細胞外DNA（exDNA）の細胞内プロセスにおける役割について
The role of extracellular DNA (exDNA) in cellular processes

pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33858306

オンライン公開2021年4月16日

概要

現在、細胞外DNAや循環遊離DNAは、がんを中心とした様々な病態において、臨床応用（診断、予後、治療効果のモニタリング、患者のフォローアップ）できる分子と考えられている。しかし、その分子特性から、他にも様々な機能を持つ可能性がある。本総説では、細胞外DNA（exDNA）が、細胞シグナル伝達、凝固、免疫、遺伝情報の水平移動による進化、炎症過程への適応反応などの基本的なプロセスに関与していることに注目する。これらのプロセスにおけるDNAの役割をより深く理解することで、病態をモニターしコントロールするためのより良いツールを開発することができ、また、リキッドバイオプシーにおけるDNAの応用にとどまらず、新しい治療法を生み出すのに役立つだろう。

キーワード　細胞外DNA、セカンドメッセンジャーDNA、水平DNA転送、酸化DNA、細胞外DNAトラップ

はじめに

真核生物では、DNAは細胞核の中に存在するというのが一般的な認識である。細胞外、特に血漿中にDNAが存在することを報告した最初の研究の一つは、1948年にフランスの研究者マンデルとメテが行ったもので、彼らは患者や健康な人の血漿中にDNAが存在することを証明した1。細胞外DNA（exDNA）は、炎症性疾患、自己免疫疾患、エリテマトーデス、心筋梗塞、糖尿病、がんなど多くの疾患で観察されるようになった2。その後の研究で、このexDNAが疾患の状態を反映するものとして機能することが示唆され、以来、研究対象になっている。この発見では、細胞膜を越えて存在するDNAをexDNA、血流、リンパ系、胆汁、牛乳、尿、唾液、粘液懸濁液、髄液、羊水などの循環生理液に含まれるexDNA分子を循環DNA（circDNA）と定義した3、4。

exDNAの生物学に関して、最も研究されてきたのはexDNAの起源と放出メカニズムである。exDNAはすべての細胞に由来し、主に高分子複合体（タンパク質、脂質、または他の核酸と結合）または細胞外小胞に関連したさまざまな形態で循環中に存在し得る5。これはexDNAが細胞から放出される方法に大きく依存し、文献には受動および能動のさまざまなexDNA放出メカニズムが述べられてきた。これらの研究により、DNAの細胞外空間への放出は、

1）DNA-タンパク質複合体（1000～3000塩基対）やDNA細胞外トラップなどの高分子構造体を介した生体細胞の代謝活性分泌により直接起こる可能性があることが示された、4ゲノムの不安定性（30～20,000 bpのサイズ）によって誘導される染色体外循環DNAの微小核形成と小胞輸送（エクソソーム、ヴィルトソーム、AGO2）によって、あるいは

2）アポトーシスやネクローシスなどの異なる死経路によって生じる細胞破壊のメカニズムの結果として間接的に生じるもの;9-13、および好中球細胞外トラップ放出、貪食、オンコシスからなる他の経路によって生成される細胞破壊メカニズムの結果として間接的に発生する。14-健康な人の場合、造血の成熟が正常なexDNAプールに大きく寄与していることが知られている。その後、複数の研究により、リンパ系/骨髄系組織が主に正常なexDNAプールに寄与していることがさらに確認された17。

Diehlらは、exDNAの量は腫瘍の負担と相関する、すなわち、患者の血液中のexDNAの量は腫瘍の負担と密接に相関し、腫瘍の成長および/または病気の進行に伴って著しく増加することを報告した19。しかし、循環腫瘍細胞だけがexDNAの唯一の供給源ではないことが仮定されている。したがって、exDNAの別の部分は、腫瘍微小環境の細胞、抗腫瘍反応に関与する細胞、および潜在的にストレスのかかった正常細胞にも由来することが推測される20。

血漿・血清または生体液中のexDNAの臨床応用に関しては、ほとんどの研究が腫瘍学分野で行われてきた。初期の研究では、細胞外に放出されたDNAは、例えば、DNAの完全性の変化21、がん遺伝子またはがん抑制遺伝子の変異、遺伝子メチル化異常、マイクロサテライトの変化22、ミトコンドリアDNA負荷レベルの変化23、染色体ゲノム再配列など、放出元の組織の遺伝的およびエピジェネティックな特徴を保持していることが実証された22。さらに、血液中の濃度は、腫瘍の最新の進展と特異性をリアルタイムで反映することができる。24これらの特徴から、exDNAは可能性のあるがんバイオマーカーとして提案された。25現在、exDNAの診断上の重要性はますます顕著になっている。実際、腫瘍学におけるその重要性は、「リキッドバイオプシー」という新しい分野での数千件の研究につながっている。つまり、リキッドバイオプシーとは、がんの早期発見、正確な診断、治療効果、予後、経過観察に関する情報を提供する非侵襲的診断検査であり、組織サンプルを得るために必要な侵襲的処置、特に連続したサンプルを必要とする場合は、これを回避することができる26。このような進歩に伴い、がん患者の層別化のための分子バイオマーカーの検査が必須となっている。このような検査は、診断時に得られた原発性腫瘍の生検・細胞診材料を用いて日常的に行われている。この方法は診断目的には適しているが、病気の進行や再発時の患者のフォローアップには不向きである。リキッドバイオプシーのコンセプトは、がん患者の管理に革命をもたらす可能性を秘め、組織サンプルを得るために必要な侵襲的な手順を排除し、治療反応や病気の再発に関する情報をその場で提供するために、がん学に導入された28-30。現在、リキッドバイオプシーはすでに臨床試験で用いられている。しかし、日常臨床に導入するには、いくつかのハードルを乗り越える必要がある31-34。この興味深い問題は、このレビューでは取り上げきれない。

