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www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8788447/
2022年1月17日オンライン公開
要旨
グリホサート系除草剤は，1970 年代以降，世界中で雑草管理の第一選択剤として使用されてきた。主に，その有効性と低毒性の報告により，高い支持を得てきた。最近の研究の多くは、土壌、大気、水、食品中における農薬の残留性、あるいは動物への曝露の程度にのみ焦点が当てられており、ヒトの健康への潜在的な危険性が懸念されているためである。一般市民が農薬に無自覚に暴露していること、職業上の有害性に関する研究があまりないことを考慮すると、残留量と急性量の両方で得られた新しいグリホサート誘発毒性データを分析し、体系化する必要がある。さらに、最近の研究では、除草剤製剤に含まれるグリホサート代謝物や界面活性剤の残留性と毒性も浮き彫りになっている。グリホサートの使用を更新または禁止するためには、最近発表された研究を考慮し、除草剤、その代謝物および製剤の毒性賦形剤への曝露に対する新しい安全レベルを定義することが必要である。本総説では、グリホサートおよびその代謝物であるアミノメチルホスホン酸（AMPA）、グリホサート製剤による動物毒性を検証することを目的としたin vitroおよびin vivo試験に関する最近の発表（2010～）を概観し、種々の実験モデルで評価することを目的としている。グリホサートによる毒性とは別に、グリホサート製剤の毒性における界面活性剤の役割に関する最近のデータについて議論する。
キーワード：グリホサート、AMPA、グリホサート系除草剤、異生物、動物モデル、代謝、毒性
1. はじめに
長年にわたり、農業活動の除草剤への依存は、環境および公衆衛生の問題として解決が困難であった。人口増加と食糧増産の必要性から、除草剤の使用は、機械の燃料費削減に加えて、より遅く、より多くの人的資源を必要とする手取り除草を避けることで、最も迅速かつ安価な解決策であることが証明された[1]。大規模な除草剤の使用は、19 世紀の最終四半期（1874 年以降）に、主に無機化合物、例えば硫酸鉄や銅を使用して開始されたが、20 世紀には、1952 年から 1971 年の間に、アトラジン、ブロマシル、パラコート、グリホサートなどの新しい合成化合物の導入により、除草剤使用の影響が新しい次元に達した [2]．
これらの化合物は通常、除草作用の様式とその分子標的によって分類される[3]。トリアジン系のアトラジンは、光合成阻害剤である。植物細胞の光化学系 II (PSII) の D1 タンパク質と相互作用し、電子輸送系を障害する[4]。PSII はブロマシルの分子標的でもある [5]。一方、パラコートの主な標的は光化学系 I (PSI) で、除草剤は単一の電子受容体として働き、PSI に向かう電子を方向転換させるからである。この反応は、スーパーオキシドラジカルの形成につながる酸化的事象の連鎖を開始させる[6]。実際、市場で入手可能な除草剤の半数は、光化学系と電子輸送系を阻害するものである[5]。それにもかかわらず、除草特性を持つ市販の200種類以上の化合物のうち、そのような活性の分子標的はほとんど不明であり、記載されている29の作用モードのうち、アセト乳酸合成酵素、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシラーゼ、アセチル・コエンザイムAカルボキシラーゼ、プロトポリノーゲン酸化酵素およびフィトエンデサチュラーゼの阻害、ならびにPSIおよびPSII阻害はほとんどの製品に共通の標的となっている [7]（Phittoene Desaturase, Inc.
