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pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19285882/
Issues associated with residual cell-substrate DNA in viral vaccines
バイオロジカルズ 37 (2009) 190e195
www.elsevier.com/locate/biologicals
リー・シェン-ファウラー、アンドリュー・M・ルイス・ジュニア、キース・ペデン*（Li Sheng-Fowler, Andrew M. Lewis Jr.
米国食品医薬品局生物製剤評価研究センターワクチン研究審査室ウイルス製品部門、ベセスダ、メリーランド州20892、アメリカ
2009年2月2日受領 2009年2月2日受理
注:以下、強調（グレー）箇所は、ケビン・マッカーナン氏のブログを参照している。
要旨
ウイルスワクチンには、製造細胞基質に由来する細胞DNAが残存していることが避けられない。このDNAが安全性の懸念となるかどうか、特に細胞基質が腫瘍に由来する場合、あるいは腫瘍原性である場合は、不明だ。
DNAには、考慮すべき2つの生物学的活性がある。第一に、DNAはがん化する可能性があり、第二に、DNAは感染する可能性がある。
ウイルスワクチンに残存する細胞基質DNAのリスクを評価する研究の一環として、私たちはDNAの生物学的活性を定量化できるアッセイを確立した。これらのアッセイで得られたデータから、DNAによる発がん性または感染性のリスクを推定している。これらの推定値は、これまでに確認された最も感度の高いアッセイから得られたものであるため、最悪のケースを想定したものである可能性が高い。さらに、DNAの生物学的活性を不活性化する方法を評価し、これらの処理によるリスク低減の推定を行うことができる。
本論文では、ウイルスワクチンにおける腫瘍細胞基質からの残存細胞DNAに関連する潜在的な安全性の問題に対処するためのアプローチについて述べ、DNAの発がん性および感染性活性を定量化するアッセイの開発について要約し、DNAの生物活性を低減する方法について説明する。国際生物学会の委託により、Elsevier Ltdが発行した。
キーワード 発がん性DNA; 感染性DNA; リスク評価
1. はじめに：DNAに関連する潜在的な懸念
米国で認可されているウイルスワクチンの製造に使用されてきた様々な細胞基質は、鳥類やサル由来の初代細胞、二倍体細胞株（以前は二倍体細胞株と呼ばれていた。[1]）WI-38、MRC-5、FRhL-2、および連続細胞株VERO株（アフリカミドリザル腎細胞由来） [2]に限られている。これらの細胞基質により、安全性と有効性が証明されたワクチンが製造されていたが、HIV/AIDS、新興感染症（例：SARS）、バイオテロリズムの原因物質に対するワクチンなど、次世代のウイルスワクチンの製造にはこのレパートリーでは不十分であることが明らかになりつつある。さらに、H5N1型鳥インフルエンザウイルスのように、卵で高力価まで増殖できない、あるいは鶏に対して病原性を持つインフルエンザウイルスによるパンデミックインフルエンザの発生の可能性もあり、マディンダービー犬腎細胞株など、インフルエンザワクチン用の細胞基質が追加評価されるようになった。[3e5]。これまでのところ、ウイルスワクチン製造のために評価されている新しい哺乳類細胞基質の多くは、様々なメカニズムで不死化されているため腫瘍性であると考えられており、中には腫瘍原性を持つものもある。製造細胞基質に由来する成分がワクチン接種者にがんを誘発する恐れがあるため、1954年に軍隊疫学委員会がヒト用ワクチンの製造に腫瘍性細胞やヒト腫瘍由来の細胞を使用しないよう勧告した理由の一つである[6,7]。この勧告が40年以上続いたのは、この懸念を科学的に評価することができなかったことが少なくとも一因であり、その理由は、第一に危険因子を特定できなかったこと、第二に、危険因子が特定された後、これらの因子がもたらすリスクを定量化できる測定法がなかったことである。
