する薬物の保護や血流中での寿命の拡大など、ナノ粒子薬物送達ビヒクルの有利な特徴を有している。さらに、薬物キャリアに対する薬物自己集合体の主な利点は、薬物キャリアでは通常2～5％、両親媒性薬物では最大50％という高負荷である。さらに、切断可能なリンカーを設計に組み込むことで、癌細胞に対する両親媒性薬物の有効性を向上させ、酵素作用により薬物を放出させることができる。

4. 結論と展望

本過程報告で取り上げた研究は、生物学的環境における合成分子の自己集合が、生物活性物質の形成に多大な可能性を秘めていること、そしてこの新たな分野が、化学生物学と医学において重要な分野になる可能性があることを示している。従来の治療薬やイメージング・ツールが、一般的に個々の分子の作用に基づいているのに対し、自己組織化に基づくアプローチは、秩序だった生物活性物質の形成を目指している。このようなナノ凝集体の形成は、薬物の分解からの保護から、高効率イメージング材料につながる蛍光の濃縮や局在化に至るまで、重要な展望を可能にする。さらに、自己組織化により、生物活性エピトープで凝集体表面を簡単に機能化することができ、生体物質との相互作用を高めることができる。例えば、様々な官能基を持つ両親媒性化合物を混合するだけで、異なる官能基を正確に制御された濃度と比率で表面に持つ集合体を設計することができる。集合体は、多くの生物学的超分子構築物（例えば細胞膜や細胞外マトリックス）と同様の強度の相互作用によって保持されるため、自己組織化したオルガネラや膜と相互作用し、その構造や機能を変化させることができる可能性がある。さらに、細胞内繊維ネットワークの形成は、細胞の代謝活性の低下につながる可能性がある。このような繊維ネットワークの位置を正確に制御し、機能化することができれば、この基本的なスキームをさらに高度に医療応用することが可能になるかもしれない。機能化されたネットワークは、有害なDNA/RNA配列やタンパク質と結合し、それらを選択的に不活性化することができる機能性基のリザーバーとして機能する可能性がある。

明らかに、自己組織化が起こる場所を制御することは大きな課題である。私たちは、自己組織化を引き起こすきっかけは、主に自己組織化を阻害する基の酵素的切断に限られていることを観察してきた。近い将来、化学的勾配、圧力やせん断などの機械的な力、あるいはpH[4]（がん細胞は通常、正常組織よりも低いpHを示すため）など、さまざまな生物学的刺激に応答して自己集合が起こるシステムが開発されることになりそうだ。同様に、光、磁場[5]、局所加熱などの外部刺激も、局所的な集合と生物活性を制御するために使用することができる。さらに、自己組織化の時間的制御は、これまで取り組まれてこなかった問題である。[58,59]。このようなシステムでは、一過性の自己集合を駆動するために化学エネルギー（燃料）の投入が必要であり、その結果、活性化されたビルディング・ブロックが非自己集合性分子に戻るにつれて、時間とともに溶解する集合体が形成される。医学の観点で言えば、これは治療用の自己組織化構造体（例えば、細胞外繊維ネットワーク）を設置することにつながる。

謝辞

オランダ科学研究機構（R.E.へのNWO VIDI助成金）に感謝したい。

受領した： 2015年10月13日

改訂された： 2016年1月11日

オンライン公開された： 2016年4月4日