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pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21783912/
Effect of ivermectin on male fertility and its interaction with P-glycoprotein inhibitor (verapamil) in rats.
アレキサンドリア大学獣医学部遺伝学・薬理学教室（Edfina, Behera, P.O. 22758, Egypt）
記事履歴
2007年12月19日 受理
2008年3月20日 改訂版受理 2008年3月24日受理
2008年3月29日 オンライン公開
概要
浸透性糖タンパク質（Pgp）阻害剤の投与は、Pgp基質の薬理特性を変化させたり、毒性作用を誘発したりする可能性がある。イベルメクチン（抗ヘルペス薬、Pgp基質）の単独投与またはベラパミル（Pgp阻害剤）との同時投与が雄の生殖能力に及ぼす影響について、マウント行動、精巣上体精液分析、雄生殖器官の重量および病理組織学検査、減数分裂染色体の細胞遺伝学評価により調査した。その結果、イベルメクチンを週1回、8週間投与すると、わずかな受胎障害が誘発されることがわかった。一方、ベラパミルの前処理は、精子パラメータおよび生殖器官の組織構造を変化させることにより、雄の生殖能力を阻害した。細胞遺伝学的研究により、イベルメクチンは減数分裂に部分的に影響を及ぼすことが明らかになった。一方、イベルメクチンとベラパミルの併用は、生殖細胞により強い影響を与え、減数分裂の構造染色体異常の頻度が増加し、X-Y染色体の解離が増加したため、成熟精子の遺伝的品質に注目されるようになった。その結果、イベルメクチンは男性の生殖能力にわずかな影響を与えるが、ベラパミルと併用すると減数分裂と生殖能力に悪影響を及ぼすことが判明した。
1. はじめに
イベルメクチンは、Streptomyces avermitilis培養物によって生産されるアベルメクチン科の殺ダニ剤および抗ヘルペス剤で、薬学的用量で哺乳類に副作用がない耐性の高い薬剤である（Fisher and Mrozik, 1992）。イベルメクチンは、μ-アミノ酪酸（GABA）受容体およびグルタミン酸ゲートCl-チャネルのアゴニストであり、後者は無脊椎動物に限定されている（Bloom, 1996）。一部の臨床医は、イベルメクチンが標的寄生虫の胃腸機能を阻害し、寄生虫の飢餓をもたらす可能性を示唆した（Renukaprasad et al., 1989）。イベルメクチンの毒性が低いのは、一部の臓器や脳組織へのアクセスが制限されているためであり、特にPgpの基質であることに起因している（Schinkel et al., 1994）。PgpはATP-binding cassette superfamilyに属する膜貫通型トランスポーターで、ホルモン、ステロール、脂質、リン脂質、サイトカイン、抗がん剤など、多くの疎水性化合物の膜輸送を仲介する（Bellamy、1996）。Pgpは多くの組織や精巣の毛細血管内皮細胞、血液脳関門に存在し（Cordon-Cardo et al., 1990）、そこで異種物質の排出トランスポーターとして機能する（Chen et al., 2004; Lin, 2003）。Pgpを阻害する物質との相互作用は、化学療法薬のような一般的に吸収率の低い重要な医薬品の吸収を促進する可能性があるため、非常に興味深いものである。また、Pgpの阻害は、理論的には、いくつかの医薬品の副作用や毒性の発生率を高め、好ましくない効果をもたらす可能性がある。