この原稿は、ウイルスワクチン製造のための新規高腫瘍性新生物細胞の使用に関連する潜在的なリスクについて論じており、他のタイプの細胞基質や製品に関する議論は、その範囲を超えていることを指摘しておく必要がある。
2. 細胞DNAのリスクを判断するためのアプローチ
リスク評価に対する私たちの一般的なアプローチは、Defined Risks Approach (DRA)として説明されている[8]。CBERがDRAのために提案したアルゴリズムは、5つのステップから構成されている。1. 想定されるリスク事象の特定 2. リスク事象が自然界や実験条件下で発生する可能性がある、あるいは発生が確認されている頻度の推定または決定 3. ワクチン用量あたりのリスク事象の発生頻度の推定 4. リスク事象を検出するために使用できる1つ以上のアッセイの感度（リスク事象を検出するアッセイの能力の限界に関して）の開発および決定 5. 製品固有の安全係数を定められたレベルに設定するために使用できる、または安全係数/限界を設定するために現在の技術を使用できるレベルを決定するための1つ以上のプロセスの開発およびバリデーション。[許容される安全係数は、リスク事象の深刻さによって異なる。腫瘍性の高い細胞で作られたウイルスワクチンの評価において、米国FDAのワクチンおよび関連生物学的製剤諮問委員会（VRBPAC）は、残存する細胞性DNAに関して10^7分の1未満の実証リスクを許容できると判断している。]
高度に腫瘍化した細胞からの細胞基質DNAのリスクを評価するための私たちのアプローチは以下の通りである。1. DNAの生物学的活性を測定するための高感度かつ定量的なアッセイを開発する。2. 最も感度の高いアッセイのデータを用いて、特定の事象のリスクを推定する。したがって、リスクの推定値は最悪の状況を表すものであるため、保守的となる。3. 特定の処理（ヌクレアーゼ消化、化学的不活性化など）による生物活性の低下量を定量化するためのアッセイを使用する。4. これらのデータを用いて、製品中に残存する細胞基質DNAに関する製品の安全係数を推定する。
3. DNAの生物学的活性
DNAには、いくつかの測定可能な生物学的活性がある。その中には、発がん性活性や感染性活性が含まれる。細胞基質の問題とは関係ないが、DNAは細菌や真菌の系でも形質転換活性を持つことがある。上記のDNAの活性は、遺伝子発現に由来する産物（タンパク質、マイクロRNA）を介して行われるが、遺伝子発現を必要としないDNAの別の生物活性として、DNA自体の免疫調節活性がある[9,10]。この免疫調節活性は生体内試験で測定することができるが、この効果に必要な量のDNAは、通常、ワクチンには含まれていない。したがって、現在の認識では、ワクチンの安全性を考慮する必要があるDNAの生物活性は、発がん性活性と感染性活性である。
4. DNAの発がん性活性
細胞ゲノムにがん遺伝子が同定され[11,12]、活性化した細胞がん遺伝子が試験管内試験で初代細胞を腫瘍化することができ[13e15]、これらの腫瘍化した細胞の一部が生体内試験で腫瘍を形成することができることが示され[13,16]、ワクチンからレシピエントにがん誘発物質が移行するという懸念が科学的に根拠あるメカニズムの1つとして明らかになった、すなわち、活性化がん遺伝子発現可能DNAを介してというもの。
宿主のゲノムに組み込まれるウイルスとの類似性から、DNAによる発癌の第二のメカニズムが提案されている、すなわち、DNAの統合によってである。DNAの統合が発癌につながる可能性はいくつかある。もしDNAがc-mycのような支配的ながん原遺伝子の隣で統合され、その発現レベルが上昇したり、その発現が不適切に活性化されたりすると、正常な細胞ががん原性の表現型を持つ細胞へと変化することになる。また、p53遺伝子やRB遺伝子のような癌抑制遺伝子にDNAが組み込まれ、その遺伝子が機能的に不活性化された場合、この細胞は時間の経過とともに、もう一方の対立遺伝子に不活性化変異を追加してヘテロ接合性の喪失により腫瘍化する可能性がある。このようなメカニズムは、鳥類と哺乳類の両方のシステムで、レトロウイルス感染後に見られる。例えば、ニワトリの鳥類白血病ウイルス感染[17]やマウスのモロニーマウス白血病ウイルス感染[18,19]では、白血病を引き起こす癌原遺伝子の活性化が観察され、レトロウイルス挿入により癌抑制遺伝子p53が不活性化することがある[20,21]。
