Antibodies in serum of convalescent patients following mild COVID‐19 do not always prevent virus receptor binding
onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/all.14523
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 ELISA：酵素結合免疫吸着アッセイ HRP：ワサビペルオキシダーゼ IgG、IgA、IgM：免疫グロブリンG、A、M RV. ライノウイルス 編集者へ、2019年12月に中国・武漢で最初の症例が出現した後、新規ヒトコロナウイルス疾患「COVID-19」は史上初のコロナウイルスパンデミックとなった1。
2020年7月16日には、全世界で1350万人以上の患者が新型コロナウイルス「SARS-CoV-2」に感染し、COVID-19に関連した全世界での死亡者数は584.000人以上と報告されている。コロナウイルスの最初の記述は、鶏から分離された1930年代にさかのぼる。元々、コロナウイルスは牛、家禽、豚、猫の重要な病気に関連していた。
コロナウイルスは、丸い構造をしており、表面から突出した長い花びら状のトゲを持つ、大型のエンベロープ型の正鎖RNAウイルスである。
コロナウイルスは3つの血清群に分けられ、そのうちI群とII群は哺乳類から、III群は鳥類から分離されている。I群とII群（I群：HCoV-229E、HCoV-NL63、II群：HCoV-OC43、HCoV-HKU1）は、数十年前からヒトの比較的軽度の一般的な風邪の原因として知られている。
しかし、2002年に重症急性呼吸器症候群（SARS）（グループIIb）、2012年に中東呼吸器症候群（MERS）（グループIIc）が、それぞれ新型コロナウイルスであるSARS-CoVとMERS-CoVに起因することが明らかになり、感染者の最大10%に高い死亡率をもたらした1。
SARS-CoV-2は、SARS-CoVと同様に、ヒト細胞上のアンジオテンシン変換酵素2であるACE2を受容体2とし、その受容体結合ドメイン（RBD）で結合している。
COVID-19の臨床経過は、1週目に発熱、咳嗽、倦怠感、2週目に呼吸困難、リンパ球減少、肺炎を発症し、3週目には消失するという三相性のパターンである。急性感染症の診断は、患者の鼻咽頭スワブにRT-PCRによりウイルス由来の核酸が存在することを証明することで可能である。
しかし、COVID-19に対する特異的かつ有効な治療法は現在のところ存在しない。したがって、隔離、社会的遠距離、および衛生上の注意事項の強化が、ウイルスの拡散を防止するための唯一の手段である。
COVID-19患者がSARS-CoV-2特異的抗体を発現することが示されているが、ウイルス誘発抗体がどの程度の感染者で保護されているかは不明である。
COVID-19入院患者が再感染から保護する抗体を発現しているかどうかを調べるために、我々は、qRT-PCRでCOVID-19を確認してから約10週間後にCOVID-19入院患者から血清を採取した（表S1）（B群、n=25、女性11名、男性14名、年齢幅18～70歳、中央値52歳。18-70歳、年齢中央値52.2）、対照としてCOVID-19パンデミック前に得られた被験者の血清を含む（歴史的対照群P、n=24、女性13名、男性11名、年齢範囲：18-68歳、年齢中央値43.2）。18-68歳、年齢中央値43.2）（表S1）。
PCR確認済みのCOVID-19隔離患者（B群）におけるCOVID-19の経過は比較的軽度であり、入院を必要としなかったが、COVID-19に関連した症状の持続期間は患者によってかなりのばらつきがあった（すなわち、1～23日）（表S1）。
COVID-19の回復期患者は、SとRBDに対して非常に強いIgG反応性を示したが、RBD特異的IgGは、過去の対照群（P群）のうち1人（P014）を除いてすべてに認められず、そのうちS特異的IgGを示した患者は少なかった（図1）。
COVID-19の回復期患者のサブセットで測定されたIgA抗RBDおよび抗S反応は低く、歴史的対照のサブセットでは検出されなかった（図S1、補足の方法）。強いS-およびRBD特異的IgM反応は回復期の患者で認められたが、歴史的対照群では頻繁で明瞭なIgM反応も認められた（図1）。
この文脈では、SおよびRBDがいくつかのグリコシル化部位を含むことに言及しなければならない（図S2）（補足の参考文献参照）。我々のELISAで使用したSおよびRBDは真核細胞で発現していたため、グリコシル化されていた。これは、IgGによる時折の弱い認識、およびIgMによるより頻繁な認識を、血清中の抗糖鎖抗体の存在によって説明できるだろう。
