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The Ramazzini Institute 13-week pilot study on glyphosate and Roundup administered at human-equivalent dose to Sprague Dawley rats: effects on the microbiome

The Ramazzini Institute 13-week pilot study on glyphosate and Roundup administered at human-equivalent dose to Sprague Dawley rats: effects on the microbiome

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5972442/

要約

背景

グリホサート系除草剤（GBH）は、細菌、真菌、植物のシキメート経路に作用する広範な除草剤である。GBHがヒトの健康に及ぼす影響については、その潜在的な発がん性と非発がん性の両方の影響（マイクロバイオームへの影響を含む）について、激しい議論の対象となっている。本パイロット研究では、「安全」とされるグリホサート（米国の許容一日摂取量（ADI）1.75 mg/kg bw/day）のGBHに胎内から暴露することで、Sprague Dawley（SD）ラットの腸内マイクロバイオームの組成に変化があるかどうかを検討した。

方法

妊娠日（GD）6 日目から産後日（PND）125 日目までの F0 仔ラットに、グリホサート単独および GBH の市販ブランドである Roundup を、米国のグリホサート ADI（1.75 mg/kg bw/日）に匹敵する用量で飲料水に投与した。F0 仔ラットと F1 仔ラットの両方から複数の時点で動物の糞を採取した。433個の糞便サンプルの腸内細菌叢を16SリボソームRNA遺伝子のV3-V4領域でプロファイリングし、さらに分類学的に割り付け、多様性分析のために評価した。PERMANOVAを用いて全体的なマイクロバイオームの多様性に対する曝露の影響を、LEfSe解析を用いて個々の分類群に対する曝露の影響を検証した。

結果

マイクロバイオームプロファイリングの結果、ラウンドアップとグリホサートへの低用量曝露は、F1仔のみの細菌組成全体に有意で特徴的な変化をもたらすことが明らかになった。具体的には、ヒトの思春期前年齢に相当するPND31において、ラウンドアップとグリホサートに曝露されたF1仔では、対照群に比べてFirmicutes（ラクトバチルス）が減少する一方で、Bacteriodetes（Prevotella）の相対的な存在量が増加していた。

結論

本研究は、安全と考えられる用量で、一般的に使用されるGBHへの暴露は、特に思春期の発症前に、早期発達における腸内細菌叢を変更することが可能であることを最初の証拠を提供している。これらの知見は、小児期などの早期発達におけるGBHの潜在的な健康影響に関する将来の研究を保証するものである。

電子補足資料

本論文のオンライン版(10.1186/s12940-018-0394-x)には補足資料が掲載されており、許可されたユーザーは閲覧可能です。

キーワードは以下の通り。ラウンドアップ、グリホサート、腸内マイクロバイオーム、初期発生段階

背景

グリホサート（IUPAC 化学名 N-(ホスホノメチル)グリシン）は、最もよく知られた製剤であるラウンドアップを含む、世界で最も広く適用されている除草剤であるグリホサート系除草剤（GBH）の有効成分である。グリホサートという物質は、1950 年にスイスの化学者アンリ・マルタンによって、製薬会社シラグで発見された [1]。グリホサートの除草特性が発見されたのは、その後20年後のことである。グリホサートが除草剤としてモンサント社によって1974年に特許を取得して以来、約940万トンのGBHが散布されており、世界中の耕作地1エーカーごとに約5分の1ポンドのグリホサートが散布されている[2]。さらに、1996 年にグリホサート耐性を持つ遺伝子組み換え作物が導入されて以降、GBH の使用量は急増し、GBH の使用量全体の約 3 分の 2 がここ数十年で発生している。全米科学アカデミーの報告書[3]によると、2014 年だけでも、農業界におけるグリホサートの年間使用量は 1 億 1,000 万キログラムを超えている。遺伝子組み換え作物以外にも、農家は収穫を早めるために遺伝子組み換え作物以外の作物にも GBH を散布している。乾燥としても知られるこの慣行は、グリホサートの残留物とその一次代謝物であるAMPA（アミノメチルホスホン酸）[4, 5]への著しい食餌曝露につながっている。