前世紀における除草剤の使用量の増加は、北米、南米、ヨーロッパ、アジアなどの多くの先進国でよく知られている。2014年の報告では，除草剤市場は年間170億米ドルを生み出し，成長が予測されていると述べている。例えば中国では，35年間（1970年から2005年まで）で，農薬処理地面積は1～7000万haに増加した[1,7]。より最近の評価によれば、除草剤の市場価値はほぼ240億米ドルであり、2022年までに100億米ドル増加すると予想されている[8]。この市場価値に大きく貢献しているのは、アメリカ合衆国、ブラジル、アルゼンチン、カナダを中心とする北南米諸国であり、世界の除草剤使用量の最も高い割合を占めている。ヨーロッパでは、ロシア（および旧ソ連）、フランス、ウクライナが主要な消費国として挙げられている[8]。しかしながら、動物に対する毒性は頻繁に観察され、土壌、水、大気中への残留性も報告されていることから、容易に入手できる除草剤が一般的かつ無秩序に使用されていることは大きな問題である。前述のとおり、アトラジンは世界で最も使用されている除草剤の一つであり、大気、霧、氷、海水、淡水、雨にその存在が確認されている[9,10]。人体への影響については、アトラジンは内分泌かく乱作用 [10,11]、細胞周期と細胞増殖の調節、腸管上皮の輸送調節、肝細胞毒性および遺伝毒性 [10,12,13,14,15] を示す可能性があるとされている。これらの理由から、欧州連合は2004年にこの化学物質を使用禁止にした[9]。
もう一つの例は、パラコートによる毒性で、これは広く記述されている（例えば、[16,17]）。皮膚および経口吸収は遅いが、ヒトの臓器、すなわち肺や腎臓に生物濃縮され、重度の臓器障害を引き起こすことが示されており [18,19] 、農薬との接触により皮膚刺激、吐き気、下痢、腹痛が引き起こされる [20] 。また、パラコートは他の生体異物と異なり、ほとんど代謝されず、血液脳関門を透過して神経組織に到達し、慢性暴露により生物学的利用能が増加し、影響が長期化することが報告されている[21,22]。経鼻経路を考慮すると、パラコートを長期間吸入した場合、しばしば致命的な障害やパーキンソン病などの長期的な障害を誘発する可能性がある[23]。欧州連合では、2007年からパラコートの使用が禁止されている。しかし、パラコートが使用されている国からの輸出入品が大量にあるため、ヨーロッパ人に対する毒性は、食品中の生物濃縮から生じる可能性がある[24]。農薬の使用制限は、世界中で最も使用されている除草剤の一つであることに加え、最も研究が進んでいるグリホサートの場合のように、農薬として使用されている様々な化学物質に対して仮説が立てられた[25]。このレビューでは、グリホサートとその商業的製剤の毒性に関する最近の進歩について議論する。
グリホサートは1950年に開発されたが [26] 、その除草活性は20年以上経ってから報告され、1970年にMonsanto社から発売された。グリホサートはラウンドアップ®（Monsanto, St.Louis, MO, USA）として販売され、農薬全体の使用量において DDT（ジクロロジフェニルトリクロロエタン）に次ぐ、歴史上最も成功した除草剤としてブランド化した [27,28]．N-(ホスホノメチル)グリシン（グリホサートの IUPAC 命名法）は、無臭の結晶性固体で、外観は白色。グリシンに、アミノ酸の一級アミン基を介して結合したホスホノメチル基が付加し、二級アミン化合物となる（図 1A にグリホサート構造を示す）。
図1
A）グリホサート、（B）グリホサートの主要代謝物であるAMPA（アミノメチルホスホン酸）、（C）グリホサート系除草剤によく用いられる界面活性剤POEA（ポリエチルオキシル化獣脂アミン）、の化学構造
グリホサートの除草作用は、植物、菌類、一部の微生物に存在し、動物には存在しない酵素である5-エノリピルビルシキメート-3-リン酸合成酵素（EPSPS；EC 2.5.1.19）を阻害することにより達成される。これらの生物では、ホスホエノールピルビン酸からシキミ酸-3-リン酸へのエノールピルビル基の転移は、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファン）などの必須代謝物の生合成に深く関わる代謝経路で、この場合はコリスメート生成不能により障害されるEPSPSによって触媒される [29,30,31]．