したがって、レトロウイルスのプロウイルスゲノムを組み込むと、明らかに発がん性の事象を引き起こす可能性がある。しかし、問題は、外来性DNAの統合の頻度が、懸念されるほど高いかどうかである。細胞DNAは配列が不均一でゲノムが複雑なため、この問題に実験的に答えるのは容易ではないが、ゲノムがそれほど複雑でないDNAワクチンを用いた研究から得られたデータは、外因性DNAの統合は極めて低い頻度の事象であり[22]、したがって特定の部位での統合の頻度はそれに応じて低くなることを示している。細胞の癌遺伝子を活性化するような部位にDNAが組み込まれる確率は約10-10,1つの細胞で癌抑制遺伝子の対立遺伝子を両方とも不活性化するような2つの独立した事象は10-19と推定されている[24,25]。
DNAの統合に関する第二の考察は、腫瘍性細胞からのDNAが正常な二倍体細胞のDNAよりも懸念されるかどうかである。なぜなら、二つの細胞タイプの間の配列の違いはわずかであり、DNAとの統合は部位特異的ではなく、不正な組換えによって起こるからである[26e31]。そのため、統合の観点から見たDNAのリスクは、そのDNAが由来する細胞の表現型にかかわらず、すべての細胞性DNAについて同様であるべきである。ミリグラム単位のDNAワクチンが臨床評価のために承認されていることから、ウイルスワクチンに含まれる少量の残存細胞基質DNAが、統合による重大なリスクをもたらすとは考えにくい[32]。
結論として、DNAに関する主な発がん性の懸念は、支配的に活性化されたがん遺伝子の導入によるものであると考えられる。
5. DNAの感染性活性
潜在的な安全性の問題として対処する必要がある、腫瘍細胞基質からのDNAの第二の活性は、その感染活性である[8,33]。この活性は、細胞DNAに感染性ウイルスゲノムが統合または染色体外に存在する可能性があるために発生する。これらのゲノムは、DNAウイルスやレトロウイルスのプロウイルス（外来性または内因性）のものである可能性があります、ポリオーマウイルス[34e37]、パピローマウイルス[38e42]、アデノウイルス[43e46]、ヘルペスウイルス[47e52]、パルボウイルス[53e58]、レトロウイルス[59e65]、あるいはポリオーマウイルス[66]、パピローマウイルス[67，68]、レトロウイルス[69e75]など生体内でも、多くのウイルスゲノムが感染性を有しているからだ。(レトロウイルスDNAに関する主な懸念は、外因性のレトロウイルスの存在によるものであろう（すべてのヒト細胞は内因性のレトロウイルスを持ち、現在までに感染性を示すものはないため）。したがって、DNAの感染活性によるリスクは、残存する細胞基質DNAが感染性ウイルスゲノムをコードし、接種されると、トランスフェクトされた細胞内で感染性ウイルスを産生する場合に生じるであろう。このウイルスがヒトに感染した場合、その結末は予測不可能である。このような理由から、DNAの感染活性は、発がん活性よりも危険性が高いと考えられる。感染性細胞DNAが懸念される最も明白なケースは、感染性、複製能力、病原性HIVから不活化ヒト免疫不全ウイルス（HIV）ワクチンを製造する場合であろう。ウイルスの不活性化をモニターし、不活性化の程度を定量化する一方で、感染性プロウイルスを含む細胞性DNAの生物活性にも対処する必要がある。
6. 生体内におけるDNAのがん化活性を評価するアッセイの開発
ワクチン中に残存する細胞性DNAがもたらすリスクについては、リスクなしとする意見から重要なリスクファクターとする意見まで様々であるため[76e78]、また、生体内試験でのDNA発がん性の測定を試みた研究は少なく、データがほとんどなかったため、DNAによる発がんイベントのリスクを推定できるモデルを確立すべく、動物システムで細胞性がん遺伝子のがん化活性を調査することに着手した。私たちは、ヒトの活性化T24 H-ras遺伝子とネズミのc-myc遺伝子の発現プラスミドを作成した。最初の研究で、これらのプラスミドを一緒に注射すると、生体内試験で発がん性があることが示された。NIHスイスマウスはC57BL/6よりも発がん性の損傷に対して敏感であり、新生マウスは成体マウスよりも敏感だった。