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SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8167834/
2021 Jun 1
William T. Harvey,#1,2 Alessandro M. Carabelli,#3 Ben Jackson,4 Ravindra K. Gupta,5 Emma C. Thomson,6,7 Ewan M. Harrison,3,7 Catherine Ludden,3 Richard Reeve,1 Andrew Rambaut,4 COVID-19 Genomics UK (COG-UK) Consortium, Sharon J. Peacock,3 and David L. Robertsoncorresponding author2
要旨
重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）ゲノムのほとんどの変異は、有害で速やかに除去されるか、比較的中立であると予想されるが、ごく一部の変異は機能的特性に影響を与え、感染性、疾患の重症度、あるいは宿主免疫との相互作用を変化させる可能性がある。2019年後半にSARS-CoV-2が出現した後、約11カ月間、相対的な進化の停滞期が続いた。しかし 2020年後半以降、SARS-CoV-2の進化は、おそらくヒト集団の免疫プロファイルの変化に対応して、伝達性や抗原性などのウイルスの特性に影響を与える「懸念される変異」という文脈で、一連の変異が出現していることが特徴となっている。ワクチン接種後の血清では、SARS-CoV-2の一部の亜種の中和が低下するという証拠が出てきているが、これがワクチンの効果にどのような影響を与えるかを評価するには、防御の相関関係をより深く理解する必要がある。とはいえ、メーカーはワクチン配列の更新に備えてプラットフォームを準備しており、突然変異の表現型への影響を明らかにするための実験と並行して、世界のウイルス集団における遺伝的および抗原的変化のモニタリングを行うことが極めて重要である。この総説では、主要抗原であるSARS-CoV-2スパイクタンパク質の変異に関する文献をまとめ、抗原性への影響やタンパク質の構造上の文脈に焦点を当て、世界中の配列データセットで観測された変異頻度との関連で議論する。
テーマ用語 ウイルス感染、タンパク質解析、ワクチン、SARS-CoV-2,ウイルスの進化
はじめに
COVID-19の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）は、2021年4月現在、世界で1億4,300万人以上の感染者と300万人以上の死亡者を出していると言われている1。ウイルスのゲノム配列はかつてない速さで作成・共有されており，GISAID（Global Initiative on Sharing All Influenza Data）では100万件以上のSARS-CoV-2の配列が公開されているため，展開するパンデミックをほぼリアルタイムでモニタリングすることが可能となっている2．病原体のゲノムをこのような規模で利用することで、ウイルスの国際的な広がりを追跡したり、地域的な発生を調査したり、公衆衛生政策に情報を提供したりすることができるようになり、ウイルスのゲノム調査の新時代が到来したことを示している3。疫学を理解するだけでなく、シーケンシングによって、新たに出現したSARS-CoV-2の変異体や、ウイルスの特性の変化につながる可能性のある一連の変異を特定することができる。
致死性の高い変異は速やかに除去されるため、循環しているSARS-CoV-2ウイルスから採取されたゲノムで観察される変異のほとんどは、中立または軽度の致死性であると予想される。というのも、ウイルスの適応やフィットネスに寄与する効果の高い変異は発生するものの、効果の低い、あるいは効果のない「ニュートラル」なアミノ酸の変化が許容されるのに比べれば、少数派になる傾向があるからである4。少数の突然変異は、少なくともいくつかの状況下では、ウイルスの表現型にフィットネス上の優位性をもたらすような影響を与えることが予想される。このような変異は、病原性、感染性、伝達性、抗原性など、ウイルス生物学の様々な側面を変化させる可能性がある。系統に存在するだけの突然変異と、ウイルスの生物学的性質を変える突然変異を混同しないように注意しなければならないが5,SARS-CoV-2がヒト集団の中で進化してから数カ月以内に、適応性を高める突然変異が初めて検出された。例えば、スパイクタンパク質のアミノ酸変化D614Gは 2020年4月に頻度が増加し、世界のSARS-CoV-2集団で数回出現したことが指摘されており、コーディング配列は高いdN/dS比を示していることから、コドン位置614での正の選択が示唆されている（参考文献6,7）。その後の研究で、D614Gは感染力8,9と伝達性に中程度の優位性を持つことが示された10。このレビューでは、特に抗原性に影響を与える変異に焦点を当てて、注目すべき他のスパイク変異をいくつか紹介する。
SARS-CoV-2の抗原表現型に影響を与える変異が、自然感染やワクチン接種による免疫を回避することを可能にするかどうかは、まだ決定されていない。しかし、SARS-CoV-2の抗原表現型を変化させる変異が流通しており、免疫認識に影響を与えていることを示す証拠が増えているので、早急な対応が必要である。スパイクタンパク質は、ウイルスが宿主の細胞表面の受容体に付着し、ウイルスと細胞膜の融合を仲介する11（囲み記事1）。また、スパイクタンパク質は、SARS-CoV-2の感染後に産生される中和抗体の主要な標的であり（参考文献12,13)使用が許可されているmRNAワクチンやアデノウイルスベースのワクチン、および承認待ちのワクチンのSARS-CoV-2構成要素でもある14。したがって、スパイクタンパク質の抗原性に影響を与える変異は、特に重要である。この総説では、スパイクタンパク質と抗体介在性免疫に焦点を当てて、これらの変異とその抗原性の影響に関する文献を調査し、グローバルな配列データセットで観測された変異頻度との関連で議論する。
Box 1 スパイクタンパク質の構造と機能
他のコロナウイルスと同様、重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）が宿主細胞に侵入する際には、ウイルスの表面でホモトリマーを形成する膜貫通型スパイク糖タンパク質が介在する。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質は高度にグリコシル化されており、3量体あたり66カ所のN-グリコシル化部位が存在する98,99（図4a）。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質は、翻訳後に哺乳類のfurinによって切断され、2つのサブユニットに分かれる。図4a）。S1サブユニットは、大部分がアミノ末端ドメインと受容体結合ドメイン（RBD）からなり、宿主細胞表面の受容体であるACE2との結合に関与している。一方、S2サブユニットはタンパク質の三量体コアを含み、膜融合に関与している（図4b）。S1とS2の境界には、サルベボウイルス亜属の中ではユニークな多塩基性のfurin切断部位が存在するが、これは感染性と病原性に重要であり100,furin切断は受容体結合に必要な構造変化を促進する50。スパイクタンパク質は、閉じた構造と、ヒンジのような動きでRBDを持ち上げた開いた構造の間で、一過性の構造変化を起こす50。RBDが上がった状態では、受容体結合モチーフを構成する残基が明らかになり、ACE2との結合が可能になる。ACE2が3つ結合した完全に開いた構造になるまで、徐々に開いた構造が誘導され、S2の鞘が外れて膜融合が始まる101。
図4スパイクタンパク質の配列の多様性と構造
a｜アミノ酸配列の多様性を示す重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質のドメイン構成。スパイクタンパク質は1,273アミノ酸のポリペプチドとして合成されるが、それぞれの位置での置換と欠失を含むアミノ酸変異体の頻度を示している。これらの変異体は、Wuhan-Hu-1参照配列と比較して、CoV-GLUE96を用いて同定された。CoV-GLUEは、低品質またはヒト以外の宿主に由来すると同定されたGlobal Initiative on Sharing All Influenza Data（GISAID）配列97をフィルタリングするものである（GISAIDデータベースから 2021年2月3日に検索された配列）。フィルタリング後の426,623個のゲノムのうち、1,267個のスパイク位置で5,106種類のアミノ酸の置換が確認され、そのうち259個の位置で320個が少なくとも100個の配列で観察された。また、置換だけでなく、特にアミノ末端ドメイン（NTD）内でいくつかの欠失が観察された。最も頻繁に検出されたNTDの欠失は、69位と70位の2残基の欠失（Δ69-70）で、45,898配列に存在する。b｜直立した受容体結合ドメイン（RBD）を持つスパイクタンパク質の単量体 c｜閉じた構造のスパイクタンパク質の構造を、三量体軸の垂直方向から見た表面表現（左）と、この軸に沿って直交する上から見た表面表現（右）と重ね合わせたもの。SARS-CoV-2スパイクタンパク質構造体のRCSBタンパク質データバンクIDは6ZGGと6ZGE50。マゼンタ色の球は糖鎖を、マゼンタ色の三角形はN-結合型糖鎖の潜在的な結合部位を表す。ハサミはアミノ酸位置685でのS1-S2境界を表す。CDは連結ドメイン、CTは細胞質尾部、FPは融合ペプチド、RBMは受容体結合モチーフ、TMは膜貫通ドメインを表す。