しかし、生物におけるexDNAの生物学的役割はまだ不明である。本総説では、細胞内シグナル伝達、酸化ストレス応答、炎症・自然免疫、血液凝固、遺伝情報の水平移動による進化など、exDNAが直接的・間接的に関与する可能性のある生物学的プロセスについて、その実態を明らかにしようと考えている。

細胞内シグナル伝達におけるexDNAの役割

1969年、E. Bellは、情報DNA（I-DNA）またはインフォーマソーム（I-somes）と名付けられたリポタンパク質複合体にパッケージされたDNA分子を介して、exDNAと細胞間コミュニケーションの関連を初めて明らかにした。このI-DNAは、細胞質に存在する核DNA（ミトコンドリアではない）で、タンパク質合成の鋳型として働く核と細胞質間の情報仲介役と説明されている35-37。

exDNAは生物学的に活性な分子であり、遊離DNA断片、小胞結合DNA、DNA-高分子複合体（タンパク質脂質核酸複合体）という異なるタイプのDNAからなる異種複合体として分類されることが示唆されており、これらはDNAの静電特性や自己縮合特性により形成され、その機能はヌクレアーゼからの保護や免疫監視にある4、20、38。-40外来DNAは、細胞内に入ったとき、あるいは標的細胞の表面と相互作用したときに、細胞間メッセンジャーとして作用し、さまざまな生物学的応答を引き起こす、さまざまな活性を持つことができる。核酸配列は、その機能に必ずしも暗示的ではない。-42最近の研究では、exDNAの特異的なシグナル伝達特性の一部は、配列長、立体構造、DNA分子とヒストンや非ヒストンのクロマチン結合との関連、細胞内局在、メチル化状態、配列（すなわち、ジヌクレオチドCG含有）、酸化状態（8-oxodG）などの多様な要因に依存していると考えられている20,43-46。

高分子（タンパク質-脂質）に結合した、あるいは遊離した外来DNAは、白血球の細胞膜にあるセンサー4,47や細胞質内にあるリガンドレセプターによって検出される、また、アルブミンなどのタンパク質がexDNAと複合体を形成し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることも報告されている20。細胞内に侵入したexDNAは、エンドソーム膜に存在するTLR-9（Toll-like receptor 9）によって検出され、非メチル化配列によって活性化される49-55。

一方、細胞外小胞（EV）に結合したDNAは、生物学的に機能し、細胞間メッセンジャーの役割を果たし、DNAをコードするmRNAやタンパク質レベルの増加により標的細胞の生物機能を制御し、細胞の増殖を刺激して表現型の変化を誘発することができる16,38。EVには、全ゲノムからランダムに選択されたDNA断片が含まれており、クロマチン結合二本鎖DNAの5ʹプロモーター領域、遺伝子コード領域、3ʹ非翻訳領域にまたがっている38。後者は、cGAS-STINGを介したインターフェロンI型（IFN-I）応答の活性化などのシグナル伝達経路を活性化し、標的細胞における分子応答を引き起こす細胞間コミュニケーションに最も関連するものである56。エクソソームは、エンドサイトーシス、融合、あるいは特異的な受容体結合といった異なるメカニズムによって細胞から細胞へと移行することができる38。エクソソームは、C型レクチン、CD33、カドヘリン11、インテグリンα6β4、CD9、CD81、TIM1/TIM4といった直接的に、あるいはEGFRといった間接的にその内部化を促進するいくつかのタイプの受容体を使用していると考えられる57。

ゲノムDNAの水平移動とシグナル伝達は、細胞間コミュニケーションを媒介し、影響を受ける細胞の機能に影響を与え、ゲノムへの統合や標的細胞の受容体への結合によって、有害物質に対する耐性の誘導、免疫学的変化、転移の発生、がん細胞への転換を可能にする遺伝的不安定性の発生などの生物学的効果を引き出すかもしれない20、36、39、40、47。このようなexDNA（遊離または結合したEV）の活性は、心筋症、がん、アルツハイマー病、骨格筋疾患などで観察されており、細胞間コミュニケーションによって作用し、受容細胞の生物学的機能に影響を与えている38。