腫瘍誘導には両方の癌遺伝子が必要であり、腫瘍は使用したDNAの量が最も多い場合（各プラスミド12.5mg）にのみ誘導された[79]。このように腫瘍誘導の効率が低いと、実用的なアッセイを確立することができないため、この効率を高める方法を探した。最初のアプローチでは、両方の癌遺伝子（ヒト活性化T24 H-ras遺伝子とマウスcmyc遺伝子）を同一分子上に配置し、これによって1つの細胞が両方の癌遺伝子を取り込むことを容易にすると考えた。第二のアプローチとして、DNA誘導による腫瘍形成に対する感受性を免疫能の高いマウス系統と免疫能の低いマウス系統で評価した。その結果、生まれたばかりのNIHスイスマウスよりも、がん原性障害に敏感な系統をいくつか同定した。現在、ras/myc二重発現プラスミドの量が1ngまでであれば、マウスに腫瘍を誘発することができるというデータがある（原稿準備中）。このレベルのDNAでは、10 ngの残存細胞基質DNAから発生する発がん性事象に対する安全マージンは、2.5 108から2.5 10^9（私たちの以前のデータ [79] から推定）の間から10^4から10^5の間に減少することになる。これらの試算は、哺乳類ゲノムのハプロイドゲノムサイズを3 10^9塩基対、がん遺伝子のサイズを3000から30000塩基対と仮定している。この修正計算は、両方のがん遺伝子を発現するプラスミドを用いた結果に基づいているが、これには2つの理由があると思われる。第一に、私たちのアプローチは、最も感度の高いアッセイシステムに基づいて推定を行うことである。そして第二に、私たち（未発表の結果）および他の研究者 [80] は、単一の癌遺伝子がマウスに腫瘍を誘発することを発見した。これらの発がん性事象に対する安全係数の低い推定値は 2005年に米国FDAワクチンおよび関連生物製品諮問委員会（VRBPAC）が腫瘍性細胞基質からの残留DNAに関して適切とみなした安全係数10^7に達していない（記録を参照： www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/ 05/transcripts/2005-4188t1.pdf）. 安全係数10^7を達成するために、ヌクレアーゼ消化や化学的不活性化など、DNAの活性を低下させる方法をワクチン製造に取り入れることができる。
7. DNAの感染活性を試験管内試験で評価するためのアッセイの開発
上記のように、ワクチン細胞基質に感染性ウイルスのゲノムが統合または染色体外に存在する場合、特に病原性感染性ウイルスから製造された弱毒生ウイルスワクチンや不活化ウイルスワクチンでは安全性の問題になる可能性がある。どの程度のDNAが感染リスクとなるかを判断するために、私たちは、様々な種類のウイルスのDNAの試験管内試験における特異的な感染性を確認するための研究を実施した。まず、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のプロウイルスDNAについて、プラスミド感染クローンとして、また細胞ゲノムに組み込まれた同ウイルスの特異的感染性を確認した。HIV-1プロウイルスDNAの感染力を検出・定量化できる試験管内試験トランスフェクション／共培養システムを開発した。この共培養システムでは、1pgのHIV-1クローン[81]とHIV-1感染細胞から調製した2mgの細胞DNAの感染性を検出できる（Sheng-Fowlerら、提出原稿）。
HIV-1 DNAの特異的感染力から、2倍体の哺乳類ゲノム（6 10^9塩基対）とHIV-1ゲノム（10,000塩基対）の大きさを知ると、1 pgのウイルスDNAに対応し感染をもたらす細胞あたりの単一のプロウイルスを含む細胞DNAの量を次のように推定することができる： 1 pg O (10^4 O 6 × 10^9)、つまり6 10^5 pg、600 ngに相当する。したがって、製品に残存する細胞基質DNAの量が10ngである場合、感染性ウイルスゲノムを含む細胞DNAの感染事象に関する安全係数は600ng O10ng、すなわち60である。もし、細胞が1つ以上のウイルスゲノムを含んでいる場合、この安全係数はそれに応じて減少する。上記のように、細胞基質DNAに関しては、10^7の安全率が適切とされており、60以下の安全率では不十分であると考えられる。