早くから注目されているスパイクの変異
2019年12月から 2020年10月までのSARS-CoV-2の進化速度は、世界の人口でウイルスが1カ月に約2回の変異を獲得することと一致していた15,16。スパイク変異の機能的影響についての理解は急速に拡大しているが、この知識の多くは、頻度が急速に増加しているか、異常な疫学的特徴と関連していると特定されたアミノ酸変化を反応的に調査したものである。D614Gの出現に続いて 2020年3月には、スコットランドで受容体結合モチーフ（RBM）内のアミノ酸置換、N439Kの頻度が増加していることが指摘された。このN439Kを持つ最初の系統（Pango命名法ではB.1.141と命名17）はすぐに絶滅したが、独立してN439Kを獲得した別の系統（B.1.258）が出現し、ヨーロッパの多くの国で広く流通している18。N439Kは、ACE2受容体への結合親和性を高め、感染から回復した人の血清中に存在する一部のモノクローナル抗体（mAb）やポリクローナル抗体の中和活性を低下させることから、注目されている18。ACE2結合親和性の増加に関連するもう一つのRBMのアミノ酸変化、Y453Fは、ヒトやミンクの感染症に関連する配列で同定され、注目を集めた。特にデンマークで同定された1つの系統は、当初「クラスター5」（現在のB.1.1.298）と名付けられた20。2020年11月5日の時点で、ミンクに関連するSARS-CoV-2に感染した214人のヒトは、全員が変異Y453F21を保有していた。また、B.1.1.298系統には、第2のN439K系統であるB.1.258系統を含め、世界のSARS-CoV-2集団で何度も出現しているアミノ末端ドメイン（NTD）欠失であるΔ69-70が存在する。Δ69-70は、露出したNTDループのコンフォメーションを変化させると予測され、感染力の増加に関連することが報告されている22。
ゲノム解析の結果 2020年11月頃から宿主環境が変化し、免疫学的に重要なSARS-CoV-2遺伝子に作用する選択圧が高まっていることが示された（参考文献23）。この時期には、それまで流通していた変異体に比べて、より多くの変異を持つ変異体が出現していた。これらの系統は、伝播性の増加と関連していることから、「懸念される変異体」と名付けられた。これらの系統は、複数の収束的な変異によって定義され、慢性的な感染の中で、あるいは過去に感染した人の中で発生したと仮定されている24-29。これらの新興亜種の伝達性と病原性を理解することに加えて、それらの抗原性と 2019年12月に初めて出現し、現在のすべてのワクチン製剤に使用されているウイルスと遺伝的および抗原的に類似した初期のウイルスによる感染によってもたらされる相互防御のレベルを特徴づけることが決定的に重要である。スパイクの変異が抗原プロファイルにどのような影響を与えるかについての情報は、構造研究、mAbやポリクローナル抗体を含む血漿にさらされたウイルスで確認された変異、部位特異的変異誘発法を用いた変異体の標的調査、変異発生の可能性を系統的に調査するディープ・ミューテーション・スキャニング（DMS）実験などから得ることができる。
スパイクの免疫原性領域
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の抗原性については、特定の抗体の抗原結合断片とスパイクタンパク質との複合体の構造を解明するなど、エピトープマッピングの手法を用いた研究がいくつか行われている13,30-32。約650人のSARS-CoV-2感染者を対象とした血清学的解析では、血漿中または血清中の中和抗体活性の約90%がスパイクの受容体結合ドメイン（RBD）を標的としていることが示された12。RBDの免疫優位性には、糖鎖の遮蔽が相対的に不足していることが寄与していると考えられる33。ある研究では、15種類のSARS-CoV-2 RBD結合中和抗体の構造、生物物理学、バイオインフォマティクスの解析結果が報告されている31。抗体のフットプリントは、mAb原子との水素結合やファンデルワールス相互作用の可能性が4.0Å以下であることを考慮したスパイク残基の構造解析によって作成された。構造解析の結果、RBD結合中和抗体は4つのクラスに分類された（図1a,,b):b）。すなわち、スパイクタンパク質をオープンコンフォメーションで結合するACE2阻害抗体（クラス1)RBDをオープンコンフォメーションとクローズドコンフォメーションの両方で結合するACE2阻害抗体（クラス2)ACE2を阻害せず、RBDをオープンコンフォメーションとクローズドコンフォメーションの両方で結合する抗体（クラス3)ACE2部位の外側でオープンコンフォメーションのみで結合する中和抗体（クラス4）31である。RBD内では、ACE2部位に重なるRBMエピトープが免疫優勢であるのに対し、他のRBD部位では、個人によって反応が低く、変動する12。
図1 構造解析とスパイクタンパク質の残基の特性によって定義された中和抗体のクラス
a｜重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質のアミノ酸残基を、エピトープに結合する抗体のクラスに応じて色分けしたもの。受容体結合ドメイン（RBD）抗体のクラス1～4（ref.31 )を示している。クラス1(スパイクタンパク質をオープンコンフォメーションで結合するACE2阻害抗体)は緑色、クラス2(RBDをオープンコンフォメーションとクローズコンフォメーションの両方で結合するACE2阻害抗体)は黄色、クラス3(ACE2を阻害せず、RBDをオープンコンフォメーションとクローズコンフォメーションの両方で結合する抗体)は青色、クラス4(ACE2サイトの外側でオープンコンフォメーションのみで結合する中和抗体)は赤色である。残基が複数のクラスのエピトープに属する場合は、ACE2をブロックし、クローズドスパイクタンパク質と結合する抗体に優先的に色をつける。アミノ末端ドメイン（NTD）のスーパーサイト30はマゼンタで着色されている。 b｜置換がポリクローナルヒト血漿中の抗体による結合に影響を与えたり、抗体のエスケープ変異として現れたりするアミノ酸残基の特性を示した整列したヒートマップ。受容体結合部位（RBS）を形成するACE2と接触する残基との距離をオングストロームで示している。各残基は、過去に感染した人（回復者）39-41,43,48またはワクチン接種を受けた人59の血漿中のモノクローナル抗体（mAb）40,43,47,48またはポリクローナル抗体による中和に影響を与える変異の証拠があるものとして分類されている（それぞれ「mAb効果」および「血漿効果」）。これらの残基の一部は、実験室でのmAb40,47,48または血漿40,41への曝露（co-incubation）により出現すると表現される変異がある（それぞれ、「mAb emerge」および「plasma emerge」）。観察結果に欠失が含まれている場合は、赤い印で示した。緑色の部分は、RBD変異体を発現させた酵母細胞をヒトの回復期血漿39の複数のサンプルとインキュベートしたディープ・ミューテーション・スキャニング（DMS）実験の結果を示している。ある残基のすべてのアミノ酸置換を平均したエスケープフラクション（つまり、ある変異がポリクローナル抗体の結合を低下させる程度の定量的な尺度）（「血漿平均」）と、最大の抵抗性を示す置換（「血漿最大」）を示している。ACE2結合親和性19に関するDMSデータは、赤または青の濃淡で示し、それぞれACE2親和性が高い、または低いことを示している。各部位のすべての変異を平均した結合親和性の変化の平均値（「binding average」）と、代わりに最大結合力を持つ変異体（「binding max」）を示した。スコアは、野生型基準アミノ酸に対する結合定数（Δlog10 KD）を表す。
RBDは免疫優勢であるが、抗原性において他のスパイク領域が重要な役割を果たしていることを示す証拠があり、特にNTD13,30,34が有名である。NTD特異的な抗体4A8（参考文献32）と4-8（参考文献13）の初期の構造解析では、NTDの最も突出した部分の上側に向けて、類似したエピトープの位置が明らかになった。低温電子顕微鏡を用いて中和抗体4A8の抗体フットプリントを調べたところ、スパイクの残基Y145,H146,K147,K150,W152,R246,W258が関与する重要な相互作用が示された（参考文献32）。41のNTD特異的mAbのエピトープビンニングにより、6つの抗原部位が同定されたが、そのうちの1つは既知のNTD特異的中和抗体すべてに認識されており、14-20,140-158,245-264残基からなる「NTDスーパーサイト」と呼ばれている（参考文献30）（図1a,,b）。NTD特異的抗体が作用する中和のメカニズムはまだ完全には解明されていないが、構造変化の阻害やDC-SIGNやL-SIGNなどの補助的な受容体との相互作用が提案されているかもしれない32,35。S2サブユニットの抗原性についてはほとんど知られておらず、免疫原性は広範な糖鎖遮蔽により阻害されていると考えられている36。また、線形および交差反応性のコンフォメーションS2エピトープが記載されている37,38が、これらの生物学的意義はまだわかっていない。