グリホサートの主要な除草機能は、植物の主要な酵素である5-エノールピルビルシキメート-3-リン酸合成酵素（EPSPS）を阻害することである。この酵素は、細菌、真菌、植物のシキメート経路を介して芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）の生合成に関与している。細菌で同様の反応を触媒することが知られている唯一の酵素は、細菌細胞のペプチドグリカン層の合成における最初のコミットされたステップを触媒する酵素MurA（UDP-N-アセチルグルコサミンエノールピルビルトランスフェラーゼ、EC 2.5.1.7）である。細菌の成長と生存は、広スペクトル抗生物質ホスフォマイシンの標的である酵素MurAの機能性に依存しています。グリホサートは、三元酵素-基質複合体の中間状態を模倣して、MurAの結合部位を占めているように見える[6]。2つのエノールピルビルトランスフェラーゼEPSPSeとMurAの間の類似性は、グリホサートの抗菌活性を明らかにしているように見える。EPSPS駆動の経路は脊椎動物の細胞には存在しないため、多くの科学者や環境規制機関は、グリホサートが哺乳類、特にヒトに与えるリスクは最小限であると考えていた[7-9]。このため、シキメート経路は、新しい抗微生物剤や抗寄生虫剤の開発の対象となってきた。実際、グリホサート製剤は抗寄生虫薬として特許を取得している[10]。しかし、グリホサートやGBH（ラウンドアップなど）が複数のメカニズムを介して哺乳類の生物学に悪影響を及ぼす可能性があることを示唆するいくつかの新たな証拠が出てきている[11-13]。宿主とそのマイクロバイオームとの間の機能的相互作用の下流での解析により、これらの相互作用についての機序的な洞察が得られ始めている。腸内マイクロバイオームが宿主への特定の影響を調節するメカニズムは完全には明らかになっていないが、いくつかのメディエーターがそのような影響のための潜在的な乗り物として提案されており、エフェクター、酵素補因子、シグナル分子として機能している可能性がある。このようなメディエーターには、リポ多糖類、ペプチドグリカン、短鎖脂肪酸、神経伝達物質、および気体分子が含まれる [14, 15]。個々の微生物種および複雑な微生物群集の組成と機能の特徴付けにおける最近の進歩により、宿主免疫系にとって微生物代謝が重要であることが明らかになってきている[16]。腸内微生物叢は、大腸に到達する外因性未消化食物成分（繊維など）の嫌気性発酵から、微生物や宿主によって生成される内因性化合物と同様に、極めて多様な代謝産物レパートリー（短鎖脂肪酸であるプロピオン酸など）を産生する[17]。宿主と微生物の間の粘膜界面を構成する上皮細胞の単層は、微生物代謝産物が宿主細胞にアクセスし、宿主細胞と相互作用することを可能にし、その結果、特に高濃度で免疫応答および疾患リスクに影響を与える[18]。

GBH は、土壌 [19]、植物 [20]、動物 [21、22] の微生物相を変化させることが報告されている。多くの研究では、GBHが哺乳類の腸内マイクロバイオームにおいて抗生物質として作用する可能性が示唆されている。最近の研究では、グリホサートの残留物を含む飼料を給与した場合の農場動物の腸内マイクロバイオームに対するグリホサートの健康影響についての懸念が提起されている。例えば、農場動物を対象とした研究では、乳牛における C.ボツリヌス菌を媒介とする疾患の流行 [23] をグリホセートへの曝露と関連づけている。グリホセートは、通常は家畜の腸内に生息している常在菌の増殖を抑制する効果があることが提案されている。例えば、このような善玉菌の減少は、新興の食中毒として記述されているカンピロバクター感染症（カンピロバクター感染症）の素因となる可能性がある[24]。家禽は、人間へのカンピロバクター感染症の主要なリザーバーであり、感染源である[22]。さらに、GBHは、潜在的な病原体において、複数の抗生物質耐性表現型を誘導することが可能であることも判明した[25]。したがって、GBHは動物およびヒトの微生物相を修飾する可能性があり、その結果、ヒトの健康に影響を与える可能性がある。しかし、これまでのところ、GBHへの曝露とヒトのマイクロバイオームとの間の相互作用を示唆する直接的な証拠は報告されておらず、特に発育初期の間、またはヒトに関連する低用量のGBHに曝露された動物モデルでは報告されていない。健康と疾病の発達起源（DOHaD）パラダイム[26]で示されているように、初期の環境曝露は人間の健康にとって重要である。特に、出生前および新生児期は、健康および疾患に生涯影響を及ぼす可能性のある無数の環境曝露および条件に対する感受性の狭い、しかし重要な窓である。多くのヒトおよび動物を対象とした研究 [27-29] は、いくつかの疾患を初期の腸内細菌叢の不均衡と関連づけているが、GBH、特に環境に関連する用量では、ヒトおよび動物個体群の腸内細菌叢に障害をもたらし、健康に悪影響を及ぼす可能性があることを示す更なる証拠の必要性が最近指摘されている [30]。さらに、幼少期から成人期に至るまでの微生物相に対するGBHの影響を、感受性の異なる窓の中で調査することで、病因に関与する微生物の状態をより正確に描写することができるかもしれない。哺乳類の腸内細菌叢とその代謝物が、胎児期から始まる発育初期の環境中のGBH濃度によって変化する可能性は、これまで対照動物実験では検討されたことがなかった。本パイロット研究では、「安全」と考えられているグリホサート（米国 EPA [31] が定める慢性基準用量（cRfD）として定義した米国 ADI 1.75 mg/kg bw/day）の用量での GBH への曝露が、Sprague Dawley ラットの発育初期段階における腸内マイクロバイオームの組成と多様性に影響を与えるかどうかを検討している。