したがって、COVID-19の血清学的アッセイにおいて、グリコシル化RBDまたはスパイクタンパク質が使用される場合、抗糖鎖抗体が「偽の」陽性検査結果を与える可能性がある。
ELISAにより決定されたRBD特異的IgGレベルは、完全に自動化されたSiemens, Atellica IM SARS-CoV-2 Total (COV2T)試験により決定されたSARS-CoV-2特異的抗体と高度に相関していた（補足の方法、図S3A、表S2を参照のこと）。また、ELISAによって測定されたRBD特異的IgMレベルとシーメンス検査との間に有意な相関が見出された（図S3B）。
COVID-19回復期患者におけるRBD特異的IgM応答は、必ずしも対応するIgG応答と関連していなかった（図1）。例えば、被験者B003およびB00Xは、RBD特異的IgM反応性を示したが、RBD特異的IgMはほとんど発現せず、被験者B004は、S-およびRBD特異的IgMを含むが、特異的IgMは検出されなかった（図1）。
S特異的IgMとIgG反応との間に相関はなく、RBD特異的IgMとIgG反応との間には有意な相関が認められた（図S4;補足の方法）。
年齢とS-およびRBD特異的IgMまたはIgGレベルとの間には相関は見られなかったが（図S5）、RBD特異的IgGおよびIgMレベルがCOVID-19の症状の持続期間と有意に相関していたことは興味深いことであり、疾患の長期化、ひいてはウイルス負荷がウイルス特異的抗体産生の増加につながる可能性を示唆している（図S6）。
血清のサブセットでは、RBDを含む完全な受容体結合サブユニットS1にまたがる25個の合成オーバーラップ25～30アミノ酸長のペプチドに対する抗体反応性を解析することができた（表S3、図S2、補足資料の方法）（図S7、S8）。
試験された5人の昏睡状態のCOVID-19被験者からの血清、およびより低い程度ではあるが、対照群Pの被験者からの血清は、S1のN末端およびC末端からのペプチド、ならびに明瞭なRBD由来のペプチドに対して、いくつかのIgM反応性を示した（図S7、S8）。
また、SARS-CoV-2のS1-由来ペプチドの大部分のアミノ酸配列は、SARS-CoVでは高度に保存されていたが、ヒトの風邪の原因となる他のコロナウイルスでは保存されていなかった（図S9-S13）ことから、他のコロナウイルスではペプチド特異的なIgM反応が誘導されなかったことが示唆された。SARS-CoV-2特異的分泌抗体の解析のために喀痰や鼻汁を採取できなかったのは、我々の研究の限界である。
しかし、興味深いのは、COVID-19の回復期患者が、RBDを介してウイルスと対応する受容体ACE2との結合を阻害し、再発感染から身を守ることができる抗体を開発しているかどうか、また、どのくらいの数のCOVID-19回復期患者が開発しているかどうかを研究することであった。
現在、承認された標準的なウイルス中和アッセイは存在しないため、COVID-19 回復期患者がウイルス由来の受容体結合ドメイン（RBD）と受容体ACE2との結合を阻害する抗体を開発したかどうかを調べるために、SARS-CoV-2 の受容体ACE2への結合を模倣した分子間相互作用アッセイを開発した。
このELISAアッセイは、プレートに結合した組換えACE2をベースにしており、この組換えACE2は組換えHisタグ付きRBDに結合することが許されている（図2A）。
結合したRBDは、マウスモノクローナル抗His抗体で検出され、続いて二次的なHRP標識抗マウスIgG1抗体で検出される（図2Aおよび本記事のオンラインリポジトリの方法）。
このアッセイは、最近利用可能になった相互作用アッセイに類似しており、Hisタグ付きRBDの代わりにHRP標識RBDを使用している。
図2Bは、RBDが用量依存的かつ特異的な方法でACE2に結合することを示しているが、陰性対照タンパク質であるシステインを含むHisタグ付き組換えパリエタリアアレルゲン、Par j 2はACE2に結合しないであった（Methods, Supplement）。
次に、可溶性ACE2とのプレインキュベーションにより、ACE2へのRBDの結合が特異的に阻害されるかどうかを調べた（図2C、補足のMethods）。
その結果、RBDとACE2を事前にインキュベートすることで、RBDとACE2の結合がほぼ完全に阻害されたのに対し、ネガティブコントロール蛋白質であるBet v 1を事前にインキュベートしても、RBDとACE2の結合には影響がないことがわかった（図2C）。