スパイクRBDの突然変異と免疫逃避
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の変異がどのように中和に影響するかについては、いくつかの研究が現在の理解に貢献している。これらの研究には、mAb39やポリクローナル抗体を含む回復期血漿40,41にさらされたウイルス集団に出現する突然変異を特定する伝統的な逃避突然変異研究、特定の突然変異を対象とした特性評価18,42,大量に流通している変異体43やRBD39,44-46のすべての可能なアミノ酸置換を対象とした広範な研究が含まれる。変異がポリクローナル抗体の認識に影響を及ぼすことが示されているスパイク残基について、mAbまたは血漿への影響が観察されたことを図1bに示している。また、より少数の残基については、mAbまたはポリクローナル血漿にさらされたウイルスに生じるエスケープ変異が記載されている（図1bの「mAb emerge」および「血漿 emerge」）。
DMSの研究では、酵母ディスプレイシステムを用いて、可能性のあるすべての単一アミノ酸変異を評価し、9種類の中和SARS-CoV-2 mAbs45や、感染後2つの時点で採取した11人の回復期血漿から逃れる変異を検出した39（図1bの緑の濃淡）。血漿中のエスケープ変異は、SARS-CoV-2が感染時に遭遇するようなポリクローナル抗体による中和に影響を与えることから、特に興味深い。ポリクローナル抗体による中和に及ぼす変異の影響は、人によって大きく異なることが知られているが、抗体結合を最も低下させる変異は、比較的少数のRBD残基で生じており、RBD内での免疫優位性を示している39。
置換が回復期血漿による認識に影響を与えたすべてのRBD残基の中で、DMSはE484が最も重要であると特定し、K、Q、Pへのアミノ酸置換が中和価を1桁以上低下させることを明らかにした39。また、E484Kは、mAb C121およびC144（参考文献40）や回復期血漿にさらされた際に生じる逃避変異としても同定されており41,ある研究では、mAbの組み合わせ（REGN10989およびREGN10934）の中和能力を測定不能なレベルまで低下させることができる唯一の変異として報告されている47。また、19種類のmAbを用いたエスケープミューテーションの研究では、E484の置換が他の残基よりも頻繁に出現し（4種類のmAbに反応)同定された4つの484変異体（E484A、E484D、E484G、E484K）のそれぞれは、その後、試験した4つの回復期血漿のそれぞれに対して耐性を付与した48。mAbで選択された他のエスケープ変異体は、4つの血清のそれぞれを免れることはできなかったが、K444E、G446V、L452R、F490Sの変異体は、試験した4つの血清のうち3つを免れた48。
スパイクタンパク質の477位の変異（S477G、S477N、S477R）は、ある研究で同定されたmAbエスケープ変異の中でも重要な位置を占めており、S477Gの変異は、試験した4つの血清のうち2つの血清に耐性を示した48。しかし、回復期血漿を用いたDMSでは、477の置換が重要であるとは確認されていない39。変異N439Kは、ACE2との親和性を高め（参考文献19)RBM-ACE2界面に塩橋が追加されることが予測され、すでに中和活性が低い血漿の中和能を優先的に低下させると考えられている18。しかし、DMSの研究39では、N439Kの変異が血漿中のポリクローナル抗体による中和を有意に変化させることは認められなかった。これは、N439KがmAbや回復期血漿による中和を低下させるとした過去の研究18とは対照的である。この矛盾を説明する1つの方法として、N439Kによってもたらされる免疫逃避のメカニズムは、抗体のエピトープ認識に直接影響を与えるのではなく、ACE2の親和性の増加によるものであり、おそらくDMS研究の実験デザインは、このタイプの免疫逃避変異を検出する感度が低いのではないかと考えられる。
スパイクNTDの突然変異と免疫逃避
NTDでは、免疫回避の証拠のほとんどが、140-156残基（N3ループ）と246-260残基（N5ループ）からなるコンフォメーションエピトープを中心とした領域に集中しており、この領域には抗体4A832のエピトープが含まれている（図1,マゼンタ）。回復期血漿にさらされたウイルス集団に抗体のエスケープ変異が生じたことを確認した研究では、変異はRBDとNTDの間にほぼ均等に分布していた（図1b）。ある研究では、2人の患者の回復期血漿にさらされたウイルスにエスケープ変異が出現したことが報告されているが、そのうちの1人はNTDの変異のみを選択していた（N148S、K150R、K150E、K150T、K150Q、S151P）40。この血漿は、非常に強力なRBDを標的とするmAb C144の供給源であるにもかかわらず、このような結果となった（参考文献40）。NTD抗体エスケープ変異は、調査した他の血漿サンプルでは観察されず、さらに148-151変異体は、試験した血漿に対する感受性がわずかに低下しただけであったことから、RBDおよびNTDエピトープの変異によって個々の免疫応答が異なる影響を受ける可能性があることが示された40。
SARS-CoV-2の進化の過程では、NTDの欠失が繰り返し観察されており、NTDの抗原性が変化すると言われている30,41,42。ある研究では、NTDの中に4つの再帰的欠失領域（RDR）を同定し、これらの中で頻繁に観察される5つの欠失を検証した。Δ69-70 (RDR1)、Δ141-144およびΔ146 (RDR2)、Δ210 (RDR3)、Δ243-244 (RDR4) 42。4つのRDRのうち、RDR1,RDR2,RDR4はNTDのループN2,N3,N5に対応し、RDR3はN4とN5の間の別のアクセス可能なループに位置する（図2a、アスタリスク）。RDR2の欠失（Δ141-144,Δ146）とΔ243-244（RDR4）は、いずれも4A8との結合を消失させた（参考文献42）。免疫逃避におけるRDR2欠失の役割を示すさらなる証拠として、強力な中和力を持つ回復期血漿と共培養したSARS-CoV-2にΔ140が出現し、中和力が4倍に減少したという研究結果がある41。このΔ140スパイク変異体は、その後、E484K変異を獲得し、中和力がさらに4倍低下した。このように、NTDとRBDにまたがる2残基の変化は、ポリクローナル抗体反応を劇的に回避することができる。次に、Δ140+E484K二重変異体は、NTDのN5ループのY248とL249の間に11残基の挿入を受け、中和反応が完全に消失した。この挿入により、RDR4の近傍に新たな糖鎖モチーフが導入され、抗原性のあるN3およびN5 NTDループの構造が変化することが予測された41。この発見は、NTDの構造的な可塑性を示すものであり、NTDへの挿入や新たな糖鎖モチーフの獲得は、欠失に加えて、免疫回避につながるさらなるメカニズムであることを示している。エピトープ-パラトープ界面に間接的に影響を与える変異の他の例としては、シグナルペプチド領域やシステイン残基15および136の変異が挙げられる。このシステイン残基はジスルフィド結合を形成し、NTDアミノ末端をガレクチン様β-サンドウィッチに対して「ステープル」する30。これらの部位の変異（例えば、C15残基とV16残基の間で起こる切断を変化させるC136YとS12P）は、いくつかのmAbの中和活性に影響を与えることが示されている。おそらく、ジスルフィド結合が破壊され、その結果、いくつかの抗体が標的とするスーパーサイトが外れてしまうのだろう30。
図2 スパイクタンパク質上のコンフォメーションエピトープの構造に基づく解析
a｜スパイクタンパク質のエクトドメインの各残基のクローズドフォームに対する構造ベースの抗体アクセス性スコアをBEpro49で計算した。プロットの上部と下部にある黒いダイヤモンドは、ACE2と接触する残基の位置を示している。アクセス可能なアミノ末端ドメイン（NTD）ループN1～N5にはラベルが付けられており、これらの間にあるループにはアスタリスクが付けられている。 b｜閉じたコンフォメーションにおけるスパイクタンパク質の抗体アクセス性スコアを、パートaのカラースキームに従って2つの表面カラーで表した。各スパイクモノマー（直立した受容体結合ドメイン（RBD）（黄)時計回りに隣接した閉じたRBD（緑)反時計回りに隣接した閉じたRBD（青））について、閉じた形で計算されたスコアとの相対的な差を示す。 d｜直立したRBDを持つ単一モノマーを持つスパイクタンパク質のオープンコンフォメーションにおける抗体アクセス性スコアを、三量体軸の垂直方向の図（左）と、この軸に沿って直交するトップダウンの図（右）の2つの表面色で表現したもの。