方法

実験モデル

すべての動物実験は、科学目的のための動物の使用と治療を規制するイタリアの法律による規則に従って実施された（Legislative Decree No.26, 2014. 科学目的で使用される動物の保護に関する指令n.2010/63/EUの実施。- G.U. General Series, n. 61 of March 14th 2014）。) すべての動物試験手順は、Cesare Maltoni Cancer Research Centre/Ramazzini Institute（CMCRC/RI）（イタリア、Bentivoglio）で実施した。

実験計画書は、ラマッツィーニ研究所の倫理委員会によって承認された。実験計画書はまた、イタリア保健省の特別委員会（閣僚承認n.710/2015-PR）によって承認され、正式に承認された。CMCRC/RI動物繁殖施設は、Sprague-Dawley（SD）ラットの供給者であった。雌の繁殖者SDラットをポリカーボネートケージ（42x26x18cm、Tecniplast Buguggiate、Varese、イタリア）に、交尾の証拠が観察されるまで、無関係の雄1匹と個別に入れた。

交尾後、マッチしたメスは妊娠中と出産時に別々に収容された。新生児は離乳するまで母親と一緒に収容された。離乳した子孫は、性別と治療群別に、各ケージごとに3頭以内で共同飼育された。ケージは、研究プロトコルコード、実験および血統番号、投与群を示すカードによって識別された。敷料は、ホワイトモミの木の削りくずの浅い層を使用した（供給者：Giuseppe Bordignon, Treviso, Italy）。

敷料の化学的特性（pH、灰分、乾燥重量、比重量）と汚染の可能性（金属、アフラトキシン、ポリクロロビフェニル、有機リン、有機塩素系農薬）の分析は CONSULAB Laboratories (Treviso, Italy)によって行われました。実験用に用意された一つの部屋の中に、温度22℃±3℃、相対湿度50±20％で、ケージをラックの上に置いた。

温度と湿度のチェックは毎日行った。光は人工的なものを使用し、12 時間の明暗サイクルを維持した。ストレスに関連した飼育要因はコントロールした：ラットは一緒に飼育し（同じ部屋、同じラック、ケージあたり3匹以下）、ケージの再配置は行わなかった。騒音やハンドリング時間は最小限に抑えた [32]。

実験プロトコル

SD 仔ラットと親戚の仔ラットの 2 群を、グリホサート濃度 1.75 mg/kg bw/日で飲料水に希釈したグリホサートまたはラウンドアップのいずれかで処理した。この研究では、合計 24 頭の F0 仔ラット、産後日（PND）7 および PND 14 での全仔ラット、PND 31 および PND 57 での 108 頭の F1 子孫、PND 125 での 60 頭の F1 が存在した。

F0の雌ブリーダーは、妊娠日（GD）6から授乳終了までの間、飲料水を介して処理を受けた。妊娠中および授乳中に、胚および子孫（F1）は、すべて子孫に保持され、主に彼らのダム（F0）を介して試験化合物を受け取る可能性があります。6週齢のコホートに属する動物は、PND 73 ± 2で犠牲にされた：PND 28の離乳後、子孫は、2つのコホートにランダムに分布していた：6週齢のコホートに属する動物は、PND 73 ± 2、すなわち離乳後6週間で、13週齢のコホートに属する動物は、PND 125 ± 2、すなわち離乳後13週間で犠牲にされました。F1 の子孫は、胎内から、主に授乳中の乳汁を介して、彼らのダムから治療を受ける可能性があります。離乳後、子孫（F1）は生け贄に捧げるまで飲料水で処理した。

