Confirmation of the presence of vaccine DNA in the Pfizer anti-COVID-19 vaccine
https://hal.science/hal-04778576v1
プレプリント：ファイザー社の抗COVID-19ワクチンにおけるワクチンDNAの存在の確認
2024年11月12日提出のプレプリント
著者リスト：Didier RAOULT1,2*（ディディエ・ラウル）
所属機関：1 IHU メディテラニー感症研究所、19-21 boulevard Jean Moulin、13005 Marseille、フランス;2 Aix-Marseille Univ.、微生物進化系統学感染症学（MEPHI）、27 boulevard Jean Moulin、13005 Marseille、フランス
キーワード
SARS-CoV-2;Covid-19;ワクチン;mRNA;DNA;不純物
要旨
メッセンジャーRNA（mRNA）ベースのワクチンを迅速に生産することが、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックに対抗する最も適切な戦略として選択された。
3件の研究で、ファイザー社のmRNAワクチンにかなりの量のDNAが存在することが報告された。
我々は、この残留DNAの存在を確認することを目的とした。ワクチンバイアルのQubit蛍光光度計を用いたワクチンプラスミドDNAの定量では、平均216 ng/用量であり、Triton-X-100による処理後は約24倍の5,160 ng/用量に達することが示された。さらに、次世代シーケンシングにより、完全なプラスミドDNAワクチンマトリックス（7,824塩基対）の配列を高いカバレッジ（98.3%）とシーケンス深度（平均4,181～4,389リード）で取得し、プラスミドDNAが高コピー数で存在することを示した。
これらの結果は、mRNAワクチン中のDNAのコピー数と性質について、より大規模かつ複数のバッチで評価する必要性を示唆している。特に、細胞への導入後のDNA統合のリスクについてである。
記事のまとめ
ラウール(Raoult)教授が発表したこの研究は、ファイザー社のCOVID-19 mRNAワクチンにおけるDNAの存在を確認したものである。
主な研究結果は以下の通り：
- Qubitフルオロメーターを用いた測定で、ワクチン1回分あたり平均216 ngのDNAが検出された。
- Triton-X-100で処理すると、DNA量は約24倍に増加し、1回分あたり平均5,160 ngとなった。これはワクチン1回分(30 µgのRNA)の17%に相当する。
- 次世代シーケンシング(NGS)により、ワクチンプラスミドDNA(7,824塩基対)の完全な配列を高いカバー率(98.3%)で取得した。
- 複数のワクチンバッチで検査を実施し、63-97%の配列がワクチン由来のDNAであることを確認した。
著者は以下の懸念を示している：
- 検出されたDNA量は、欧州医薬品庁(EMA)と米国食品医薬品局(FDA)が定める許容量(1回分あたり10 ng)を大幅に超過している。
- カチオン性脂質に包まれたDNAが細胞内に取り込まれた場合、ヒトゲノムへの組み込みリスクが理論的に存在する。
著者は結論として、より多くのワクチンバッチについて、世界中の研究機関による品質管理の実施が必要であると述べている。
テキスト
SARS-CoV-2のパンデミックにより、ワクチン開発は非常に速いスピード（1年未満）で進み（Krammer, 2020; Topol, 2021）、世界中で130億回分以上（フランスでは1億5000万回分以上を含む）が投与された（https://coronavirus.jhu.edu/map.html）。これは、新興感染症の急速な拡大に対抗するためにワクチン開発を加速させるべきだという現在の考え方の枠組みに沿ったものである（Cohen, 2016）。最も使用されているのは、ファイザー-バイオジェン社のCOVID-19 mRNAワクチン（またはBNT162 Vaccine-19）である。これは、筋肉内に注射する懸濁液であり、標的細胞に放出されると、コドン最適化された一本鎖、5′-キャップmRNAが、完全長、修飾SARS-CoV-2スパイクプロテインをコードする（Jackson et al, 2020; Krammer, 2020; Polack et al, 2020）。BNT162-19 mRNAの大量生産を可能にするため、製造工程では、最終的なサイズが7,824塩基対（bp）のプラスミドを使用して、活性細菌複製起点、SV40ウイルス開始因子、カナマイシン耐性遺伝子を特に含む改変スパイク遺伝子配列を大腸菌に導入した。