スパイクタンパク質全体で見ると、中和mAbからの逃避をもたらすいくつかの変異は、血清抗体結合にほとんど影響を与えない39,40,44。これは、おそらく、それらのmAbがポリクローナル血清ではまれであり、サブドミナントエピトープを標的としているためである12,39,44。療養者の血漿にさらされたウイルスに生じた逃避変異は、NTD（ΔF140,N148S、K150R、K150E、K150T、K150Q、S151P）とRBD（K444R、K444N、K444Q、V445E、E484K）の両方で確認されている40,41（図1b）。注目すべきは、回復期血漿から選択圧を受けて出現した変異は、同じ血漿から分離された最も頻度の高いmAbによって選択された変異とは異なる可能性があることである40。おそらく、回復期血漿で選択された突然変異は、複数のmAbから逃れることができるため、このような違いが生じるのではないかと思われる。S2の変異の抗原的効果に関するデータはほとんどないが、D769Hは中和抗体に対する感受性を低下させることが報告されている24。769残基は表面に露出したS2ループに位置しており、D769HはΔ69-70と結合して、回復期血漿を投与された免疫不全者に生じることが判明している24。
スパイクのコンフォメーション・エピトープ
スパイク蛋白質の潜在的な抗原性を評価するために、三次構造に基づいてコンフォーメーションエピトープを予測するプログラムであるBEproを用いて蛋白質を分析した49。この手法では，構造に基づくエピトープスコアを計算し，各アミノ酸位置の抗体アクセス性を近似的に評価する．各残基について，計算されたスコアには，局所的なタンパク質構造が考慮されている。半球体の露出度測定値と傾向スコアはそれぞれ，標的残基から8〜16Å以内にあるすべての原子に依存し，より近い原子に重み付けされる。このように集約されているため，計算されたスコアは，1つのアミノ酸置換の影響を比較的受けにくい．スコアは，スパイクタンパク質の閉じたコンフォメーションと開いたコンフォメーションの両方について計算した（図2）。フーリンによる切断後、スパイクタンパク質の約34%が閉じた状態、約27%が開いた状態（残りは中間的な形態）になると推定されている50。0と1の間でスケールを変えたスコアは、図2aの閉じたコンフォメーションでプロットされ、図2bの構造で表されている。この方法の限界は、残基の糖鎖遮蔽を考慮していないことと、カルボキシ末端に近い残基のスコアをエクトドメインの基部で過大評価してしまうことである。
抗体フートプリントの報告や、変異が抗原性に及ぼす影響との比較から、mAbや回復期血漿中の抗体による認識に影響を及ぼすとされる変異を持つ残基（図1b）は、エピトープフートプリントに属する他の残基や抗原性に関与しない残基と比較して、構造ベースの抗体アクセス性スコアが高い残基に生じる傾向があることがわかった（補足図1b）。注目すべきは、血漿中の抗体認識に影響を与えると説明されている変異を持つ残基のスコアも、mAbのみに影響を与えると説明されている変異を持つ残基と比較して、平均してわずかに高いことである。エピトープのスコアは、回復期の血漿にさらされたときに生じたとされる突然変異を持つ残基で特に高くなっている40,41（補足図1b）。ポリクローナル抗体からの選択圧を受けて突然変異が生じたという実験データは比較的少ないが、このような突然変異に関連してスコアが高くなる傾向は、この種の構造解析アプローチから得られる情報が、ポリクローナル抗体反応に影響を与える可能性のある置換基のランキングに貢献できることを示している。
RBDの中で、閉じたスパイク構造の構造ベースの抗体アクセス性スコアが高い2つの領域（図2a、スコアが0.8以上の残基が連続しているピーク）は、444-447残基と498-500残基に集中している。これらの領域は、図2bのスパイク構造の上から見た図の中央付近に、黄色のパッチで表されている。図2cは、一般的に、スパイクタンパク質がオープンコンフォメーションにあるとき、残基がよりアクセスしやすくなり、エピトープを形成しやすくなることを示しており、これはRBD、特に直立したRBDに特に当てはまる（図2c、黄色）。開放型では、ACE2結合部位に近い残基（405,415,416,417,468）が、直立型RBDと時計回りに隣接する閉鎖型RBDの両方で、はるかに多く露出するようになる（図2c、緑）。これらの位置の変異の影響は、RBDクラス1に属する抗体でより大きくなると考えられる。444-447と498-500を中心とする残基は、直立したRBDで高いスコアを維持しており、413-417と458-465の領域の残基も加わっている。開放型スパイク構造でアクセス性が著しく低下したRBDの残基は、直立型RBDに時計回りに隣接する閉鎖型RBDの476,477,478,586,487の残基のみであり、これらは直立型RBDによってブロックされてしまう（図2c、緑色）。いくつかのRBD特異的な抗体は、開いたスパイクタンパク質（RBDクラス1および4（参考文献31））のみに結合することができるが、興味深いことに、D614Gは、開いたコンフォメーションが起こる傾向を強めることで、スパイクタンパク質を中和抗体に対してより脆弱にすることが観察されている51。
NTDの中で、閉じた状態のスパイクの残基の中で最もスコアが高いのは、147-150番の残基を中心とするループであり、これらの残基のスコアはそれぞれ0.9以上である（図2a、図2bの構造を横から見たときの右端にある黄色のパッチ）。このループはN3ループと呼ばれ、中和抗体4A8と重要な相互作用を形成しているとされる（参考文献32）。ある研究では、これまでモデル化されていなかった5つの突出したNTDループの構造を、N1～N5と表記している。N3に加えて、22-26位（N1)70位（N2)173-187位（N4)207-213位（図2a、アスタリスク)247-253位（N5）に高スコア（0.7以上）の残基が見られる。構造解析の結果、NTDに結合する抗体は、スパイクタンパク質がクローズドコンフォメーションまたはオープンコンフォメーションのいずれかにあるときに、エピトープに結合できる可能性が高いことがわかった（図2c）。NTDとRBDの外側で最も高いスコアを示したのは、676番と689番（S1-S2 furin cleavage siteを含むループの両側に位置し、open conformationとclosed conformationの両方で無秩序である50)793-794番、808-812番、1,099-1,100番、1,139-1,146番である（図2a）。スパイクタンパク質が開いた状態では、850-854を中心とするS2残基のアクセス性が大幅に向上し、3つのスパイクモノマーすべてでアクセス性が向上した（図2c）。また、978-984残基は、直立したRBDモノマーに反時計回りに隣接するモノマーでアクセス性が向上した（図2c、青）。
スパイクの突然変異の構造的背景
世界のSARS-CoV-2集団におけるスパイク変異の影響とその免疫学的役割を評価するために、構造解析と、流通している変異体で観測された変異の頻度を組み合わせた（図3）。世界的に見て、Wuhan-Hu-1参照配列（MN908947）に対してマッピングされたアミノ酸変異の数が最も多いのは、アミノ酸位置614,222,18に記録されている（図4a）（2021年2月3日にGISAIDデータベースから検索され、CoV-GLUEを用いて処理された426,623個の高品質配列の中で）。614位と222位の残基は、抗体アクセススコアが比較的低く、スパイクタンパク質がオープンコンフォメーションにあるときにRBS残基から約50Å離れた位置にある（図3a,,b）.b）。前述のように、D614Gは感染性に中程度の利点を与え8,9,伝達性を高めることを示す証拠がある10。2番目に頻度の高いスパイク状のアミノ酸置換はA222Vであり、20A.EU1 SARS-CoV-2クラスター（B.1.177系統とも呼ばれる）に存在する。この系統はヨーロッパで広く普及しており、スペインが起源であると報告されている52。A222Vがウイルスの表現型（感染性や伝達性）に顕著な影響を与えているという証拠はないため、その頻度の増加は選択的優位性ではなく、偶然の産物であると一般的に推測されている。L18Fの置換は、全世界の集団で約21回発生しており53,複数のNTD結合mAbからの逃避と関連している30。
図3 世界のウイルス集団におけるスパイクのアミノ酸変異の構造的背景
スパイクのアミノ酸残基は、アミノ酸の置換や欠失の頻度に応じて色分けされている。変異体（CoV-GLUEから検索）は、2021年2月3日にGlobal Initiative on Sharing All Influenza Data（GISAID）データベースからした426,623件の高品質な配列に基づいている。 a｜各スパイクアミノ酸残基を表すポイントは、抗体アクセス性スコアと受容体結合部位の最も近い残基までの距離に応じて配置されている。b｜すべての残基が表示された頻度スケールに従って色付けされたクローズドフォームのスパイクタンパク質、三量体軸の垂直方向の図（左）と、この軸に沿った直交するトップダウンの図（右）を示す。c｜ACE2（RCSBプロテインデータバンクID 6M0J95）に結合した受容体結合ドメイン（RBD）の拡大図。RBDの残基はアミノ酸変異体の頻度で色分けした球で示し、ACE2は金色で示した。アミノ酸変異体は、RBDとACE2の界面の位置に高い頻度で存在している。 d｜少なくとも100個の配列が置換を持つ残基をハイライトしたオープンフォームのスパイクタンパク質。三量体軸の垂直方向の図（左）と、この軸に沿った直交するトップダウンの図（右）を示す。