実験動物の処理と糞便サンプル採取のタイムラインを図 1 に示す。図示されているように、ラットの糞便サンプルは、交尾前、ＧＤ５（処理開始前）、ＧＤ１３、授乳日（ＬＤ）７、およびＬＤ１４において、各群のＦ０世代（８匹のダム）の全動物から個別に収集された。糞便サンプルはまた、PND 7とPND 14（ダムのためのLD 7と14に対応）で授乳中に、PND 31で思春期の達成前に、PND 57で思春期の後、PND 125で成人期に108のF1の仔ラット、各グループから18のオスと18のメスから収集しました。授乳中に個々の仔ラットから糞便サンプルを識別するための技術的な難しさのために、PND 7とPND 14でのみプールされたサンプルは、性別で区別されていない、全体の仔ラットから各ケージのために収集されました。離乳後、各仔ラットからの糞便サンプルを個別に採取した。各動物の肛門から直接採取した約２〜３個の糞を、氷床上のクライオバイアルに保存し、-２０℃で保存した後、マウントサイナイのイカーン医学部にドライアイスで出荷するまで保存した。糞の収集に使用された鉗子は、クロスコンタミネーションを避けるために、各サンプリングの間に滅菌水と1％の重炭酸ナトリウムを使用して洗浄し、洗浄した。

図1　実験動物の処理と糞便サンプル採取のタイムライン

細菌16S PCRとシークエンス

ラットの糞便DNAは、QIAamp PowerFecal DNA Kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、製造者の指示に従って抽出した。全DNA濃度は、Qubit 2.0 Fluorometer (Life technologies, Norwalk, CT)を用いて決定した。16S rRNA遺伝子の系統的に有益なV3-V4領域を、ユニバーサルプライマー347F/803R [33, 34]を用いて、以前に記載されたデュアルバーコーディングアプローチを用いて増幅した[35]。16S PCRアンプリコンの完全性は、アガロースゲル電気泳動によって確認された。結果として得られた〜460bpサイズのアンプリコンをプールし、ニューヨーク大学ランゴーン医療センターのOCSゲノム技術センターにあるIllumina MiSeq 2×250ペアエンドシーケンシングプラットフォームを用いてシーケンシングを行った。

16Sデータの解析

シーケンシングデータをマージしてフィルタリングし、マージされたリードの長さが400bp未満、または1%以上の塩基でQ30未満の品質スコアを持つリードを除去した。順次、フィルタリングされたすべての高品質リードをデュアルバーコードで分割し、自己定義のbashスクリプトを使用して、fastx [36]、QIIME [37、38]、およびseqtk [39]からのいくつかのシーケンシング処理コマンドを統合するためにプライマー領域をトリミングした。4つのサンプルの重複測定を処理し、異なるバーコードを使用してシークエンシングの再現性をテストした。また、5つのブランクサンプルもシークエンシングし、サンプル処理中に環境汚染の可能性をフィルタリングするために参照した。分割された高品質リードは、QIIME 1.9.0 [37]によってさらに処理された。我々は、デフォルトのgreen_gene 97_otus参照配列でコマンドpick_open_reference_otus.pyを使用して、uclust [40]を使用してOTUとして97％以上の類似した配列のリードをクラスター化した。各OTUの代表配列をPyNASTを用いてアラインメントし、系統樹を構築した。最後に、QIIMEで生成されたバイオフォーマットのOTUテーブルには、各サンプルで同定された各分類群の分類学的情報と絶対数が含まれています。

各微生物群集内の多様性、いわゆるα多様性は、指標としてシャノン指数[41]を用いて計算され、ファミリーおよび属レベルでの多様性の尺度を表した。全サンプル間の全体的なマイクロバイオームの非類似度は、重み付きUniFrac距離行列[42]を用いてアクセスした。非計量多次元スケーリング（NMDS）を用いて異相性を可視化した。多変量多変量分散分析PERMANOVA検定[43]は、最大の変量数=999で、収集時期と治療法によるグループ間のマイクロバイオームの全体的な違いの有意性を評価するために実行された。Rパッケージvegan 2.0-5 [44]の[Adonis]関数を使用したPERMANOVA手順は、変動源間の距離行列を分割し、距離行列に線形モデルを適合させ、p値を得るために擬似F比を使用して並べ替え検定を使用しています。LEfSe法[45]を用いて、我々はさらに、様々な分類学的ランクでの収集時間と処理に有意に関連するマイクロバイオーム特徴を選択した。