グリホサートは酵素と安定な複合体を形成することができ、ホスホエノールピルビン酸と競合するため、EPSPSの機能を阻害する[29,30,31]。元来、グリホサートは非選択性除草剤として広く使用されており、作物に対する毒性のみが制限されていた。これは後にグリホサート耐性作物の導入により克服された。すなわち、1996年に導入されたグリホサート耐性品種のダイズを通じて、その最初の数年間で農家による受け入れが大幅に増加し、グリホサートの使用量がさらに増加し、他の作物（例えば、綿やトウモロコシ）の新しいグリホサート耐性品種のバイオテクノロジーによる開発につながった [27]。これらのグリホサート耐性作物は、選択的遺伝子である pat と bar（グルフォシネート用）、そしてグリホサート耐性に最も関連する cp4 epsps 遺伝子を改変してバイオエンジニアリングされたもので、グリホサート耐性の EPSPS 酵素をコードしている。この耐性は、遺伝子の単一または複数の塩基対の改変、遺伝子の増幅／重複、異種物質代謝の増強、またはその他によって得られる[32,33]。主な目的は、EPSPSが高濃度で存在する作物を生産すること、またはグリホサートの植物毒性の低い代謝物への代謝を増加させることだ。市場で唯一のEPSPSに作用する除草剤であるため、これらの耐性作物の開発がその使用に大きく貢献した[32,33]。グリホサートの使用に対する制限の可能性が議論されるようになったのは、人間に対する毒性、土壌、水、食品への蓄積の可能性が初めて報告された後である [34]。この毒性は、世界的にグリホサート使用規制が課される根拠となった。
2. グリホサート使用に関する規制措置
近年、グリホサート使用禁止をめぐって、グリホサートの主要消費国とそれぞれの規制当局が論争を続けており、両者はグリホサートに対して正反対の分類を提示している。例えば、米国（US）と欧州の機関では、グリホサートとその商業製剤は発がん性の可能性が低い化学物質に分類されている[34]。一方、IARC（国際がん研究機関）は、これらの物質を、発がん性化合物の特徴であるDNA損傷と酸化ストレスを誘発する能力に基づいて、発がん性の可能性が高いとしてグループ2Aに分類している[34,35]。さらに、IARCの分析には、アミノメチルホスホン酸（AMPA）などのグリホサート代謝物も含まれる（図1B）。最近のレビューでは、グリホサートとその製剤の両方が遺伝毒性に関してあまり関心を持たれていない物質であるとまだ指摘されているため、この議論は今後も続くと思われる [36]。ほとんどの規制は、空気、水、食品中の汚染物質の濃度に関して一般住民を保護するために定義されているが、除草剤散布を担当する労働者は常に、より高い濃度のグリホサートに、より長い時間、より頻繁にさらされることになる [37]。その毒性／安全性に関する新たな科学的証拠は、特に労働者の安全性に関連する急性及びより長い慢性的な曝露について評価されなければならない。
欧州連合の具体的な事例では、グリホサートの禁止が過去20年にわたり継続的に議論されてきた。すでにEU諸国の大半で使用されている除草剤であるが、2002年に認可され、2010年に認可が更新され、IARCが上記の分類を発表した2015年まで使用されていた[35]。その後、発がん性がある可能性は低いとされたことを受け、欧州食品安全機関（EFSA）は、グリホサート製剤によく使用される非イオン性界面活性剤のポリエチルオキシル化獣脂アミン（POEA）（図1C）使用に関する議論を開始した[35]。EFSAによるグリホサート分類を受けて、欧州化学機関（ECHA）は、2017年にグリホサートは発がん性に分類されるべきではないと述べ、同年末にフランスやイタリアなどの主要EU加盟国の反対を押し切って5年間の追加を承認した[35]。それでも，2022年以降のグリホサート禁止の提案は起草され，POEAを含むグリホサート製剤は禁止された[35]。
オーストラリア、カナダ、ニュージーランドなどの他の国々は、米国とEUの機関の分類を支持した[35,37]。IARCの決定は、グリホサートベースの除草剤を調査したものを含め、科学雑誌に掲載された査読済みの研究のみを使用したという事実に起因している。EFSAのような機関は、有効成分であるグリホサートのみを考慮する以外に、機密保持のために一般に公開されない可能性のある製造者の報告書に基づいて分類を行った [35,37] 。
このレビューでは、グリホサートとグリホサート系除草剤の毒性に関する最近の進歩について、観察された毒性におけるこれらの除草剤の賦形剤の役割と、両方の分類の健全性と共に論じる。
3. グリホサートとAMPAの環境残留性