スパイクタンパク質に観察された5,106個の独立した置換（Box 1）のうち、血清中のmAbまたはポリクローナル抗体による認識に影響を与えるとされるものは161個あり、そのうち22個は100個以上の配列に存在している。平均して、抗体認識に影響を与える変異が記載されているアミノ酸位置では、抗原的に重要な置換が記載されていない位置よりも変異頻度が高く（補足図1a)439位や484位など、回復期血漿中の抗体による認識に影響を与える変異が記載されているいくつかのアミノ酸位置では、高いレベルのアミノ酸置換が観察されている。このことから、一般に、試験管内試験で抗体エスケープ変異が検出されたアミノ酸位置は、生体内試験では少なくともある程度の変異に耐えられることがわかる。
RBDの中で、最も高い頻度でアミノ酸置換が存在する位置は、RBDとACE2の界面に近いところにある（図3）。数千の配列に存在する3つのRBDのアミノ酸置換のうち、N439KとN501Yについては前述の通りであるが、N501Yについては次節で懸念される変異体との関連で詳しく述べる。もう1つの置換基であるS477Nは、世界のSARS-CoV-2集団で少なくとも7回出現したと推定され 2020年6月中旬以降、世界全体で配列の4%から7%の頻度で持続している（参考文献53）。ある研究では、S477Nの出現を選択した複数のmAbを記載し、この変異体は、テストしたRBD標的mAbの全パネルによって中和されないことを発見した。対照的に、回復期の血清で試験した場合、S477N変異体の中和は野生型と同様であった48。N439KおよびN501Yと同様に、S477NはACE2受容体への親和性を増加させるが、その程度は低い19,54。Box 2で述べたように、置換は、エピトープの抗体認識に与える影響とは無関係に、受容体結合親和性を高めることで、免疫逃避を促進する可能性がある。また、RBD-ACE2インターフェースの417,453,446番のアミノ酸位置でも変異頻度が中程度に高い。これらの位置のうち、446はスパイク構造の中で抗原性が高いと予測される位置にあり、この部位の置換は、mAbおよびポリクローナル血清中に存在する抗体の両方による中和に影響を与えるとされている39,43,46,48。417番と453番のアミノ酸位置の置換については、で懸念されている変異体との関連で説明する。
Box 2 抗原の変化のメカニズム
インフルエンザウイルスのヘマグルチニンやHIVのエンベロープ糖タンパク質GP120など、宿主細胞表面の受容体に付着する他のウイルス表面糖タンパク質と同様に、重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイク糖タンパク質は、中和抗体の重要な標的となっている。突然変異によって糖タンパク質の抗原性が変化するメカニズムには様々なものがある。
エピトープを変化させるアミノ酸の置換
エピトープ残基の生物物理学的特性が変化すると、抗体の結合力が直接低下する。例えば、中和抗体4A8はスパイクタンパク質の残基K147およびK150と塩橋を形成するため、これらの残基を置換すると結合が阻害されると考えられる。E484Kのアミノ酸置換は、モノクローナル抗体や回復期血漿の中和活性に影響を与えることで注目されている。この位置は、いくつかの抗体のフットプリントに属するとされており、グルタミン酸残基をリジン残基に置換することによる電荷の変化は、抗体の結合を弱める可能性がある。
受容体結合性の向上
受容体結合親和性を個別に高める置換は、糖タンパク質と中和抗体との間の結合平衡を、糖タンパク質と細胞受容体との間のより高活性な相互作用の人にシフトさせることができる102。ACE2の結合親和性を高めるスパイク状のアミノ酸置換N501Yは19,回復期血漿を投与された人に出現することが報告されており、これが免疫逃避の手段となる可能性がある。
グリコシレーションの変化
糖鎖は、抗体の結合からエピトープを保護する可能性のある嵩高い糖分子である。ウイルス表面糖タンパク質エピトープの糖鎖遮蔽には、典型的にはN-結合型糖鎖が重要であるが33,O-結合型糖鎖も寄与することがある103。置換によりN-結合型の糖鎖モチーフが追加されることもある。ヒトインフルエンザウイルスの進化の過程で、エピトープをマスクする糖鎖が獲得されたことはよく知られている104。
欠失と挿入
残基の欠失や挿入は、エピトープの構造を変化させ、抗体の結合力を低下させる可能性がある。中和抗体による認識に影響を及ぼすスパイクのアミノ末端ドメイン（NTD）の欠失がいくつか報告されている41,42。実験では、回復期血漿中のポリクローナル抗体から逃れるために、スパイクのNTDに複数のリガンドが挿入されていることが報告されている41。
アロステリック構造効果
欠失や挿入と同様に、エピトープのフットプリント外のアミノ酸置換は、エピトープが変化したり、表示が異なったりするようにタンパク質のコンフォメーションを変化させることで、抗体結合に影響を与える可能性がある。スパイクのNTDでは、ジスルフィド結合の変化が、このメカニズムによって複数のモノクローナル抗体による結合を低下させると考えられている30。
注目・懸念される変異体
注目すべき単一の変異に加えて、より大きな変異を持つSARS-CoV-2の系統も登場している。いくつかのスパイク変異の存在によって定義され、B.1.1.298（クラスター5）と呼ばれる、おそらく最初の注目すべき変種は、デンマークで検出され、飼育されているミンクと少数の人々の間で広まった20。この系統の特徴は、ΔH69-V70,Y453F、I692V、M1229Iの4つのアミノ酸の違いである（図5）。このうち、Y453Fの置換はACE2のフットプリント内の残基に生じており、DMSによりACE2との親和性が高まることが示されている19。また、Y453FはmAbによる中和を抑制することが報告されている47。2020年後半から 2021年前半にかけて、ウイルスの特性に影響を与える変異を持つ系統の出現と持続的な感染が注目を集めたが、中でもB.1.1.7,B.1.351,P.1（それぞれ501Y.V1,501Y.V2,501Y.V3としても知られている）の系統が注目された。B.1.1.298,B.1.1.7,B.1.351,P.1の各系統におけるスパイク変異の位置を図5aに示し、抗体認識とACE2結合に関する構造的な文脈と変異の結果に関する情報を図5bに示した。
図5 懸念される変異体を特徴づけるアミノ酸変異
a｜オープンコンフォメーションのスパイクヘテロ三量体と表面表現を重ね合わせたもの（RCSB Protein Data Bank ID 6ZGG50）。懸念される変異体を特徴づけるアミノ酸の置換と欠失の位置は、赤い球で強調されている。B.1.1.7については、構造モデルには存在しないフーリン切断部位内の置換P681Hのおおよその位置をハサミで示している。 b｜必要に応じてアミノ酸残基または特定のアミノ酸置換の特性を示す整列したヒートマップ。エピトープの残基は、アミノ末端ドメイン（NTD）または受容体結合ドメイン（RBD）のクラスを示すように色付けされている30。スパイクタンパク質の閉じた状態と開いた状態での構造ベースの抗体アクセススコアを示す。RBD 残基については，ディープミューテーションスキャン（DMS）研究の結果，各変異体のエスケープフラクション（つまり，変異がポリクローナル抗体結合を減少させる程度の定量的な尺度）を，血漿全体で平均したもの（「血漿平均」）と，最も感度の高い血漿（「血漿最大」）で示している39．各変異は、回復期血漿39またはワクチン接種者59のモノクローナル抗体（mAbs）または抗体による中和に影響を与える変異の証拠があるもの、mAbs40,47,48または感染後の血清を用いた選択実験で出現したものに分類される。受容体結合部位RBSを形成するACE2と接触する残基までの距離を示している（残基681については、公表されている構造の中で最も近い残基を用いて推定している）。ACE2結合親和性19に関するDMSデータは、スコアを集計し、各残基の変異体と、代わりに最大結合力を持つ変異体の平均値を示している。スコアは、野生型基準アミノ酸に対する結合定数（Δlog10 KD）を表す。変異体に存在するが、その変異体が出現したウイルス集団でも広く見られる変異や、系統内で高い多様性を示す変異には、短剣のマークが付けられている。