結果

実験動物のin vivo段階では、予期せぬ臨床徴候や症状は観察されなかった。特に、授乳中（営巣および授乳中）の母体行動の変化の徴候は、実験中に観察されなかった。また、仔ラットの活動性や行動に変化が見られた臨床的証拠はなかった。仔ラットの体重、水量、飼料消費量は群間で差がなかった。仔ラットの数は、対照群 13.6 頭（範囲 10～16）、グリホサート群 13.3 頭（範囲 11～17）、ラウンドアップ群 13.9 頭（範囲 11～16）と群間で完全に同程度であった。

433のSDラット糞便サンプルから総DNAを抽出する。図1に図示したタイムラインに従って、3つの処置群および5つの時点(交尾前、GD5、GD13、LD7およびLD14)で、24匹のF0仔ラットから120個の糞便サンプルを収集した。F1仔からは、PND7で13、PND14で24、PND31とPND57で各108、PND125で60の合計313の糞便サンプルを採取した。その結果、PND7とPND14の仔ラットの糞便サンプルでは、DNA収率が有意に低いことが確認された（追加ファイル1：図S1A）。我々はさらに、433 SDラット糞便サンプルと5つの水ブランクについて、Illumina MiSeq 2 × 250ペアエンドプラットフォーム上で細菌の16Sシーケンスを使用してマイクロバイオーム調査を行った。99%以上の塩基でリード長＞400bp、品質スコア＞Q30でマージ、フィルタリングを行った結果、200万個程度の高品質リードが得られた（1サンプルあたりの平均リード数＝4576、標準偏差＝6567）。リード数は曝露の種類によって有意な差はなかった（追加ファイル１：図S1A）。分類群の組成を年齢と曝露タイプ別にグループ化し、追加ファイル１にまとめた。図S1Bにまとめた。また、追加ファイル２に完全な分類学的OTU表を提供した。

β多様性によって定義される全体的なマイクロバイオームの不斉性は、全サンプル（図2a）、ダムのみ（図2b）2b、および仔ラットのみ（図2c）2cのノンパラメトリック多次元スケーリング（NMDS）プロットによって可視化された。ＰＮＤ７およびＰＮＤ１４の初期の産後サンプルは、ＬＤ７およびＬＤ１４のダムから離れているのに対し、ＰＮＤ３１、ＰＮＤ５７およびＰＮＤ１２５の後期の産後サンプルは、ダムとクラスタリングしていることがわかった（図（図２ａ）.2a）。シャノンインデックスを用いて測定した群内多様性（α多様性）の平均値と分散を見ると、ダムからのサンプルではα多様性が高いのに対し、仔ラットからのサンプルではα多様性が低いことがわかった（図2d）。スチューデントt検定では、PND14からPND31まではα多様性が有意に増加していた（p値<0.05）が、同年齢でも異なる群間では差がなかった。

図2
全体的なマイクロバイオームの多様性。a, b, cは、個々のラット間の全体的なマイクロバイオームの不均一性（β多様性）を時間的に可視化した非メトリック次元スケーリング（NMDS）プロットである。色はサンプル採取のタイムポイントを示す。BM：交尾前、GD5：妊娠5日目、GD13：妊娠13日目、LD7：授乳7日目、LD14：授乳14日目。色はサンプル採取のタイムポイントを示す。PND 7からPND 125：産後7日目から産後125日目まで。 d ボックスプロットは、3つの治療群におけるシャノン指数によって測定された群内多様性（アルファ多様性）の平均と分散をすべての収集時間にわたって示す。

仔ラットと仔ラットの異なる年齢群での処理によるマイクロバイオームの全体的な変化を比較した。非メトリック多次元スケーリング（NMDS）プロットは、PND 31および57における治療法別の全体的なマイクロバイオームの不均一性を可視化した（図3a）。PERMANOVA検定を各年齢群で使用して、ラット腸内マイクロバイオーム全体における治療と対照との差の有意性を検定した。検定結果（図３ｂ）３ｂ）は、ラウンドアップ処理とグリホサート処理の両方により、対照と比較して全体的なマイクロバイオームが有意に変化していることを示した。同様に、ラウンドアップ処理とグリホサート処理に曝露されたF1仔ラットの間でも、マイクロバイオームに有意な差が認められた。また、PND 125において、全体的なマイクロバイオームが性によって有意に異なることが観察された（グリホサート群、ラウンドアップ群、対照群について、それぞれPERMANOVA検定によるp値=0.028、0.007、0.013）。性差効果を調整するために、治療法と性差の両方を予測変数として追加の多変量PERMANOVA検定を行った。それらの検定結果が一貫していることがわかった（図３ｂ）。しかし、F0ダムグループのいずれも、全体的な微生物相の多様性に有意な差を示しませんでした。