グリホサートの毒性について議論する際には、いくつかの要因を考慮しなければならない。まず、多くの著者がグリホサートによる毒性を報告しているが、それらの研究ではグリホサートベースの除草剤がしばしば用いられ、その組成は通常除草剤を 30 ～ 50% しか含まず、溶解度を高めるためにイソプロピルアミン塩として頻繁に添加されるが、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩誘導体も見られる [38] 。さらに、上述のように、これらの製剤は活性を高めるために界面活性剤を使用しており、これも観察される毒性の一因となる可能性があり、ラウンドアップ®のような最も一般的な製剤に含まれている[39]。したがって、グリホサートとグリホサート系除草剤の毒性を独立して特性評価することが非常に重要である。以下に報告するように、AMPA毒性に対する認識を高める科学論文が増え続けている。AMPAはグリホサート分解による主要代謝物であり、土壌、水、食品、ヒトへの蓄積など様々な試料で検出されており、その毒性および環境中残留性を理解することは、グリホサートと同様に重要な課題である。
米国と欧州の安全機関が行ったグリホサートのリスク分析は、主に一般住民を対象としていたため、住民が毎日慢性的に曝露されるグリホサートとAMPAの残留濃度を分析することが適切である[35,37]。EFSAが発表したグリホサートのリスク評価に関する結論では、グリホサートのDT50（化学物質の環境残留性を元の濃度の半分に分解するのに必要な時間として測定）は、試料によって高いばらつきを示すと述べられている。嫌気条件下の土壌では、グリホサートのDT50は135日から1000日以上となり、高い残留性を示す。一方、好気条件下では、EFSAが用いた実験室研究では、土壌の種類、pH、温度、土壌水分も分析に含まれるパラメータであり、DT50は1.01日から67.72日であることを示している[40]。一方、AMPAは高い難分解性を示し、好気的条件下でのDT50は38.98～300.71日であった[40]。
DT50 に加えて、農薬の環境影響は予測環境濃度（PEC）、すなわち PECaccu として測定される。これは、深さ 5 cm の裸地土壌に 10 年間、1 ヘクタールあたり 4.32 kg の活性成分を散布した場合の最悪のシナリオと見なされる [41]。このシナリオでは、グリホサートの PECaccu は 6.6 mg/kg であったが、AMPA の PECaccu は 6.2 mg/kg であった。これは 1.527 kg の有効成分を適用し（前述の条件）、AMPA の最大濃度が適用量の 53.8% であると考えた場合である [40]．
表層水に対する PEC（PECsw）および底質に対する PEC（PECsed）については，1ヘクタールあたり 4.32 kg の有効成分を単回施用した場合，PECsw = 104.8 μg/L，PECsed = 10.3 mg/kg となった．同じ散布量を用いた場合、AMPA の PEC 値はグリホサートよりも低く、PECsw = 40.9 µg/L および PECsed = 3.3 mg/kg [40]が観察され た。グリホサートのリスクアセスメントに関するEFSAの文書でもPECairが考慮されている。しかし、分析されたデータは大気中のDT50を2日未満としており、したがって長距離輸送に関する仮説は除外され、PECairは無視できると考えられている[40]。
グリホサートは安定した化学構造を持ち、金属をキレート化することができ、土壌中で高い残留性を持ち、他の一般的な無機リン酸塩と同じように振る舞う。物理的分解は主要な介入要因ではないが、土壌と水の両方に存在する微生物が、最適な条件下で除草剤の半減期を大幅に減少させる可能性がある [42,43]。グリホサートの分解は、分解経路に応じて AMPA またはサルコシンとグリシンのいずれかを生成する [43]。グリホサートの分解は水中でより速く進むが、グリホサートの半減期が最大91日であるのに加え、AMPAは依然として76日から240日と長い半減期を示す[44]。しかし、土壌や水の状態が様々であることから、他の著者は異なる半減期を提示している[42,43]。また、土壌サンプル中に180日まで残留することを報告した者もいる[38,45]。表 1 は、さまざまな水源、土壌、大気、食品、ヒトの体液におけるグリホサートと AMPA の蓄積に関する最近の知見をまとめたものである。
表1動物毒性に関連するさまざまな物質中のグリホサートおよびその代謝物である AMPA の濃度
| ビール | 2.8 µg / kg | ELISAキット | [ 64 ] | |
| 茶葉 | 40.43 µg / kg | ELISAキット | [ 64 ] | |
| ティーバッグ | 728.2 µg / kg | ELISAキット | [ 64 ] | |
| パン | 45.8 µg / kg | LC-MS n | [ 61 ] | |
| ハニー | 220 µg / kg | HPLC-FD | [ 65 ] | |