図5にまとめた系統のうち、いくつかのアミノ酸置換は収束的であり、異なる系統で独立して生じたものである。B.1.1.7系統、B.1.351系統、P.1系統に存在するN501Y、B.1.351系統とP.1系統に存在し、B.1.1.7系統で出現が確認されているE484K55,B.1.1.298系統とB.1.1.7系統に存在するΔH69-V70である。また、B.1.351系統とP.1系統には、それぞれK417NとK417Tという代替アミノ酸置換体が存在する。さらに、これらの変異を持つ系統も確認されており、例えば、ウェールズに多く分布するB.1.1.70系統では、N501Yが独立して出現していることが分かっている。N501Yは、RBDとACE2の接点に位置しており（図2c)単一のRBDの変異でACE2との親和性が最も高くなることが実験的に示されている19。E484は、免疫優勢なスパイクタンパク質の残基として同定されており、E484Kを含む様々な置換は、いくつかのmAb40,47,48や、回復期血漿39-41,48の抗体から逃れることを容易にしている。E484Kは、世界のSARS-CoV-2集団で繰り返し出現していると推定され53,ブラジルのリオデジャネイロ州（系統P.2）56とフィリピン（系統P.3）57で広まっていると報告されている系統P.1に加え、系統B.1.1.28に由来する他の2つの系統でも報告されている。K417は、RBDのクラス1およびクラス2抗体のエピトープに記述されているが31,K417の変化はクラス1抗体の結合に影響を与える傾向があり、したがって、E484K44,58,59のような置換の影響を受けやすいクラス2抗体の反応が主流であるRBDに対するポリクローナル抗体反応にとっては、やや重要性が低い。抗原性の影響に加えて、K417NとK417TはともにACE2結合親和性を適度に低下させることが予想される19（図5b）。ΔH69-V70欠失は、回復期血漿を投与された免疫不全者の免疫逃避に関連する変異体として同定されている24。実験では、ΔH69-V70は回復期血漿のパネルによる中和を低下させないことが示されているが、免疫を介した選択により出現する可能性のある親和性を高めるRBM変異に伴う感染力の低下を補うことができるかもしれない22。
B.1.1.7系統に属する最初のゲノムは 2020年9月にイングランド南部でシーケンスされた。B.1.1.7系統は、系統樹の1つの枝にマッピングされる23個のヌクレオチド変異がゲノム全体に存在することで定義される3。この23個の変異のうち、14個はアミノ酸の変化を、3個は欠失をコードしており、スパイクタンパクの6つのアミノ酸置換（N501Y、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H）と2つのNTD欠失（ΔH69-V70,ΔY144）が含まれる3。この系統は、報告されたSARS-CoV-2症例の割合が急速に増加しており、系統分析によると、この系統は、他の系統に比べて40～70%高いと推定される増殖率を示している60,61。また、この系統は、より高いウイルス負荷と関連している可能性があるという証拠もある62。N501Yは、ごく一部のRBD抗体による中和を減少させるといういくつかの証拠があるが63,それに加えて、ΔY144の抗原的効果を示す証拠もある（図5b）。この欠失は、N3のNTDループ（アミノ酸位置140-156）のコンフォメーションを変化させることが予想され、様々な中和抗体による中和を消失させることが実証されている30。B.1.1.7のスパイク変異は、RBD特異的中和抗体（31個中5個、16%）よりも、NTD特異的中和抗体（10個中9個、90%）の中和を低下させる割合が高いことが示されている63。RBDの免疫優位性を考慮すると、このことは、本物のB.1.1.7やB.1.1.7スパイク変異を持つ偽ウイルスに対する回復期血漿の中和活性がわずかに低下することを説明できる64,65。ΔY144とE484Kの共存は、ポリクローナル抗体反応に関連しており、ΔY144が変化しているN3ループはスパイクタンパク質の中で最も免疫原性の高い領域と予測され（図2a)484位のアミノ酸置換は様々なRBD標的抗体による中和を低下させる。
英国でN501Yを持つ系統が流通しているという報告に続いて、南アフリカでN501Yを持つ別の系統（系統B.1.351）が流通しているという報告があり 2020年12月以降、急速に頻度が拡大している（参考文献66）。系統B.1.351は、N501Yに加えて、さらに5つのスパイクアミノ酸置換（D80A、D215G、K417N、E484K、A701V）とNTDの欠失（Δ242-244）が存在することで定義される。また、B.1.351ウイルスでは、スパイク状のアミノ酸置換（L18F、R246I、D614G）が多く見られる。同様のNTD欠失であるΔ243-244は、抗体4A8による結合を消失させており（参考文献42)L18FとR246IもNTDスーパーサイト内に存在し、抗体結合に影響を与えていると考えられる30。K417N、E484KおよびこれらのNTD置換が共存していることから、B.1.351系統は、クラス1およびクラス2のRBD特異的抗体やNTD特異的抗体による中和を抑えることで、ポリクローナル抗体反応を克服していると考えられる（図5b）。ある研究では、検査した回復期血漿サンプルの約半数（44例中21例、48%）がB.1.351変異体に対して検出可能な中和活性を持たなかったというデータが報告されている58。また、シュードタイプのウイルスを用いた実験では、B.1.351変異体は一部のmAbの中和活性に対しても耐性があることが示された（17例中12例、70%）67。同様に、14人から採取した回復期血漿の中和効果が、生きた（本物の）B.1.351ウイルスに対して強く低下することが示された研究もある（IC50は初発のウイルスに対して3.2倍から41.9倍に低下）68。
B.1.1.28のサブ系統であるP.1系統は、ブラジルで初めて検出され69,ブラジルから日本への旅行者からも検出された70。P.1系統の特徴は、スパイクタンパクにいくつかのアミノ酸置換が存在することである。P.1系統の特徴は、スパイクタンパク質にL18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I69という複数のアミノ酸置換があることである。P.1系統では、上述の417,484,501位の置換に加えて、一部の抗体による中和を低下させることが知られているL18Fなど、記載されているNTDの抗原領域の近くに置換が集中している30。また、T20NとP26Sという置換は、NTDのスーパーサイト30の近くで、抗体アクセススコアが高い残基に存在し（図5b)T20Nはスーパーサイトの一部に糖鎖遮蔽（Box 2）をもたらす可能性のある糖鎖付加部位を導入している。P.1系統は、ブラジルのマナウスにおける再感染事例とも関連しており27,本来ならば有効な免疫反応を抗原的に回避している可能性がある。ゲノムデータと死亡率データを統合した解析によると、P.1の感染力は1.7～2.4倍で、P.1ではないSARS-CoV-2に過去に感染した場合、P.1以外の系統と比較してP.1感染に対する防御力は54～79%になると推定されている71。P1系統の頻度や地理的分布の詳細については、Pango lineagesのウェブサイトを参照してほしい72。
最近では、B.1.1.7,B.1.351,P.1に共通する変異が独立して発生している系統が検出されるようになり、収束的な進化を示している。例えば、現在のところ頻度は低いものの、いくつかの国で観察されているB.1.525系統のウイルスは、B.1.1.7系統のウイルスと共通のNTD欠失ΔH69-V70およびΔY144,B.1.351およびP.1系統と共通のE484K、スパイク状のアミノ酸置換Q52R、Q677HおよびF888L73を有している。677位のアミノ酸置換が繰り返されていることと、米国のいくつかの系統でQ677Hが独立して出現していることから、適応の強い証拠となる。この変異が近位の多塩基性フーリン切断部位に影響を与えている可能性があるが、その影響を明らかにするにはさらなる実験が必要である74。他にも、米国のカリフォルニア州とニューヨーク州で新しい変異が広がっていることが確認された（それぞれB.1.427,B.1.429,B.1.526）。B.1.427とB.1.429の変異体には、抗原的に注目すべきL452R75という置換があり、いくつかのmAbs43,45,48,59や回復期血漿43による中和を阻害することが示されている。L452Rは 2020年12月から 2021年2月の間に、世界中のいくつかの系統で独立して出現したことから、このアミノ酸置換は、おそらく集団における免疫力の向上によるウイルスの適応の結果であると考えられる75。また、L452Rは、マヨット島で確認された症例群に関連するA.27系統にも存在している76。B.1.526系統には、系統を決定する変異77,78のうち、S477NまたはE484Kが認められており、これらはいずれも上述の抗原的に重要な変異である。最近、アンゴラでは、タンザニアからの渡航者を含む症例から、E484Kを持つ新たな変異体（A.VOI.V2）が確認された79。この変異体では、スパイクタンパクにいくつかのアミノ酸置換があり、NTDに3つの欠失があり、そのうちのいくつかは抗原性スーパーサイト内にある79。また、ウガンダでパンデミックしているA系統の別の変異体（A.23.1）は、B.1.1.7系統と共通して、フーリン切断部位の681位に置換があり（A系統ではP681R、B.1.1.7系統ではP681H)さらに、R102I、F157L、V367F、Q613Hというアミノ酸置換がある。Q613Hは、D614G80に隣接する位置に存在するため、重要であると推測される。アミノ酸157位はエピトープ残基として同定されており、F157AはmAb2489による中和を阻害する(ref.34)。