図3

a NMDSプロットは、PND 31とPND 57における3つの治療法の個々のラット間の全体的なマイクロバイオームの非類似性（β-多様性）を可視化したものである。 b PERMANOVA検定は、3つの治療法すべての間（NMDSプロットに表示）と2つの治療法の間の有意性を検定するために実行される（値は表に記載されている）。括弧内の p 値は，性別について調整した。G: グリホサート; R: ラウンドアップ; C: コントロール水

ラット糞便サンプルの 16S 配列データを用いて線形判別分析効果量（LEfSe）解析を行い、グリホサート曝露の特定の判別特徴を選択した。異なる年齢群における曝露による全体的なマイクロバイオームの変化（図3）,3）と一致して、曝露に関連したいくつかの有意差のある分類群の特徴が見出された。特に、PND31では、グリホサートとラウンドアップの両方に曝露された仔ラットのマイクロバイオームは、Prevotella属（Bacteroidetes属）とMucispirillum属（Deferribacteres属）の有病率が有意に高く、Lactobacillus属（Firmicutes属）とAggregatibacter属（Proteobacteria属）の有病率が低いことが示された（図4a-1-2）。しかし、選択された特徴の中には、治療法に特異的なものもあった。例えば、LDAスコアが3.0以上、p値が0.05以下の最も有意な特徴のうち、Blautia属（Firmicutes属）が増加し、Streptococcus属（Firmicutes属）とRothia属（Actinobacteria属）が減少したのは、グリホサート処理したPND 31頭のみであったが、ラウンドアップ処理したサンプルでは増加しなかった。一方、Parabacteroides属（Bacteroidetes属）とVeillonella属（Firmicutes属）の増加は、Roundup曝露したPND 31の仔ラットでのみ認められたが、グリホサート曝露したサンプルでは認められなかった。2回の曝露の間に（図4a4a3）、ラウンドアップ曝露した仔ラットは、PND 31において、クロストリジア属（Firmicutes属）、特にBlautia属とアクチノバクテリウム属（Actinobacteria属）、特にRothia属とBifidobacterium属の増加を示した。さらに、治療に関連した分類群の特徴は、産後の異なる時点で一貫していないことがわかった。PND31で選択された多くの特徴は、PND57では出現しなかった（図4a4a4a4-6、追加ファイル3：図S2）。これは、早生期の微生物相の安定性が低いことと、曝露による腸内微生物相への継続的な影響を示唆していると考えられる。また、有意な差のある分類群の総量％を治療法別にカウントすると、仔ラットはダムよりもはるかに高い暴露による影響を示した（図４ｂ４ｂ）。

図4
ａクラッドプロットは、ＰＮＤ３１とＰＮＤ５７での菌種（内丸）から属（外丸）への有意な差のある分類群の特徴を可視化したもので、色は各条件でより豊富な分類群を示す。色は、各条件の下でより豊富な分類群を示す。 b 表は、時間をまたいで治療の間の有意な差のある分類群の全体的な豊富さをリストアップしています。

議論

GBH は世界中で最も多く使用されている除草剤である。人間は一般的に、作業環境（農業と食品消費）や曝露経路（摂取と吸入）に応じて、幅広い用量でこれらの環境化学物質に曝露される。GBH による環境汚染は現在ではいたるところで見られるようになり、グリホサートの残留物が大気 [46]、地下水 [47]、飲料水 [48]、作物 [49]、食品 [50]、動物飼料 [51] から発見されている。ヒトの健康に及ぼすGBHの影響は、内分泌かく乱作用[52, 53]、神経毒性[54]、発生および生殖毒性[55]を含む、発がん性と非発がん性の両方の潜在的な影響のために、一般の人々の間で激しい議論の対象となっている。自己免疫[56]、消化管障害[57]、肥満、糖尿病[58-60]、その他の代謝性および心血管障害[61]、および学習・記憶障害、不安、ストレス、うつ病[62]および自閉症[63]などの中枢神経系の機能障害。これらの慢性疾患（非伝染性疾患-NCD）は、リスク評価時に考慮される線量よりもはるかに低い線量であっても、特に生命の敏感な時期（胎児の発育など）に発生する可能性がある [7, 22]。