10^7の安全率を得るためには、細胞基質DNAを10ng以下にするか、ヌクレアーゼ消化や化学的不活性化によりDNAの生物活性を低下させる必要がある。レトロウイルスDNAが1コピーしか存在しないと仮定すると、残存する細胞基質DNAの量は10fg以下である必要がある。しかし、感染性ウイルスゲノムのコピーが100個あった場合、DNAの量は100agに減らす必要がある。最も丈夫なウイルスワクチンであっても、残留細胞基質DNAをこのレベルまで減少させることは、現実的ではなく、文書化することも困難であろう。したがって、特定の細胞基質については、DNAの追加処理を行うことが推奨されるかもしれない。
8. DNAの生物学的活性を低下させる方法
DNAの生物学的活性を低下させる方法として、ヌクレアーゼ消化、化学的不活性化、照射の3つの一般的なアプローチがある。生ウイルスワクチンでは、ヌクレアーゼ消化が唯一の方法だが、不活化ウイルスワクチン、サブユニットワクチン、精製タンパク質では、3つのアプローチすべてが単独または組み合わせて使用されていた。これらの処理によるDNAの生物活性の不活性化量を定量化した研究は、私たちの知る限りでは存在しない。
私たちは、試験管内試験感染性アッセイの感度とダイナミックレンジの高さから、このアッセイを用いて、ヌクレアーゼ消化とb-プロピオラクトン（BPL）処理による生物活性の低下を定量化した。その結果、ヌクレアーゼ消化またはBPL処理のいずれかが、DNAの感染性を10^5倍以上低下させることが示された（Sheng-Fowlerら、投稿）。現在、ウイルスワクチンの不活性化にも使用され、DNAの生物活性も不活性化する試薬であるホルムアルデヒドとバイナリーエチレンイミンによって得られるDNAの生物活性の低下を定量化することを目的としている。
9. 結語
DNAの発がん性と感染性に関する研究により、感度の高い生体内試験や試験管内試験のシステムで両活性が検出されるレベルは、これまで実証されてきたよりも低いことが判明した。従って、残存する細胞基質DNAに関連する潜在的なリスクに関して、両者を考慮する必要がある。がん原性および感染性活性は感度の高いアッセイから得られたものであり、クロマチンは裸のDNAよりも取り込まれ発現する効率が低いなどの他の要因は考慮されていないため、推定された安全係数は保守的で、最悪のケースを表している可能性が高い。しかし、DNAの発がん性や感染性の安全係数は、DNAの量だけを考慮すると10^7に達しないため、高腫瘍原性細胞やヒト腫瘍由来の細胞などの新規腫瘍細胞基質をウイルスワクチン製造に使用する場合は、ワクチンに応じてDNAをヌクレアーゼや薬品で処理することが推奨されるかもしれない。
最後に、細胞基質に関連するリスクに関するすべての決定は、製品の種類と製造工程が提供する純度、および意図する集団に対するその製品の利点の両方でバランスをとる必要がある。
謝辞
本論文にまとめた作業は、National Vaccine Program OfficeおよびCBER/FDAとの省庁間協定によるNational Institute of Allergy and Infectious DiseasesのDivision of Microbiology and Infectious Diseasesの契約による支援である。Phil Krause、Hana Golding、Jerry Weir、Arifa Khan、Robin Levisには、原稿に対するコメントをもらった。
GPT-4による要約
要約：
ウイルスワクチンの製造過程では、製造に使用される細胞基質由来のDNAの残存が避けられない。特に細胞基質が腫瘍由来の場合、その安全性が注目されている。DNAは発がん性および感染性の活性を持つため、そのリスク評価が必要とされる。最近の研究では、DNAの生物活性を定量的に評価するための高感度アッセイの開発や、その活性を低減する方法についても検討されている。米国では、ワクチンの安全性評価に関して、DNAの残存リスクについて10^7分の1未満の許容リスクを基準としている。
考察：
- 安全性の懸念: 細胞基質由来のDNAの残存はウイルスワクチンの製造において避けられない現象だが、その残存DNAが安全性のリスクを引き起こすかどうかが大きな懸念となっている。特に、腫瘍性の高い細胞由来のDNAに関する懸念が指摘されている。