| ハニー | 49.8 µg / kg | LC-MS n | [ 66 ] | |
| 猫とドッグフード | 0.03 µg / kg | ELISAキット | [ 67 ] | |
| 人間の尿 | 7.4 µg / L | LC-MS n | [ 68 ] | |
| 人間の尿 | 1.36 µg / L | LC-MS n | [ 69 ] | |
| 人間の尿 | 7.2 µg / L | LC-MS n | [ 70 ] | |
| 人間の尿 | 5.6 µg / L | LC-MS n | [ 71 ] | |
| 人間の尿 | 3.3 ng / L | ELISAキット | [ 72 ] | |
| ヒト血清 | 1477 µg / mL | LC-MS n | [ 73 ] | |
| ヒト血清 | 89 µg / mL | LC-MS n | [ 73 ] | |
| AMPA | 雨水 | 5.8 µg / L | LC-MS | [ 46 ] |
| 地下水 | 6.5 µg / L | UHPLC–MS n | [ 49 ] | |
| 地下水 | 0.65 µg / L | LC-MS n | [ 50 ] | |
| 地下水 | 11 µg / L | LC-MS | [ 48 ] | |
| 湖の水 | 0.90 µg / L | HPLC-MS n | [ 51 ] | |
| 海水 | 4.2 µg / L | LC-MS n | [ 52 ] | |
| 水 | 4.5 µg / L | UHPLC–MS n | [ 54 ] | |
| 浮遊粒子状物質 | 475 µg / kg | UHPLC–MS n | [ 53 ] | |
| 浮遊粒子状物質 | 0.07 µg / L | HPLC-MS n | [ 51 ] | |
| 堆積物 | 7219 µg / kg | UHPLC–MS n | [ 53 ] | |
| 堆積物 | 15 µg / kg | LC-MS | [ 48 ] | |
| 堆積物 | 32.89 µg / kg | HPLC-MS n | [ 51 ] | |
| 土壌 | 38,939 µg / kg | UHPLC–MS n | [ 53 ] | |
| 土壌 | 2256 µg / kg | UHPLC–MS n | [ 55 ] | |
| 土壌 | 8 µg / kg | LC-MS | [ 48 ] | |
| 空気 | 0.06 ng / m 3 | HPLC-MS | [ 56 ] | |
| 空気 | 0.02 ng / m 3 | HPLC-MS | [ 56 ] | |
| オートミール | 40 µg / kg | LC-MS n | [ 58 ] | |
| オーツ麦ベースのシリアル | 25 µg / kg | LC-MS n | [ 58 ] | |
| 麦粉 | 25 µg / kg | LC-MS n | [ 58 ] | |
| 朝食用シリアル | 10 µg / kg | LC-MS n | [ 61 ] | |
| デュラム小麦 | 247 µg / kg | LC-MS n | [ 60 ] | |
| 大豆タンパク質分離物 | 210 µg / kg | UHPLC–MS n | [ 62 ] | |
| 大豆たんぱく質濃縮物 | 2710 µg / kg | UHPLC–MS n | [ 62 ] | |
| 大豆 | 10,000 µg / kg | HPLC-FD | [ 63 ] | |
| ワイン | 3.4 µg / kg | LC-MS n | [ 61 ] | |
| ハニー | 100 µg / kg | HPLC-FD | [ 65 ] | |
| ハニー | 50.1 µg / kg | LC-MS n | [ 66 ] | |
| 人間の尿 | 1.53 µg / L | LC-MS n | [ 69 ] | |
| ヒト血清 | 1.5 µg / mL | LC-MS n | [ 73 ] | |
| ヒト血清 | 0.07 µg / mL | LC-MS n | [ 73 ] |
略語 HPLC：高速液体クロマトグラフィー、UHPLC：超高速液体クロマトグラフィー、LC：液体クロマトグラフィー、IC：イオンクロマトグラフィー、MS：質量分析計、FD：蛍光検出器