ヒトのマイクロバイオーム研究における最近の進歩は、腸内マイクロバイオームがヒトの代謝において重要な役割を果たしていることを示唆している[64-66]。したがって、環境化学物質への曝露が腸内マイクロバイオームとその代謝物を変化させ、最終的にはヒトの健康に影響を及ぼす可能性があるという仮説は妥当である。微生物学的に生成された代謝物およびその細胞・分子成分は、宿主生物の恒常性に深く影響し、ヒトの生理機能に不可欠なものとして認識されるようになってきている。残念なことに、標的細胞内のこれらの生物学的活性物質の濃度を測定することは、サンプル、特に糞便材料の抽出と処理、および現在利用可能な測定技術の限界に関連して、深刻な問題を抱えている[15]。メタオミクスと進化する計算フレームワークは、神経内分泌系、免疫系、代謝系、エピジェネティック経路に関与するより多くの微生物代謝物や成分を体系的に予測し、発見することにつながると期待されている。

ラットはマウスよりもヒトの腸内細菌叢を代表する動物であると提案されている。我々は以前、我々の動物モデルであるSDラットを用いて、産後の環境化学物質への低用量曝露が感受性の窓および腸内マイクロバイオームに及ぼす影響を研究した。その研究[69]では、低レベルのフタル酸塩、パラベンおよびトリクロサンへの暴露が思春期ラットの腸内マイクロバイオームを変化させることが示された。これらの結果は他の研究と一致しており、我々の動物モデルがマイクロバイオーム研究に適したモデルであることを示している[70, 71]。

グリホサートは植物や微生物において酵素阻害活性を示していることから、グリホサートや GBH への低用量曝露もまた腸内マイクロバイオームの組成を調節する可能性があると推測される。本研究では、成体ラットの仔ラットと比較した場合、PND 7 および 14 における仔ラットの腸内マイクロバイオームは、分類学的な豊かさは低いが、サンプル内での分散が高く、サンプル間の不斉性が高いことが示された [69]。我々の研究の 1 つの落とし穴は、乳中の GBH への曝露の直接測定が行われていないことであった [72]。我々のパイロット研究では、我々は単に人間の曝露を再現しただけで、出生から PND 21 付近までの仔ラットの栄養源としての授乳期を含む。母乳中のグリホサートの分析に関する欠点は、主に母乳中のグリホサートの分析の難しさとストレスを伴う技術的な手順、および母乳マトリックスの複雑な性質に関連している。実際、母乳は炭水化物、タンパク質、脂肪の水性混合物である。水性マトリックスのために開発された分析法は、母乳に直接移植することはできません。2014年4月には、アメリカ人母親の母乳中のグリホサートが76～166 ng/mLの範囲の10サンプル中3サンプルで検出されたという非査読報告が発表されました。この研究では、乳試料中のグリホサート濃度を酵素結合免疫吸着法（ELISA）で測定した [73]。このアッセイの定量限界（LOQ）は乳中 75 μg/L とした。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）とガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析法（GC-MS/MS）に基づく他の研究では、グリホサートが乳汁中に移行したという証拠は見出されていない。どちらの方法も完全に検証されており、LOQ が 1 ng/mL のグリホサートの定量に適していると報告されている [72, 74]。とはいえ、教育や民族的背景の違い、居住地の場所（例：農村部と都市部の比較）、職業や食事中のグリホセートへの曝露、コホートの適切なサンプルサイズを考慮した上で、将来の独立した研究が必要である。

我々の結果は、子供および妊婦を含むヒトに認められた用量でのグリホサートおよびグリホサート製剤ラウンドアップの両方が、微生物相の多様性を有意に変化させ、曝露された仔ラットの複数のタクソンにおける顕著な変化をもたらしたことを明らかにした。しかし、マイクロバイオータに対するそれらの影響は成ラットでは有意ではなかった。これまでのエビデンスでは、出生後年齢における腸内細菌叢は成人年齢よりも安定性が低く、生後数年間で変化することが示されている[75]。腸内細菌叢の成熟は、複数の要因、例えば、食事、薬剤、宿主遺伝などによって影響を受けることが証明されている。[76]. 低用量の様々な環境化学物質による腸内細菌叢の成熟期の破壊は、体重、代謝、その他の疾患リスクなどの宿主表現型を変化させることが示されている[77]。我々のデータは、思春期前のマイクロバイオータは成人のマイクロバイオータと比較して GBH への曝露に対してより敏感であることを示唆している。