多くの化合物は、ポンプの流出活性を低下させることによってPgpを調節することが知られており、例えば、ベラパミル、シクロスポリンA、エリスロマイシンおよびそれらのアナログが挙げられる（Ford and Hait, 1990）。したがって、ベラパミルのようなPgp阻害剤によるPgp機能の調節は、特定の薬物の薬理作用を修正する重要な要因となり得る。イベルメクチンの全犬種への使用が承認されているにもかかわらず、。しかし、遺伝的に敏感な犬種であるコリーには、非常に低用量で神経毒性を引き起こす可能性がある。敏感なコリーの脳内のイベルメクチン濃度の上昇は、Pgpトランスポーターによる脳から血液への排出がうまくいかないためと考えられている（Dowling 2006）。
不妊症に関連する染色体異常は2種類ある。体細胞系と生殖細胞系の細胞に影響を及ぼす核型変化と、分裂異常である。どちらのタイプも、精子形成の停止や染色体異常のある配偶子の形成により、自然流産や精神障害、奇形児を含む不妊症の原因となる（Navarro et al., 1987）。また、これらの異常な配偶子は、精巣内環境の変化により、細胞分裂時の染色体分離を制御するメカニズムに悪影響を及ぼした結果として生成されることが報告されている（De Palma et al., 2005）。多くの著者が、iver mectinの生殖能力に対する望ましくない影響を記録している（Tanyildizi and Bozkurt, 2002; Schroder et al., 1986）。本研究は、P糖タンパク質阻害剤とイベルメクチンの薬物間相互作用が男性の生殖能力に及ぼす影響について初めて検討したものであり、P糖タンパク質阻害剤とイベルメクチンの薬物間相互作用が男性の生殖能力に及ぼす影響を検討した。本研究では、ラットを用いて、イベルメクチンが雄の生殖能力に及ぼす影響と、精子パラメータ、体重、生殖器官の病理組織学的検査および生殖細胞の細胞遺伝学的検査に関するベラパミルとの相互作用について検討した。
2. 材料と方法
2.1. 動物
Wisterラットの成体オス（体重170-190g、10-12週齢）を使用した。この動物は、エジプト、アレキサンドリア大学獣医学部の閉鎖的ランダムブリードコロニーから入手した。ラットは、餌と水を自由に摂取できるように維持され、隔離されたケージに6匹のグループで収容された。使用前に2週間、動物に順応させた。本研究は、米国国立衛生研究所が発行した「実験動物の飼育と使用に関するガイド」（NIH publication no.83-23, revised 1996）に準拠している。地元の倫理委員会は、この研究を承認した。
2.2. 実験プロトコル
雄ラットを4群（各12匹）に分けた。グループ1は、週1回生理的食塩水（2ml/kg体重）をi.p.投与し、1時間後にプロピレングリコール（この研究で使用する薬剤のビヒクルとして使用）（2ml/kg体重）をi.p.投与した。グループ2は、週1回食塩水を投与し、1時間後にイベルメクチン、モラメクチン®1%、エジプト、アラコメットから入手（300μg/kg体重） i.p. (Alvinerie et al., 1999).
グループ3は、週1回ベラパミル、トルコ、イスタンブールのKnoll社から入手したIsoptin®（3mg/kg体重）をi.p.投与した（Schroder et al. 投与開始から8週間後、各群を等分し、各群から最初の6匹の雄ラットを選び、マウンティング行動、生殖器重量（精巣、副睾丸、副性器）、これらの器官の病理学的変化、精液分析に用いた。
2.3. 投与終了時（8週間）のマウンティング行動