（2020年、Rapporteur Rolling Review critical assessment report） 細菌溶解後、プラスミドDNAマトリックスを抽出し、N-メチル化シュードウリジン存在下でT7 RNAポリメラーゼによる転写およびその後の加水分解の前に直鎖状にした。ファイザー社のmRNAワクチンには、原則として極めて微量のDNAしか含まれていない。しかし、少なくとも3つの研究で、ファイザー社のmRNAワクチン用量にかなりの量のDNAが存在することが報告されている（Speicher et al, 2023; McKernan et al, 2023; König and Kirchner, 2024; Hughes, 2024）。このような状況では、必ずしもその存在について結論を出すことを望むことなく、DNAの存在の有無を確認または否定する必要があると考えた。
我々は、Qubit蛍光光度計（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、ワクチンバイアル（バッチ番号GJ7184）のDNA定量を行ったところ、平均216 ng/用量であることが示された。しかし、Triton-X-100で処理したところ、DNA量は約24倍に増加し、平均5,160 ng/用量となった。ワクチン用量には30 µgのRNAが含まれていると報告されているため、この試験ではDNAが17%含まれていることになる。
解説
Triton-X-100での処理に関する意味合いを説明する：
1. 検出メカニズムの観点：
- Triton-X-100は界面活性剤であり、脂質を可溶化する性質を持つ
- ワクチンのDNAは脂質ナノ粒子(LNP)に包まれた状態で存在している
- Triton-X-100処理により、LNPが分解されることでDNAが露出し、より正確な定量が可能となる
2. 実際の数値の意味：
- 未処理の状態で216 ng/用量のDNAが検出された
- Triton-X-100処理後に5,160 ng/用量まで増加
- この差は、LNPに内包されていたDNAが処理によって露出したことを示している
3. 検査手法としての意義：
- 通常の検査方法では、LNPに内包されたDNAの一部しか検出できていない可能性がある
- 実際のDNA含有量を把握するには、LNPを破壊する前処理が必要である
- この知見は、ワクチンの品質管理における検査手法の重要性を示している
4. 規制上の含意：
- EMAとFDAの規制では、1用量あたりのDNA量を10 ngまでと定めている
- Triton-X-100処理後の値は、この規制値を500倍以上超過している
- この事実は、現行の品質管理基準の見直しが必要である可能性を示唆している
さらに、次世代シーケンシング（NGS）は、前述の通り（Colson et al, 2022）イルミナテクノロジーを使用し、MiSeq装置（イルミナ社、サンディエゴ、CA、米国）でNextera XTペアエンド戦略を実施した。
メーカーの推奨に従った。NGSリードは、Accession No. OR134577.1でGenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）（Sayers et al, 2023）に寄託されたワクチンプラスミド配列にマッピングされた。OR134577.1。リードは bwa-mem2 v.2.2.1 (https://github.com/bwa-mem2/bwa-mem2) (Jung et al, 2022) および Samtools v.1.17 (https://www.htslib.org/) (Li et al, 2009)を使用して処理した。Samtools v.1.17を使用して、200ヌクレオチド未満の長さで、ワクチンプラスミドの90%未満をカバーするリードを削除した。Freebayes v1.3.6 (https://github.com/freebayes/freebayes) (Garrison and Marth, 2012) および Bcftools v.1.17 (https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html)を使用して、変異の特定とコンセンサスの生成を行った。2つのワクチンバッチ（FP8191およびFP9359）の逆転写ステップを省略したNGSにより、200塩基以上の14万以上のリードを生成し、 ワクチンRNAの製造に使用されたDNAプラスミド（GenBank Accession No. PP544445およびPP544446）の完全な配列を、7.824塩基対の高深度シーケンス（>4000リード）で取得することが可能となった。 シーケンスされたDNAの約63%から97%がワクチン由来であった。さらに、核酸抽出物のDNase処理（TURBO DNA-freeキット、Invitrogen）により、NGSリードの取得が妨げられることがわかった（それぞれ2リードと1リードのみが参照配列にマッピングされた）。