さらに、我々の結果は、全体的なマイクロバイオームの多様性と組成がラウンドアップとグリホサートの間で有意に異なることを示しており、腸内マイクロバイオームに対する混合製剤の相乗効果の可能性を示唆している。GBHのほとんどは複数の界面活性剤を含んでおり、アジュバントはグリホサート単独とは異なる作用をする可能性があるため、グリホサートの個々の効果だけでなく、混合製剤の相乗効果を理解することも重要である。実際、アジュバントは単独または相乗的に作用し、グリホサートの毒性効果を高める可能性がある [78-81]。

さらに、臨床研究と実験研究の両方で、腸内細菌叢が腸-脳軸（主に免疫、神経内分泌、神経経路を含む）に及ぼす影響が年齢に依存して示されている [82-84] [85]。マイクロバイオータ-腸-脳軸を介して宿主とコミュニケーションをとる腸内細菌は、脳や行動に影響を与える可能性がある[86]。特に、出生後の微生物叢の変化は、ACTH [83、87]、コルチゾール、BNDF [88]などを含む下垂体ホルモンのレベルの変化を反映して、神経系に影響を与える可能性がある。Sprague Dawleyラットは、マウスのマイクロバイオームプロファイルよりもヒトのマイクロバイオームプロファイルに近いため、これらの早期生活への影響を調べるのに最適な動物モデルである[67]。

この研究にはいくつかの限界がある。第一に、妊娠中または子孫による出生後のミルク消費を介して胎児に達したGBHの実際のレベルを正確に推定することはできません。第二に、我々は唯一の母親の糞便を収集したので、我々は完全に経口、膣や他の体の部位から母親のサンプル/データの収集なしで胎児の発達における母親の微生物相の役割を評価することはできません。確かに、近年では、母乳以外にも、他のソースは、母子の微生物の転送を可能にする可能性があることが明らかになってきている。げっ歯類は、人間を含むすべての胎盤哺乳類に似たような方法で彼らのマイクロバイオームを “継承”：新生児期（垂直伝送）を通して膣出産と密接な母体の関連付けを介して。母体の膣、皮膚、乳腺糞便および口腔マイクロバイオーム、寝具中の微生物拡散は、効率的に子孫に伝達され、仔ラットの腸内植民地化に対する母体の影響の他の可能性のあるメカニズムを表しています[89]。最後に、マイクロバイオーム調査では、費用対効果の高い16Sアンプリコン標的配列決定法を用いた。この手法により、属レベルでの暴露のみで、異なる分類群の組成を同定することが可能となった。追加のメタゲノム解析およびメタトランスクリプトーム解析は、機能的および代謝的交互性を可視化し、種／株レベルでの細菌の特徴を特定するために必要となるかもしれない。さらに、ラットとヒトのマイクロバイオームの分類学的構成の違いを考えると、この解析結果がヒトにどの程度関連しているかは明らかではない。今後の研究では、曝露の経路や濃度がラットのマイクロバイオームにどのような影響を与えるかを調査し、これらの擾乱がその後の健康状態にどのような影響を与えるかを定量化する必要がある。とはいえ、これらのデータは、GBHへの曝露が発生初期に生物学的影響を及ぼす可能性があることを強く示唆しており、その影響は後の人生で長期的な健康影響をもたらす可能性があります。

結論

我々のパイロット研究は、現在ヒトで許容可能と考えられている用量で、一般的に使用されているGBHへの母親の曝露は、特に思春期前（PND 31）に、ラットの仔ラットの腸内細菌叢を変更することが可能であることを示す最初の証拠を提供します。GBHへの曝露によって誘導される腸内細菌叢の変化が、下流の他の健康影響に寄与しているかどうかを明らかにするためには、さらなる長期的な調査が必要である。それにもかかわらず、この重要な影響を受けやすい時期の微生物相の変化を理解することは、疾病予防にとって非常に重要である。小児期などの発育期におけるGBHの潜在的な健康影響については、さらなる調査が必要である。