脂質指向性のマウンティング行動を観察するため、非発情期の雌ラットを処理した雄ラットとペアにした。雄が雌の上で交尾姿勢をとるが、挿入に至らない場合をマウントとした（Subramonian et al., 1997）。各群から雄ラットを無作為に選び、適当に印をつけた。ラットは透明な水槽に入れ、15分間馴化させた。その後、非発情期の雌をアリーナに導入した。マウントの数を15分間記録した
2.4. 生殖器重量
すべての雄ラットの体重を測定し、生け贄とした。精巣、精巣上体、付属性器（精嚢、前立腺）を解剖し、肉眼的に観察して重量を測定した。臓器の指標重量（I.W.）は、I.W.=臓器重量（g）/100×体重（g）により算出した。
2.5. 精巣上体精子数
精巣上体精子は、Yokoiら(2003)の方法を改変してカウントした。簡単に説明すると、精巣上体を5mlの生理食塩水でミンチにし、ロッカーに10分間入れ、室温で2分間インキュベートした。上澄み液を、100mlの蒸留水あたり5gのNaHCO3,1mlのホルマリン（35%）および25mgのエオシンを含む溶液で1：100に希釈した。希釈した精液約10μlを改良型ノイバウル式血球計数装置（Deep 1/10 mm, LABART, Munich, Germany）の各計数室に移し、5分間放置し、光学顕微鏡で倍率200倍で計数した。
2.6. 精子の運動性
精子の進行運動性は、Sonmezら(2005)の記載に従って、尾状精巣上体から分離してから2〜4分以内に顕微鏡的に評価した。ピペットで尾状精巣上体から液体を採取し、トリス緩衝液で2mlに希釈した。運動性の割合を400倍の倍率で評価した。
2.7. 精子の異常
形態異常精子の割合の決定には、Evans and Maxwell (1987)による方法を使用した。各スライドで合計300個の精子細胞を光学顕微鏡で×400倍の倍率でカウントした。
2.8. 病理組織学的研究
ラットを殺した直後に精巣、精巣上体、精嚢および前立腺から切片を採取した。組織は10%中性ホルマリンで少なくとも24時間固定し、段階的（50-100%）アルコールで脱水し、パラフィンに埋め込み、4-5μmの厚さに切り、ヘマトキシリンとエオシンで染色して光顕微鏡検査した（Bancroft and Stevens、1990）。
各群から2番目の6匹のラットを使用した：
2.9. 細胞遺伝学的研究
今井ら(1981)に従って減数分裂染色体を調製した。精巣を解剖し、鋭利なナイフで3片に切断した。精巣組織を低張液（0.005%コルヒチンを含む1%クエン酸三ナトリウム溶液）中に入れた。精細管の塊を1:1のエチルアルコール：氷酢酸で30分間固定し、その後60%アルコール（蒸留水で希釈した1:1の固定液）で再度固定を行った。細胞を1:1固定液に再懸濁し、2滴を清潔なスライドに加え、乾燥させ、3%ギムザで10分間、室温で染色した。スライドは光学顕微鏡で観察された。300個のメタフェースを400倍で観察し、減数分裂のメタフェイズ（SPM）、メタフェイズI（MI）、メタフェイズII（MII）の細胞の比率を算出した。50個のよく広がった精原細胞のメタフェーズとMIIを1000倍で検査し、染色体の構造異常と数値異常を検出した。MIの50個の細胞を調べ、常染色体および／またはX-Yの解離を持つ細胞の数を1000倍で計算した。
2.10. 統計解析
データは分散分析（ANOVA）に供し、P≦0.05で、処理群と対照群を比較した。有意差が認められた場合、Duncanの多重範囲検定（Duncan, 1955）を用いて平均値を比較した。計算はSASシステム(SAS, 1987)を用いて行った。
3. 結果
3.1. 臓器重量