表 1 の主な結論として、さまざまなサンプルにおけるグリホサートおよび AMPA 濃度の高い不均一性が観察される。このような多様な結果の背景には、使用する分析方法があり、その検出限界、定量限界、精度が結果に影響を与える可能性がある。現在、グリホサートの検出には、クロマトグラフィー、分光学、電気化学のさまざまな手法が適用されており、この汚染物質の定量を迅速かつ確実に行うための努力がなされている[74]。第二の要因は、分析の地理的な場所と分析される試料である。ヨーロッパ中の様々な水源で依然として検出されているが（0.1未満から165 µg/Lの範囲）、これらの残留濃度は、米国などの国で見られるもの（最大430 µg/L）よりもかなり低い[75]。これは、米国ではグリホサート耐性作物の使用が多いのに対し、欧州の一部の国ではこれらの作物を許可していないことに起因すると思われる。この傾向は、ヒトの尿中のグリホサート存在についても観察される。米国では、人口の少なくとも 60% が尿中にグリホサートの蓄積を示し、最大 233 µg/L の除草剤濃度を記録した [75]が、平均値は 2 ～ 3 µg/L であった。ヨーロッパでは、測定された平均値はより低く（<1 µg/L）、登録された最大濃度（5 µg/L）であった[75]。このように2つの主要な経済圏で曝露の程度が異なるため、曝露限度に関する規制も大きく異なっている。欧州の機関は、1日の摂取量を0.5 mg/kg/dayとし、ラットを用いた研究で350 mg/kg/dayを肝機能障害に基づく毒性とし、ウサギをモデルとした研究で50 mg/kg/dayを安全濃度としているが、米国の機関はその基準を 1.75 mg/kg/day としている [76]-[8] 。一般集団は一般にもっと低い濃度のグリホサートに曝されているが、それでも一部の著者は、認められた一日摂取量は高すぎると特徴づけている [76,77]。また、除草剤散布に携わる労働者の職業的危険の影響については、再度、考慮されていない。大気汚染に関しては、大気試料中のグリホサートと AMPA の難分解性の研究も行われている。Chang ら（2011）は、ミシシッピ州とアイオワ州で、それぞれ最大 9.1 および 7.7 ng/m3 のグリホサート濃度を報告した[56]。それにもかかわらず、AMPAはもっと低い濃度で検出され、平均値は0.02～0.06 ng/m3、最大値は0.97 ng/m3であった[56]。上述のように、EFSA は PECair を無視できるほど低い DT50 とみなしており[40]、したがって除草剤への一般集団の暴露に対する主な懸念事項ではない。しかし、職業上の危険性を考慮する場合、汚染された大気を通してのグリホサート曝露はより高い懸念を示す可能性がある。Morshedら（2011）は、除草剤散布前、散布中、散布後の大気中のグリホサート濃度を評価した[57]。散布前にはグリホサートは検出されなかったが、散布後の大気中濃度は 0.1 µg/mL（0-4 時間後）および 0.05 µg/mL（4-8 時間後）に増加した。人体への暴露についてより大きな関心が寄せられる中、散布中のグリホサートの大気中濃度は ~43 µg/mL [57] であり、報告された残りの値よりもかなり高く、これは作業員の職業上の危険性を浮き彫りにしている。
表1の分析から得られた第二の結論として、異なる植物製品または飲料は異なるグリホサート含有量を示し、その結果、人間の食事依存性グリホサート暴露において異なる役割を果たすことになる。特に、ほとんどの作物でグリホサートが使用され、グリホサート耐性品種が存在するため、小麦、オート麦、トウモロコシ、大豆はグリホサート含有量が高い製品の一つである [58,59,60,61,62]。当然、パン、朝食用シリアル、小麦粉などの加工製品に含まれるグリホサート含有量に影響する。水の汚染に加えて、ビール、ワイン、茶などの飲料もこれらの汚染物質の含有量が高いが [61,64]、これは原料の事前汚染に起因する可能性が最も高い。これらはすべて、ヒトにおける生物濃縮に寄与し、ヒトの食用に飼育された動物も同様にグリホサートとその代謝物を蓄積し、したがってヒトへの曝露をさらに増加させる可能性があることが前提となっている。さらに、影響が大きいのは、表1において、グリホサートの存在が、主な分析源であるゼノバイオティクス代謝／排出における役割に起因するヒト尿中だけでなく、血清など他のヒト体液中にも報告されていることである[68,73]。代謝に関して、グリホサートは主に2つの経路をたどることができる。(i) 哺乳類はグリホサートを代謝する効率が低いため、そのままの形で尿中に排泄される。 (ii) 腸管内代謝。腸管の微生物が摂取したグリホサートの一部をAMPAに代謝することがある [78]．
第三の結論は、同じ分析試料にAMPAが蓄積されていることだ。既存の規制は主にグリホサートを対象としているが，分解が速い場合には除草剤の存在が検出されず，AMPAの存在を考慮した分析が行われていない可能性がある．したがって、AMPAの毒性については、十分に検討する必要がある。