細胞シグナル伝達におけるexDNAの活性の可能性を試験管内試験で検証した：T細胞をドナーから抽出し、単純ヘルペスウイルス（HSV）に暴露した。HSVによる刺激でT細胞が放出したDNAを分離し、B細胞培養に3日間加えたところ、抗HSV抗体が合成された。また、HSVやポリオウイルスに暴露されたT細胞の培養液から放出されたDNAをヌードマウスに注射したところ、注射5日後に、これらの病原体に直接暴露されることなく、特異的な抗HSV抗体や抗ポリオ抗体が作られた。これらの実験は、T細胞が放出したDNAが、適応免疫反応に関わる細胞シグナルのメディエーターとして機能する可能性を示しているようだ4,47。

酸化ストレス応答におけるexDNAの役割

分子、細胞、組織レベルで恒常性を維持するために、さまざまな経路が活性化される。Kostyukとその共同研究者は、酸化した外来DNAが、DNAを獲得した受容体細胞の種類によって、生存と細胞死に影響を与えることを実証した。彼らのモデルでは、酸化した外来DNAが、NF-kBの核へのトランスロケーションによって炎症反応に関与するさまざまな経路を刺激し、TNF-α、IL-1, IL-2, IL-6, IL12、接着分子といった炎症性サイトカインの合成が促されると示唆した58。これにより、活性酸素が増加し、その影響は、酸化されていないexDNAと比較して、免疫反応刺激において12倍となる58。酸化されていないDNAは、NF-kBやNRF-2の発現を増加させるため、酸化ストレスの反応が弱く、長期化し、慢性的な細胞死を引き起こすため、反応の大きさが大きく異なる58,59。8-oxodGは、内皮NO合成酵素60の減少とともに一酸化窒素（NO）の産生低下を誘導し、NAD（P）H酸化酵素（NOX4がコード）を増加させることにより、大規模かつ急性な細胞死を引き起こす61。酸化ストレスは、線維芽細胞のKi-67減少に伴う増殖の低下をもたらし、その後細胞死を引き起こす58、60。

一方、間葉系幹細胞では、酸化したexDNAの影響により、細胞を活性酸素から守るシステム、例えばNRF-2の活性が上昇し、一方、HUVECやMCF-7などの細胞株では、代わりにNF-kBやNOX4のレベルが上昇した。58,61このことは、DNA中のGC量とその酸化レベルが細胞の生存に直接関わっていることを示す。

酸化ストレス時に発生する活性酸素が核およびミトコンドリアDNAに損傷を与えることは広く認められている。したがって、細胞外培地に放出された活性酸素はexDNAを酸化して8-oxodGを形成し、8-oxodGの生産と細胞内への取り込みとの間のフィードバックサイクルを引き起こし、活性酸素のより大きな生産が起こり、細胞が死ぬまで継続すると考えられる58,62…。このことから、酸化したexDNAは酸化ストレスマーカーとなる可能性があり、その酸化レベルは、CGジヌクレオチドが酸化されやすいため、その存在量と関連することが示唆されている63,64。このexDNAの存在は、増殖抑制や活性酸素トリガーによるアポトーシスと関連すると言われている63。

この点に関して、最近の研究で、酸化されたexDNA（8-oxodG）は、照射部位に隣接する細胞における「バイスタンダー」効果を通じて放射線適応反応を制御するシグナル分子であることが示された62。バイスタンダー効果は、ゲノム不安定性の発生、細胞死、バイスタンダー細胞による適応反応と関連しており、これらは、受けた照射量に依存する。放射線そのものが一次酸化ストレスを引き起こし、活性酸素のレベルを上昇させ、デオキシリボース環の破断によってゲノムDNAに損傷を与え、その結果、アプリック/アピリミジン部位、二本鎖切断、DNA-タンパク質架橋、および酸化塩基の形成が起こる62,65。これらにより、8-oxodGレベルが上昇し、アポトーシスが誘発され、酸化されたexDNAが放出されやすくなり、それがバイスタンダー細胞によって獲得され、アポトーシスの初期段階に関与する経路を誘発する。しかし、適応反応では、細胞内の活性酸素が増加し、抗酸化反応の活性化によってDNAの破壊が修復され、その結果、短期的に細胞周期が停止するのである62,66,67。一方、低線量の放射線は、放射線適応反応を引き起こし、活性酸素レベルの減少によってアポトーシスが抑制されるかもしれない65。

結論として、(dG)n酸化exDNAが様々な受容体に結合すると、NF-kBを活性化し活性酸素レベルを増加させるTLR-9への結合で観察されたように、異なるシグナル伝達経路が引き起こされる。DNAが修復されるか、あるいは細胞死が起こるかは、ある程度、各細胞の分化状態に依存する（図1）58,65。