精巣、副睾丸および副性腺の重量は、コントロールに対してイベルメクチン投与群でわずかに減少し（P 0.05）、イベルメクチン+ベラパミル投与群ではこれらの器官の重量の減少がより大きかった。ベラパミルの投与は生殖器重量を有意に変化させない（表1）。
3.2. マウンティング行動
イベルメクチンを週1回、8週間投与したところ、コントロールと比較してマウンティング行動は有意に減少した。一方、イベルメクチンの投与前にベラパミルを投与すると、マウント行動は有意に減少した（P 0.05）。また、ベラパミルの投与はマウンティング行動に有意な変化を与えなかった（表2）。
3.3. 精子の特性
イベルメクチンおよび／またはベラパミル投与時の精巣上体精子濃度、精子運動率および異常精子率を表2に示す。ベラパミル投与は、イベルメクチンによる精子濃度の低下を増強する。
イベルメクチン単独投与では、対照群と比較して精子運動率は有意に低下しなかったが、イベルメクチン投与前のベラパミル投与では精子運動率が有意に低下した（表2）。
全精子異常（頭部と尾部）を分析したところ、ベラパミルとイベルメクチン投与群のみ異常値が有意に高かった（表2）。ベラパミルは精子の運動性と異常値を有意に変化させなかった（表2）。
3.4. 病理組織学的所見
対照ラットの精巣について顕微鏡検査を行ったところ、精細管に正常な組織構造と精子形成が認められた（図1a）。イベルメクチンを投与した場合、精細管内の精原細胞の一部に空胞変性が見られた（図 1b）。ベラパミルのみを投与したラットの精巣には明らかな変化は見られなかったが、（イベルメクチン+ベラパミル）投与では、一部の精細管に凝固した内腔内容物が存在し、他の一部の精細管は完全に凝固壊死しているという形で、破壊的変化が見られた（図1cおよびd）。また、多くの精細管に未完成の精子形成が見られた（図1c）。同じ方向で、精巣上体、前立腺および精嚢で観察された病理組織学的変化は、ベラパミルとイベルメクチンを併用したラットでは、イベルメクチン単独よりも顕著だった（データ示さず）。
図1 ラット精巣の顕微鏡写真、（a）対照ラットは正常な組織構造を示した
(b) イベルメクチンで処理した場合、精細管内の精原細胞の一部に空胞変性（矢印）の影響が見られた、精細管（st）HおよびE×400、（cおよびd）イベルメクチン+ベラパミルで処理した場合、(c)一部の尿細管に変性が見られ、内腔に凝固した内容物が存在する(st) H and E ×250、(d)1つの変性した精細管（矢印）と他の完全に壊死した管（st）H and E ×250を示した。
3.5. 細胞遺伝学的解析
細胞遺伝学的調製で決定された細胞分布数は、イベルメクチンまたはベラパミルを投与した動物で、精子形成期メタフェーズの細胞の割合がコントロールと同程度であったことを示した。両薬剤の併用により、300個の細胞のうち、精原細胞のメタフェーズの割合が有意に増加した。さらに、イベルメクチン、ベラパミルおよびその併用は、MI期の細胞の割合に影響を及ぼさない。しかし、表3に示すように、イベルメクチンを単独で投与した動物およびベラパミルと併用した場合、MIIの細胞数は有意に減少した。MII/MI比の有意な減少は、イベルメクチンおよびイベルメクチンとベラパミルの併用投与群で観察された。
表 300個のメタフェイズにおける精原細胞のメタフェイズ、MI、およびMIIの分布に対するイベルメクチンおよび／またはベラパミルの影響
各群のラット数は6匹。同じ列で異なる文字を持つ値は、P≦0.05で有意に異なる（ダンカンの多重範囲検定によるANOVA）。SPM: spermatogonial metaphase, MI: metaphase I, MII: metaphase II.