したがって、グリホサートへの曝露量が多いこと、市場に出回っている除草剤製剤およびその代謝物を考慮すると、その毒性についてのより詳細な知見は必須である。このレビューでは、主にグリホサート、AMPA、POEAに焦点を当てる。
4. 動物毒性評価のためのin vitroおよびin vivo試験（2010-2021年）
上述の通り、グリホサートの使用を禁止するか許可するかの判断は、様々な論争に包まれている。相当数の研究がin vivoとin vitroの両モデルを用いてグリホサートの毒性作用を明確に検証している一方で、グリホサート系除草剤に含まれる賦形剤とアジュバントが観察される動物毒性に貢献していることを強調する論文も増えてきている。表1に基づくと、主に先進国ではグリホサートの残留レベルに一般的に暴露されていることが明らかである（例えば、カナダ [47] とスイス [61] ）。しかし、実際の暴露量と頻度はほとんど追跡できない。さらに、上述のように、グリホサート禁止は職業上の危険も考慮すべきであり、それは一般集団と比較してはるかに高い曝露を意味する。さらに複雑なことに、グリホサートの毒性について発表された研究は、その結果が分析基準に対するものなのか、除草剤中のグリホサート含有量に対するものなのか、あるいは除草剤全体に対するものなのかが明確でないことが多い。現在、世界中で多数のグリホサート系除草剤が使用されており [79]、ヨーロッパでは単年度（2012年）で2000を超える製剤が確認されている [39]。各製剤は独自の組成を示すため、疑問が生じる。製剤間の結果をどの程度まで比較することができるのだろうか。表2は、グリホサートとその除草製剤およびその代謝物であるAMPAによる動物毒性を評価する目的で、最近発表されたin vivoおよびin vitro試験の概要を示している。
表2動物細胞培養および動物実験モデルにおけるグリホサート、グリホサート系除草剤および AMPA の毒性に関する最近の科学発表。
| モデル | 曝露時間 | テストされた 濃度 |
効果 | 参照。 | |
|---|---|---|---|---|---|
| グリホサート （99.8％） |
Cherax quadricarinatus | 60日 | 10および40mg/ L | 筋肉の脂質レベル、および肝膵臓と筋肉のタンパク質レベルの低下 | [ 83 ] |
| グリホサート （99％） |
ダニオレリオ | 96時間 | 1.7〜100 mg / L | 遺伝子毒性、形態学的異常 | [ 84 ] |
| グリホサート （˃98％） |
ホルモン依存性乳がん（T47D細胞株） | 24時間 | 10 −9 –10 −3 mM | 細胞増殖の増加 | [ 85 ] |
| グリホサート （95％） |
ヒトケラチノサイト （HaCaT細胞株） |
24時間 | 10〜70 mM | 細胞の完全性の喪失、H 2 O 2の過剰産生、膜損傷、アポトーシス誘導、遺伝子毒性 | [ 86 ] |
| グリホサート （95％） |
口腔上皮細胞（TR146細胞株） | 20分 | > 10 mg / L | 乳酸デヒドロゲナーゼ放出の増加、DNA損傷 | [ 87 ] |
| グリホサート （99％） |
ヒト肝細胞癌 （HepG2細胞株） |
4時間と24時間 | 0.5〜3.5 µg / mL | 小核形成、より低い抗酸化能力 | [ 80 ] |
| グリホサート （90％） |
スプラーグドーリーラット | 5週間 | 5〜500 mg / kg | 1日の平均飼料摂取量の減少と総精子数の減少 | [ 88 ] |
| グリホサート （指定なし） |
人工多能性幹細胞（iPSC） | 24時間 | 1〜1000 µM | フルオレセインに対する血液脳関門の透過性の増加、神経細胞の代謝活性の変化、および脳の微小血管内皮細胞におけるグルコース取り込みの増加 | [ 89 ] |
| グリホサート （40％） |
オオミジンコ | 60日 | 0.5〜4.05 mg/Lのグリホサート | 幼体のサイズの縮小、繁殖力と寿命の減少 | [ 90 ] |
| グリホサート （指定なし） |
ダニオレリオ | 21日 | 10〜100 mg/Lのグリホサート | 産卵の減少、初期胚死亡率と早期孵化の増加、ステロイド産生生合成経路の破壊、酸化ストレス | [ 91 ] |
| グリホサート （指定なし） |
ダニオレリオ | 48時間 | 50 µg/mLのグリホサート | 心房と心室の構造異常、不整脈、内臓逆位、心拍数の減少 | [ 92 ] |
| グリホサート （指定なし） |