したがって、ここでは、ファイザー-BioNTechのCOVID-19 mRNAワクチンについて、複数のアプローチと異なるバッチで、DNAが豊富に存在することがわかった。このようなワクチンでは、欧州医薬品庁および米国食品医薬品局が認可しているワクチン精製中に分解されないDNAの最大残留量は、RNA1mgあたり330ngのDNA、または1回分あたり10ngのDNAである（Klinman et al, 2010; Rapporteur Rolling Review critical assessment report, 2020）。我々の調査結果は、qPCR法によってPfizer-BioNTech社のCOVID-19 mRNAワクチンバイアルにDNAが存在することを報告した他の（査読なし）研究や、NGS法によって全長ワクチンプラスミドが取得されたことを報告した他の（査読なし）研究（McKernan et al, 2023; Speicher et al, 2023）と一致している。Speicher et alの研究では、1回あたり1,896～3,720 ngの残留DNA量が、Qubitによる蛍光測定法を用いて推定された。また、qPCRをターゲットとしたワクチンスパイクでは、1:10の希釈でサイクル閾値 1:10に希釈した場合は18.0～23.8、未希釈のバイアルの内容物では16.9±0.5のサイクル閾値値が得られた（Speicher et al, 2023）。
実際、ワクチン1回分あたりのプラスミドDNA配列の量が非常に多いというこれらの結果は、カチオン性脂質にパッケージングされているため、細胞内への侵入後にヒトゲノムに組み込まれるという想定上のリスクに関する問題を提起している（Klinman et al, 2010）。DNAベースの遺伝子治療では、通常、細胞の10～20%がトランスフェクションされ、一時的にトランスフェクションされた細胞の約1～10%が、おそらく終期における核膜再形成時の交差イベントによるものと考えられている（Haraguchi et al., 2002; Lim et al, 2023; Devaux and Camoin-Jau, 2024）。mRNAベースのワクチンに含まれるDNAが、がん遺伝子の発現を誘導したり、腫瘍抑制遺伝子の発現を停止させたりする可能性は極めて低いものの（Wang et al, 2004; Klinman et al, 2010）、さらなる調査が必要である。
全体として、この研究は、推奨レベルを超える相当量のワクチンDNA（Rapporteur Rolling Review critical assessment report, 2020; Klinman et al, 2010）が試験対象のワクチンバッチに存在することを確認している。これまでの知見は、より大規模なスケールで確認する必要がある。これは、世界中の異なる研究所で異なるバッチから得られた多数のワクチンバイアルに対して技術的に非常に容易に実施できる。バッチごとにばらつきがある可能性があり、そのため、グッド・ラボラトリー・プラクティス（優良試験所基準）の要件に準拠し、脂質ナノ粒子からDNAを遊離させるために、異なるバッチに対して定期的な品質管理を行う必要がある。
謝辞
この支援とサポートに感謝いたします。
データの利用可能性
ファイザー社のmRNAワクチンバッチFP8191およびFP9359から回収されたDNAプラスミドの配列は、それぞれアクセッション番号PP544445およびPP544446でGenBankから入手可能である。
利益相反
DRは、日立ハイテクノロジーズ（東京、日本）からの助成金または契約、およびロイヤリティまたはライセンスを申告している。また、Eurofins社の科学委員会のメンバーであり、微生物培養企業（Culture Top）および2つのバイオテクノロジー企業（Techno-Jouvence、Gene and Green TK）の創設者および株主でもある。資金源は、研究の計画および実施、データの収集、管理、分析および解釈、または原稿の作成、レビューおよび承認には一切関与していない。
著者による貢献
概念化、方法論、形式分析および解釈、原案作成、レビューおよび編集：DR。
資金源
本研究は、フランス政府により国立研究機構（ANR）が管理する「未来への投資」プログラム（Méditerranée‐Infection 10‐IAHU‐03）の支援を受けた。
倫理
該当なし。
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