表 雄ラットのイベルメクチンおよび/またはベラパミルによって誘発された50細胞の異常な精原細胞のメタフェース、MIおよびMIIの数 b b
すべての値は平均値±S.E.で表され、各群のラット数は6匹である。同じ列で異なる文字を持つ値は、P≦0.05で有意に異なる（Duncanの多範囲検定によるANOVA）。
イベルメクチンまたはベラパミルによって誘発された精原細胞のメタフェイズ、MI、またはMIIの異常細胞数には、有意な増加は見られなかった（表4）。しかし、両薬剤の併用により、精原細胞のメタフェイズ、MIおよびMIIの異常細胞数が有意に増加した。
イベルメクチンおよび／またはベラパミルの投与は、倍数体精子体メタフェーズ（図2a）または二倍体MII（図2f）（数値染色体異常）の数の増加を誘導しなかった（表5）。ベラパミル+イベルメクチンを投与した動物では、構造的染色体異常の数が有意に増加した（精原細胞メタフェースの断片化（図2b）およびMII細胞における断片化の増加（図2eおよび表5）。ベラパミルとイベルメクチンを併用した動物では、X-Y解離の頻度が有意に増加した（図2c）。一方、イベルメクチン、ベラパミルまたはその組み合わせによって誘発される常染色体解離の数（図2d）には、有意な変化はない（表5）。
4. 考察
薬理学的相互作用とは、ある薬に対する反応が、別の物質が反応を変化させたり毒性を誘発したりしたために、通常予測されるものと異なる場合に生じるとされている。しかし、一般的には、薬力学的相互作用と薬物動態学的相互作用という2つの主要な相互作用メカニズムがあると考えられている。近年、イベルメクチンの化学療法プロファイルの全身的な利用可能性を高める試みとして、さまざまな薬理学的アプローチが使用されている（Ballent et al.） 多くの著者は、精液濃度や精子運動率の低下など、イベルメクチンが男性の生殖能力に及ぼす望ましくない影響を記録している（Tanyildizi and Bozkurt, 2002; Schroder et al., 1986）。本研究では、イベルメクチンを週1回、8週間投与したところ、精巣、精巣上体、副性器の重量が減少した。これらの結果は、Zaied (2004); El-Ashmawy and Mandour (1996)の結果と一致するが、Daurio et al. (1987)の報告とは相関しない。これらの反応の違いは、生物種の違いによるものであると考えられる。イベルメクチンの前にベラパミルを投与することにより、これらの器官の重量の減少は、イベルメクチン単独投与よりも顕著であった。また、ベラパミルとアミダランのような薬剤を併用すると、用量依存的に毒性症状が増強されることが報告されている（Molento et al.，2004）。これらの生殖器官重量の減少は、私たちの先行研究および他の研究（Zaied, 2004; Srikhanth et al., 1999; El-Ashmawy and Mandour, 1996）で報告されたテストステロン値の減少に起因すると考えられ、イベルメクチンの中枢神経系および性腺組織への直接作用または視床下部-下垂体-精巣軸への作用によるものと考えられる。マウンティング行動については、これまでの知見（El-Ashmawy and Mandour, 1996）と相関があった。ベラパミルの前処理は、イベルメクチンのマウンティング行動に対する望ましくない効果を有意に増強した。
イベルメクチン単独投与では、精子の性質に有意な変化はなかった。しかし、ベラパミルとイベルメクチンの投与は、精子数、運動率および異常に対する有害な影響を有意に誘発した。
精子量の減少は、イベルメクチンとベラパミルを投与したラットの精子形成に悪影響を及ぼすことを意味する。これらのラットにおける精子の運動性の低下は、運動性の獲得または維持における不具合を示唆するものである。この組み合わせは、精巣上体分泌物を変化させるか、精子の運動性と形態に直接作用する可能性がある（Ballent et al., 2007; Zaied, 2004）。また、ベラパミルとイベルメクチンを併用したラットでは、頭部のない精子、フックレス、コイル状、異常尾部といった精子の異常の増加が観察された。さらに、これらの精子異常は、両薬剤を投与したラットにおいて、病理組織学的異常とも関連していた。