新たな変異体は今後も出現し続けるであろう。感染性、伝達性、病原性、抗原性の観点から、出現した変異体の表現型を理解することは重要であるが、変異体に存在する特定の変異の表現型への影響を、単独で、あるいは他の変異との組み合わせで定量化することも重要である。予期しない変異の組み合わせを持つ新しい亜種が続々と出現しているので、このような洞察は、ウイルスの表現型の予測を可能にする。例えば、最近検出されたB.1.617.1系統のウイルスは、抗体認識に影響を与えるとされるL452RとE484Qという置換基の存在により、抗原性が変化していることが予想された39,43,45,48,81。今後も、SARS-CoV-2のスパイク変異を実験的に解析することで、流通しているウイルスではまだ見られない個々の変異や変異の組み合わせについて、非常に有益な情報を得ることができるだろう。
新しい亜種に対するワクチンの有効性
現在までに、いくつかの国でワクチンが認可され、非常に順調に展開されているが、ワクチンを接種した人の数は世界人口のごく一部に過ぎない（補足表1）。変異がワクチンの効果に与える影響を評価するために、特定のスパイク変異を持つ本物のウイルスやシュードウイルス（単独または組み合わせ)懸念される変異やその他の流通しているスパイク変異を表すより大きな変異のセットを、ワクチン接種後の血清を用いた中和アッセイで評価した（補足表1）。通常、この研究では、野生型ウイルスに対する変異型ウイルスまたはシュードウイルスの中和の倍数変化（変異型で50%中和（IC50）が達成される血清濃度を野生型ウイルスの平均IC50で割った値）が報告されている。
mRNAワクチンmRNA-1273（Moderna）またはBNT162b2（Pfizer-BioNTech）で免疫した20人のボランティアのコホートから得られたワクチン接種後の血清は、血漿中和活性を有する抗SARS-CoV-2スパイクIgMおよびIgGの高い結合価を示し、自然感染時と同等のRBD特異的抗体の相対数を示した59。さらに、ワクチン接種後の血清から分離されたmAbのエピトープマッピングでは、自然感染者から分離されたものと同様の範囲のRBDエピトープを標的としていることが示された59。また、血漿中和活性とRBD特異的メモリーB細胞の数は、自然のSARS-CoV-2感染から回復した人の血漿と同等であることがわかった59。懸念される変異体が持つRBD変異を持つ疑似ウイルスを用いた研究では、ワクチン接種を受けた人の血漿の中和活性は、E484K、N501Y、またはK417N+E484K+N501Yの3重変異体に対して、わずかではあるが1倍から3倍の有意な減少を示した59。また、BNT162b2ワクチンの試験に参加した20人の血清を用いた他の研究では、N501およびY501変異を持つシュードウイルスと同等の中和力が示された82。また、N501Y、ΔH69-V70 + N501Y + D614G、E484K + N501Y + D614Gの組換えウイルスを用いた他の研究では、Wuhan-Hu-1基準ウイルスと比較して、E484K + N501Y + D614Gのみが中和力を示した。E484K + N501Y + D614Gのみが、2回のBNT162b2投与によって誘発されたワクチン接種後の血清による中和の減少が小さく、Wuhan-Hu-1基準ウイルスと比較して中和にわずかな差しか見られなかった83。
先に述べたように、pre-B.1.1.7ウイルス（B.1.1.7系統が出現する前に流通していたウイルス）に感染した人の回復期血漿では、B.1.1.7またはB.1.1.7スパイク変異を有するシュードウイルスに対する中和活性がわずかに低下するだけであり63,78,ワクチン接種後の血清で得られた結果は、これとほぼ一致している。BNT162b2ワクチン（2回接種）63,78,84またはmRNA-1273ワクチン（2回接種）63を接種した人の接種後の血清で評価したB.1.1.7スパイク変異を持つシュードウイルスは、中和価の減少がわずか（3倍未満）であった。しかし、B.1.1.7スパイク変異を持つシュードウイルスにE484Kを加えたものを使用したアッセイでは、BNT162b2ワクチンを接種した人から分離したワクチン接種後の血清による中和力の低下がより大きく（6.7倍)顕著であった85。ライブウイルス中和アッセイでは、ChAdOx1 nCoV-19（Oxford-AstraZeneca）のワクチン接種後の血清の中和価は、B.1.1.7系統に対する中和価の9倍であり、標準的な非B.1.1.7系統（S247Rスパイク変異を持つWuhan-Hu-1）に対する中和価の9倍であった86。同様に、B.1.1.7ウイルスに対する不活化ワクチンCovaxin（Bharat Biotech社）によって誘発された血清の中和活性はほぼ維持されていた87。疑似ウイルスおよび生ウイルス中和アッセイでは、B.1.351変異体に対するChaAdOx1ワクチンを2回接種した後の個人の血清の中和活性が低下または消失していた86。mRNA-1273を2回（28日間隔）接種した個体の接種後の血清では、B.1.351変異体に対する中和活性が低下していた（6.4倍の低下）88。一方、不活化ワクチンBBIBP-CorV（シノファーム社）を接種した血清のB.1.351真正ウイルスに対する中和活性は、わずかな減少（2倍未満）しか見られなかった89。
ワクチン接種後の血清による中和に影響を与える変異体の程度の違いを比較するには、さまざまな研究で使用されている方法が異なるため複雑である。しかし、ある研究では、B.1.1.298,B.1.1.7,P.1,および3つのB.1.351を含む、関心のある8つのSARS-CoV-2変異体をテストした。同じシステムで偽ウイルスを作成し，BNT162b2ワクチン（n=30）またはmRNA-1273ワクチン（n=35）90を2回接種した人の接種後の血清で検査した。野生型と比較して，D614GまたはB.1.1.7系統，B.1.1.298系統，B.1.429系統の変異を有する疑似ウイルスは，それぞれ中和率が統計学的に有意に低下した90。系統P.1およびP.2はそれぞれ有意な減少を示し、BNT162b2（それぞれ6.7倍、5.8倍）およびmRNA-1273（それぞれ4.5倍、2.9倍）がワクチン接種後の血清90に認められた。調査した3つのB.1.351変異体は、登録されているB.1.351配列の大部分を占めており、中和活性の低下はより大きく、34倍から42倍（BNT162b2)19.2倍から 27.7倍（mRNA-1273）に及んだ。これらのデータを総合すると、P.1,P.2,B.1.351の3つの変異体を他のシュードウイルスと区別する中和活性の低下は、E484Kが主な要因であることがわかる。E484Kに加えて、3つのB.1.351変異体に共通するが、P.1とP.2には存在しない変異として、D80A、Δ242-244,K417N（P.1にはK417Tが存在する)A701Vがある。
中和試験で得られた実験データを補完するために、ワクチンの有効性に対する変異体の影響について、臨床試験から得られた新たな証拠がある。初期の段階では、実験結果とほぼ一致しており、B.1.351変異体ではワクチンエスケープの兆候が見られることが示唆されている。ChAdOx1 nCoV-19ワクチンは、B.1.1.7変異体に対しては臨床効果を示したが、B.1.351変異体による軽度から中等度の疾患に対する防御効果は得られず、同変異体に対するワクチン効果は10.4%（95%信頼区間-76.8～54.8）と推定されている85,86,91。臨床試験の予備データによると、NVX-CoV2373（Novavax社）のタンパク質ベースのワクチンは、野生型ウイルスに対して95.6%の有効性を示し、B.1.1.7変異体に対しては中程度に低く（85.6%)B.1.351変異体に対してはさらに低く（60.0%）なることが報告されている91。同様に、単回接種ワクチンのJNJ-78436735（ジョンソン・エンド・ジョンソン／ヤンセン）は、米国では中等度から重度のSARS-CoV-2感染に対して72%の予防効果があることが示されているが、南アフリカでは57%と大幅に減少している（B.1.351変異体が広まっていた時期）92。これらのデータは、NVX-CoV2373およびJNJ-78436735が、B.1.1.7変異体および米国でパンデミックしている変異体に対して臨床的に有効であることを示しており、B.1.351変異体ではワクチン効果の低下が大きくなるという点で一致している。
SARS-CoV-2の変異体や突然変異に対するワクチン効果の評価に加えて、治療薬として使用されているいくつかのmAbに対する突然変異の影響についても述べられている（補足表2）。単一のmAb治療は、標的抗原の突然変異による逃亡の可能性を潜在的に高める選択圧を及ぼす可能性がある。このリスクは、重複しないエピトープを標的とした2種類以上のmAbのカクテルを使用することで軽減されると考えられる。REGN-COV2（Regeneron社）（英国のRECOVERY試験に組み入れられている）とAZD7742（AstraZeneca社）は、開発されたmAbカクテルの2つの例である93。重要なのは、RBMにおけるいくつかの変異は、英国で流通している変異体ですでに確認されており（例えば、N439K、T478I、V483Iなど)抗原性に影響を与える可能性が高いことである。