- リスク評価: 細胞DNAの残存に関するリスクを評価するためのアプローチが提案されている。このアプローチは、DNAの生物活性を高感度に測定するためのアッセイの開発、リスクの推定、および生物活性の低下方法の評価を含む。
- 今後の課題: 現在の技術では、ワクチンの安全性を確保するために、残存するDNAの量や活性を低減する方法が模索されている。しかし、これらのアプローチがどれだけ実用的で、どの程度の効果を持つのかについては、さらなる研究と実験が必要である。
総じて、ウイルスワクチンの製造に関連する細胞基質DNAの残存問題は、ワクチンの安全性を確保するための重要な課題となっている。適切なリスク評価とそのリスクを最小化するためのアプローチの確立は、今後の研究の方向性として注目されるであろう。
4. DNAの発がん性活性
- 細胞のゲノムにはがん遺伝子があり、これらの遺伝子が活性化すると細胞が腫瘍化することが知られている。
- DNAが癌原遺伝子や癌抑制遺伝子に統合することによって、細胞ががん化する可能性がある。
- レトロウイルスがゲノムに組み込まれると、発がん性が高まることが示されている。
- しかし、外来性DNAが統合する頻度は非常に低いとされ、リスクは相対的に低いと考えられる。
- 結論として、主なリスクは活性化されたがん遺伝子の導入によるものであるとされる。
5. DNAの感染性活性
- 腫瘍細胞基質からのDNAには感染活性があり、これはDNAに感染性ウイルスゲノムが存在するため。
- 多くのウイルスのゲノムは感染性を持っており、これがDNAワクチンに取り込まれると、接種した個体にウイルスが感染する可能性がある。
- このウイルスがヒトに感染すると、その結果は予測不能であり、リスクは非常に高いと考えられる。
- 特に、HIVワクチンを製造する際には、ウイルスの不活性化や感染性DNAの対処が必要である。
生体内におけるDNAのがん化活性の評価:
残存する細胞性DNAががんのリスクをもたらすかどうかについての意見が分かれている。研究者たちは、がん遺伝子の発現プラスミドを用いて、DNAが生体内でがんを引き起こすリスクを評価した。結果として、特定のがん遺伝子を含むDNAの量が多ければ、がんのリスクが上昇することが示された。
DNAの感染活性を試験管内試験での評価
細胞内に感染性のウイルスのDNAが存在する場合、それがワクチンに残存すると感染のリスクが生じる可能性がある。研究者たちは、HIV-1のDNAの感染力を測定するためのアッセイを開発し、どれだけのDNAが感染リスクとなるかを推定した。
文中で示されている情報に基づくと、細胞性DNAの残存によるリスクは実際に存在するが、そのリスクは残存するDNAの量や種類に依存する。ワクチンの安全性を確保するためには、DNAの量を制限する、またはDNAの活性を低下させる方法を探求する必要がある。
- HIV-1ゲノムと2倍体の哺乳類ゲノムの大きさ:
- HIV-1ゲノムの大きさは約10,000塩基対である。
- 2倍体の哺乳類ゲノムの大きさは6 x 10^9塩基対である。
- ウイルスDNAと細胞DNAの量の関係:
- 1 pgのウイルスDNAは、細胞あたりの単一のプロウイルスを含む細胞DNAの量として600 ngに相当する。
- 安全係数について:
- 製品に残存する細胞基質DNAの量が10 ngの場合、その安全係数は60となる。
- もし細胞が1つ以上のウイルスゲノムを持っていれば、この安全係数は減少する。
- 細胞基質DNAに関しては、10^7の安全率が適切と考えられている。したがって、安全係数60は不十分であるとされている。
- 細胞基質DNAの量と安全係数の関係:
- 10^7の安全率を得るには、細胞基質DNAを10 ng以下にするか、ヌクレアーゼ消化や化学的不活性化などの方法でDNAの生物活性を低下させる必要があると示唆されている。
- 感染性ウイルスゲノムのコピーが100個存在した場合、DNAの量を100 agまで減少させる必要があるとされている。
- 細胞基質DNAの処理:
- 現実的に、最も丈夫なウイルスワクチンでさえ、細胞基質DNAを非常に低いレベルまで減少させることは難しいとされている。
- そのため、特定の細胞基質については、DNAの追加処理が推奨される可能性があると結論されている。