次に、COVID-19回復期患者の血清サンプル中の抗体がRBDのACE2への結合に及ぼす影響を調べた。図2Dおよび表S2は、25人のCOVID-19回復期患者の血清とACE2との事前インキュベーション後のRBDの結合に対応する光学密度（OD）値を示す。
50%以上の阻害が6つの血清（B013、B017、B018、B019、B029、B030）で認められ、最大50%までの阻害が9つの血清（B003、B014、B015、B020、B024、B025、B027、B031）で認められた。
B032）、5つの血清（B00X、B016、B021、B022、B023）では阻害が見られず、5つの血清（B001、B002、B004、B026、B028）では、ACE2へのRBD結合の増強さえも認められた（図2）。2D、表S2）。) COVID-19パンデミックの前に得られた24の対照血清では、関連する阻害は観察されず、我々のアッセイの高い特異性（100%）を示している（図2E）。
SおよびRBD特異的IgM抗体を含む対照群の血清（P0014）では、RBDのACE2への結合が増強されていた（図2E、表S2）。
興味深いことに、S-抗体またはRBD特異的IgG抗体またはIgM抗体のレベルは、阻害アッセイにおけるACE2へのRBDの結合の阻害と相関しなかった（図S14）。また、RBDのACE2への結合の阻害の割合と、COVID-19の症状の持続期間および被験者の年齢との間には、それぞれ有意な相関はなかった（図S15）。
潜在的な免疫増強抗体を検出するだけでなく、潜在的な防御効果のようなSARS-CoV-2特異的抗体の特徴について知らせることができるアッセイの必要性がある。
最近記載された別の類似のアッセイと同様に、我々が開発したアッセイは、シンプルで堅牢なELISAベースの分子間相互作用アッセイであり、これにより、SARS-CoV-2 RBDの受容体への結合を阻害することができる抗体および化合物の検査を可能にするであろう。
これは、ACE2誘導体や組換え抗体のような特定の分子がCOVID-19感染症の治療法として検討されており、より多くの分子を同定し、治療に最も効率的な化合物を抽出する必要があるため、重要なことである4,5。
これらの試験が検証されれば、ウイルスと受容体の相互作用を阻害することができる抗体を産生するCOVID-19の回復期患者の特徴を特定し、治療用回復期血漿を得たり、ポリクローナル免疫グロブリンやモノクローナル抗体製剤の検証にも役立つ。
さらに、これらのアッセイが検証されれば、将来のウイルスの発生の可能性を考慮して、スパイク蛋白質のACE2受容体への結合を阻害する抗体の存在について、COVID-19の回復期患者のマススクリーニングに適している。
我々のデータは、限られたものではあるが、むしろ、自然なSARS-CoV-2感染は、すべての感染者において、受容体とウイルスの相互作用を防ぐことができる抗体反応を確立していないことを示すであろう。COVID-19-convalescentの患者の60%だけが、ACE2へのRBDの結合を阻害する抗体を産生していた。
追加のウイルス中和試験は実施できないであったので、COVID-19入院患者がRBDとACE2の結合を阻害する抗体以外の保護抗体を産生している可能性を排除することはできない。
例えば、ウイルスと細胞膜との融合を阻害する抗体や、Fc受容体を介したウイルスクリアランスに寄与する抗体があるかもしれない。しかし、我々の研究は、RBD特異的IgG抗体を産生した患者の血清によって引き起こされるACE2へのRBD結合の増加の証拠を提供する最初のものである。
これは、受容体相互作用を阻害することなくRBDと結合し、最終的にはウイルスの炭水化物エピトープに向けられる可能性のあるRBDと抗体からなる免疫複合体の形成によって説明される可能性がある。このような免疫複合体を介したSARS-CoV-2受容体結合のメカニズムは、COVID-19の免疫増強に関する以前の知見を説明するものであろう6。
また、このような免疫複合体を介した感染細胞やACE2結合ウイルスを含む細胞の架橋が、大量の抗凝固療法にもかかわらず重症のCOVID-19患者で観察されるような、不可解に高い血栓塞栓症イベントの発生率の原因となることも考えられる7。ACE2は血管内皮細胞に発現していることにも言及しなければならない。
以上の結果から、SARS-CoV-2の自然感染は、ライノウイルス（RV）感染と同様に、すべての感染者においてウイルス受容体相互作用を阻害する保護抗体反応を誘導しないことが示唆され、SARS-CoV-2ワクチンの開発が急務であることが明らかになった9 。
分子間相互作用測定法は、保護抗体を発現している被験者を特定したり、RBD-ACE2相互作用を阻害する抗体を誘導するワクチン候補のスクリーニングに有用であると考えられる。