結論
SARS-CoV-2スパイクタンパク質の抗原性の変化と、抗体中和に影響を与えるアミノ酸の変化についての明確な証拠が得られた。中和抗体に影響を与えるスパイクのアミノ酸置換や欠失は、世界のウイルス集団にかなりの頻度で存在しており、ワクチンによって誘発される抗体介在性免疫に対して抵抗性を示す変異体の証拠も出てきている。中和の変化を報告した研究結果の背景を説明するためには、免疫防御の相関関係をより深く理解する必要がある。抗原性に対するスパイク変異の影響を包括的に理解するには、T細胞を介した免疫と抗体によって認識される非スパイクエピトープの両方を網羅する必要がある。ワクチンの有効性をモニタリングし、抗原変異がワクチンの有効性に与える影響をより深く理解するためには、ワクチンの状態に関する情報と、SARS-CoV-2に感染した人のウイルスゲノム配列データを収集することが重要になるであろう。より一般的には、SARS-CoV-2ゲノム全体の変異の表現型への影響と、変異の適合性への影響をより広く理解することが、伝播と進化の成功の要因を解明するのに役立つだろう。
最近の研究では、免疫不全者のSARS-CoV-2の進化に対して、回復期血漿やmAb治療が及ぼす潜在的な選択圧が示されている24-26。このような状況では、長期的なウイルス排出者が関与しているため、（例えば、B.1.1.7系統やB.1.351系統に見られるような）より強い変異を持つ亜種が散発的に出現したのかもしれない。治療薬（ワクチンや抗体ベースの治療薬）が主にSARS-CoV-2のスパイクタンパクを標的としていることを考えると、慢性感染24-26で生じた免疫逃避変異を持つ新しい亜種の出現を促す選択圧は、より広い集団の中で再感染を可能にする変異を選択するものと類似しているだろう27-29。したがって、長期の感染に伴うウイルスの塩基配列を調べることで、感染力の増強やワクチンによる免疫からの逃避に寄与する可能性のある変異について、有益な情報を得ることができる。
ワクチンや回復期血漿の効果に対する突然変異の影響に関するデータをまとめると、ポリクローナル抗体反応は少数の免疫優勢領域に集中しており、将来的に突然変異によって宿主の免疫から逃れる可能性が高いことを示している。抗原的に異なる亜種が続々と出現しているため、ワクチン接種を受けた人や、配列が既知の循環型亜種に感染した人から、定期的に血清サンプルを採取することが必要になるであろう。循環しているウイルスのパネルを中和する血清の能力を測定することで、循環系統間の交差反応性免疫を評価することができる。SARS-CoV-2の抗原性を系統的にモニタリングするには、WHOが調整する世界インフルエンザモニタリング・対応システム（GISRS）のようなネットワークを構築する必要がある。GISRSは、ヒトインフルエンザウイルスの抗原性の進化を追跡し、ワクチン組成に関する勧告を行う世界的な共同研究機関である。インフルエンザウイルスの場合と同様に、突然変異の表現型への影響を理解した上で、新たに出現する変異体の進化の軌跡を予測するモデリング手法は、このプロセスを支援することになる94。
SARS-CoV-2のようなウイルスがどのような突然変異経路で進化するかを予測することは非常に困難である。とはいえ、SARS-CoV-2のスパイク変異が抗原性やウイルス生物学の他の側面に及ぼす影響については、急速に知識ベースが拡大している。これらのデータと新たなSARS-CoV-2の配列を統合することで、懸念される潜在的な変異体を低頻度で（つまり、広く拡散する前に）自動検出できるようになる可能性がある。抗原的に重要な亜種である可能性があるとされたウイルスの出現を追跡することは、目標とする管理方法の実施や、実験室でのさらなる特性評価の指針となる。このプロセスで重要なのは、出現した抗原性亜種に合わせた最新のワクチンを準備することである。これらのプロセスはすべて、緊密な国際協力と、迅速かつオープンなデータの共有によってもたらされる。
謝辞
Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID)を通じてゲノムデータをオープンに共有してくださった研究者の皆さんに感謝いたする。COVID-19ゲノミクスUK（COG-UK）コンソーシアムは，UK Research and Innovationの一部であるUK Medical Research Council（MRC），UK National Institute of Health Research，およびWellcome Sanger Instituteとして運営されているGenome Research Limitedからの資金援助を受けている．W.T.H.は，MRC（MR/R024758/1）から資金提供を受けている。R.R.は英国生物工学・生物科学研究評議会（BB/R012679/1）から資金提供を受けている。D.L.R.とE.C.T.は、MRC（MC_UU_12014/12）から資金提供を受けており、UK Research and Innovationから資金提供を受けたG2P-UK National Virology Consortium（MR/W005611/1）の支援に謝意を表する。また，D.LR.は，ウエルカム財団（220977/Z/20/Z）の支援に謝意を表する。A.R.は、ウエルカム財団（Collaborators Award 206298/Z/17/Z – ARTIC network）および欧州研究評議会（grant agreement no.725422 – ReservoirDOCS）の支援を受けている。
用語集
Variants ウイルスの文脈では、他のウイルスとは異なる変異を持つ遺伝的に異なるウイルス。変異体」は、クラスターや系統の創始ウイルスを指すこともあり、その系統を形成する結果としての変異体を総称するために用いられる。生物学的特性や抗原性が変化した変異体は、公衆衛生機関では「関心のある変異体」、「調査中の変異体」、「懸念のある変異体」と呼ばれている。
変異 ウイルスのRNAゲノムにおける1つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失のこと。タンパク質をコードする配列の非同義ヌクレオチド置換は、アミノ酸の変化をもたらす（置換または置き換えと呼ばれる）が、同義ヌクレオチド置換はアミノ酸を変化させない。
系統 重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の世界的な系統樹に基づいて割り当てられたウイルスの単系統のクラスター。
dN/dS比 非同義サイトあたりの非同義変異（dN）と同義サイトあたりの同義変異（dS）の比で、遺伝子や特定のコドンに作用する中立変異、浄化選択、正選択のバランスを推定するのに用いられる。
アミノ酸置換 タンパク質の特定のアミノ酸が変化すること。これは非同義的な変異によって生じる。慣例的に、アミノ酸置換はN501Yという形で書かれ、アミノ酸配列の501番目の部位の野生型アミノ酸（N（アスパラギン））と置換されたアミノ酸（Y（チロシン））を表す。
モノクローナル抗体（mAb）。固有の白血球をクローン化して作られた抗体で、通常は特定のエピトープに対して一価の結合親和性を持つ。ウイルス粒子にmAbsを飽和させ、その構造を解明して抗体のフットプリントを決定したり、mAbsを用いて認識を逃れる変異を選択したりすることができる。
エピトープマッピング 抗体の結合部位（エピトープ）を実験的に決定する。抗原抗体複合体のX線共結晶法や低温電子顕微鏡法、部位特異的変異導入法による系統的な変異のマッピングなどの手法がある。
糖鎖遮蔽 ウイルスが基質となるタンパク質を遮蔽し、抗体の結合を阻害するプロセス。これは、ウイルスタンパク質のアミノ酸側鎖に共有結合している嵩高い糖分子である糖鎖によって行われる。
免疫優位性 ウイルス粒子に対する宿主の免疫反応が、少数の抗原に集中し、強力な中和抗体によって媒介される現象。
抗体の足跡 3次元的に折り畳まれたタンパク質のアミノ酸残基で、結合抗体の標的となり接触する。
糖タンパク質 アミノ酸の側鎖にオリゴ糖鎖（糖鎖）が共有結合しているタンパク質。膜に埋め込まれたウイルス表面の糖タンパク質は、受容体の結合など、宿主細胞との相互作用に関与することが多く、宿主の抗体の標的になることも多い。
エピトープ 抗体、B細胞、T細胞などの免疫系によって認識される抗原の特定の部分。
エピトープビンニング 競合免疫測定法を用いて、モノクローナル抗体のライブラリを、重複するエピトープへのアクセスを競う抗体の個別のグループに分類する手法。
Convalescent plasma 過去に感染した人の血清で、通常はポリクローナル抗体と呼ばれる異なる抗体の混合物を含む。同様に、ワクチン接種後の血清には、ワクチン接種によって生成されたポリクローナル抗体が含まれる。
Avidity 機能的親和性とも呼ばれ、ウイルスの受容体結合部位とその細胞受容体との間など、個々の相互作用の複数の親和性が蓄積された結合力のこと。
IC50 半減期阻害濃度のことで、ある生物学的プロセス（例えば、ウイルスが培養中の感染細胞のプラークや領域を形成すること）を50%阻害するために、どれだけの阻害物質（例えば、ワクチン接種後の血清）を必要とするかを示す定量的な指標である。