細胞遺伝学的製剤で測定した細胞分布数から、SPMとMIの分布は全群で同じであり、イベルメクチン、ベラパミルまたはその併用は分裂分裂した細胞（精母細胞、精母細胞）に悪影響を及ぼさず、SPM精母細胞のMIへの進行に影響を及ぼさないことを示した。この結果は、精子形成の不完全な抑制を示す病理組織学的所見からも支持される。イベルメクチン+ベラパミル投与群でSPMのメタフェイズ数が増加したのは、300回カウントしたメタフェイズにおけるMIIの細胞数の減少を反映していると考えられる。ベラパミルまたはイベルメクチンとベラパミルを併用した動物でMII/MI比が0.8と有意に減少したのは、精子形成の進行に何らかの影響を与えたが、精子形成が完全に抑制されたわけではないことを示していると思われる。Carraraら(2004)は、MII/MI比が0.8の男性において、MI減数第一期に入った細胞のほとんどが減数第二期に進み、MII/MIが0.5以上のものは精子形成が完全に抑制されることを発見したが、本研究ではこれは当てはまらなかった。Chandleyら(1976)は、メタフェースIIに到達する細胞数の減少と性染色体が対になっていない細胞の割合の増加（特に40%以上）との間に相関関係があると報告しているが、本研究ではX-Y染色体の解離の頻度は21.6%（10.8/50）であり（表5）、これも精子形成が不完全に停止していることを示す。本研究では、イベルメクチンとベラパミルの併用投与により、SPM、MI、MIIの異常細胞数が他の群に比べ有意に増加することが示された。さらに、この併用療法は、構造的な染色体異常を有意に増加させ、X-Y染色体の解離も増加させた。ベラパミルは、アクリルアミド、シクロホスファミドおよびジオキシジンとともに投与した場合、マウスの分裂期染色体に対して共異性化作用を示した（Nesterova et al., 1999）。また、Calogeroら(2003)は、減数分裂染色体相補性の異常が精子の異常と関連することを報告している。さらに、マウスにおけるX-Y解離の頻度の上昇は、精巣重量および精子形成の収率の有意な低下と相関する（Krzanowska, 1989）。また、Y染色体の部分欠失（構造異常）は、精子形成の効率、精子の形態、精巣上体の成熟、精巣上体に到達して卵子を受精させる能力に影響を与えることが報告されている（Styra et al., 2002）。これらの研究はすべて、イベルメクチンとベラパミルの併用投与に伴う精子数の減少、運動率の低下、その異常の増加、さらに生殖器官の重量の減少を説明している。
しかし、イベルメクチンとベラパミルの併用投与を受けた動物の成熟配偶子の遺伝的品質については、懸念がある。Kahramanら(2002)は、妊娠不全の割合が高いことに関連する精子異常の上昇を観察した。
細胞遺伝学的研究により、イベルメクチンはMIIの精子細胞数を減少させることで減数分裂に部分的に影響を与えることが明らかになった。一方、イベルメクチンとベラパミルの併用療法は、MII期の精子細胞数を減少させ、生殖細胞に対してより強い影響を与えることがわかった。SPMとMIIでの構造的な染色体異常の増加、MIでのX-Y染色体の解離の頻度の増加は、成熟精子の遺伝的な質に注目させ、さらなる調査が必要である。
イベルメクチンの毒性が低いのは、特にPgpの基質であるため、組織へのアクセスが制限されていることに起因している（Griffin et al., 2005;Xu et al., 1998）。Pgpは、血液脳関門、精巣、胎盤などの血液組織関門の完全性に関連しており、Pgpの部分的な遮断は、これらの関門の背後にある臓器における薬物率の増加の可能性を伴う生体内の新しい薬物分布の原因となり得る（グリフィン他 2005）。したがって、基質薬とPgp阻害薬の併用は、バイオアベイラビリティや臓器への取り込みの増加によって薬物動態を変化させ、有効性の向上や副作用や毒性の増加につながると考えられる。本研究では、Pgpを阻害するためにベラパミルを使用した（Ford and Hait, 1990）。多くの著者が、P糖タンパク質阻害剤、特にベラパミルがイベルメクチンの薬理学的特性を変化させる役割を論じている（Molento et al., 2004）。したがって、ベラパミルの投与により、イベルメクチンが血液-精巣間の障壁をより通過しやすくなり、細胞内への蓄積と保持が増加すると考えられる。この示唆は、ベラパミルで前処理した動物におけるイベルメクチンの毒性作用が、イベルメクチン単独と比較して顕著であったことを一部説明するものと考えられる。
私たちは、イベルメクチンは雄の生殖能力にわずかな影響を与えるが、ベラパミルと併用すると減数分裂と生殖能力に悪影響を及ぼすと結論付けた。