ダニオレリオ | 15日間 | 65 µg/mLのグリホサート | 卵母細胞の直径の増加、ミエリン様構造として現れる同心膜の存在、卵母細胞におけるSF-1の発現の増加 | [ 93 ] |
| グリホサート （指定なし） |
ダニオレリオ | 96時間 | 0.01〜0.5 mg/Lのグリホサート | 成体ゼブラフィッシュの運動を減少させ、ゼブラフィッシュ幼生の眼球距離を減少させる | [ 94 ] |
| グリホサート （指定なし） |
スプラーグドーリーラット | 2週間 | グリホサート50〜150 mg / kg | 活動低下、側坐核のD1ドーパミン受容体への特異的結合の減少、基底細胞外ドーパミンレベルの減少、および線条体における高カリウム誘発性ドーパミン放出 | [ 95 ] |
| Roundup （480 g / L） |
Piaractus mesopotamicus | 48時間 | 3.0〜4.5 mg/Lのグリホサート | 肝臓における細胞質の空胞化、脂質の蓄積、核および細胞膜の変化、およびグリコーゲンの枯渇 | [ 96 ] |
| タッチダウン® （523 g / L） |
Caenorhabditis elegans | 30分 | グリホサートの3〜10％ | ミトコンドリアの複合体IIの阻害、ATPレベルの低下、H 2O2レベルの上昇 | [ 97 ] |
| Roundup （410 g / L） |
ヒト肺胞がん（A549細胞株） | 2時間 | 100 µg / L | 細胞増殖の阻害、ミトコンドリア膜の崩壊、酸化的DNA損傷、DNA一本鎖切断および二本鎖切断 | [ 98 ] |
| Roundup （180 g / L） |
オオミジンコ | 60日 | 0.5〜4.05 mg/Lのグリホサート | 若年期のサイズ、成長、繁殖力の減少および流産の増加 | [ 90 ] |
| Roundup （180 g / L） |
キイロショウジョウバエ | 24時間 | 15 µg / mL | 寿命の短縮、繁殖力、卵巣鞘細胞の細胞生存率、負のジオタキシス応答、タンパク質のカルボキシルレベルの増加、およびアポトーシス促進プロセスを示すカスパーゼ活性の増強 | [ 99 ] |
| Herbolex （486 g / L） |
オオミジンコ | 48時間 | 20〜137 µg / L | 脂質過酸化の増加、飼料阻害、抗酸化酵素活性の増加 | [ 100 ] |
| Roundup （480 mg / L） |
Poecilia reticulata | 96時間 | 0.34〜5.2 mg/Lのグリホサート | エネルギーおよび核酸代謝、細胞骨格およびタンパク質の調節; 鰓の進行性の組織病理学的損傷 | [ 101 ] |
| Roundup （450 g / L） |
口腔上皮細胞（TR146細胞株） | 20分 | > 10 mg/Lのグリホサート | 小核、小核、小核の増加 | [ 87 ] |
| Roundup （360 g / L） |
アルビノラット | 12週間 | 3.6〜248.4 mg/kgのグリホサート | 腎臓組織におけるグリホサート残留物の蓄積、腎臓における組織病理学的病変、歪んだ腎皮質組織構造、糸球体硬化症による尿路の拡大、および尿細管壊死 | [ 102 ] |
| Roundup （360 g / L） |
マウス | 6週間と12週間 | 250または500mg/kg/日 | 体重増加と運動活動の減少、不安とうつ病のような行動レベルの増加 | [ 103 ] |
| Roundup （360 g / L） |
アルビノラット | 12週間 | 3.6〜248.4 mg /kg/日 のグリホサート |
血中のテストステロン、FHS、LHの平均レベルの低下、プロラクチンの増加、ROSの過剰産生、精子数の減少、運動率の低下、異常な精子細胞の増加、精巣の変性病変 | [ 104 ] |
| Roundup （360 g / L） |
アンギラアンギラ | 1日と3日 | 18および36µg / L | 鰓のカタラーゼ活性の増加、肝臓のスーパーオキシドジスムターゼ活性の減少、DNA損傷の増加 | [ 105 ] |
| Roundup （360 g / L） |
マウスセルトリ細胞 （TM4細胞株） |
24時間 | 10〜10,000 mg / L | コハク酸デヒドロゲナーゼ活性の低下、グルタチオン-S-トランスフェラーゼの阻害、細胞解毒システムの破壊、細胞質脂肪滴の増加 | [ 106 ] |
| Roundup （360 g / L） |
コロソママクロポマム | 96時間 | 10および15mg/L のグリホサート |
呼吸上皮構造の変化、血液学的パラメーターの変化、ROS産生の増加、赤血球のDNA損傷の増加、魚の脳のコリンエステラーゼ活性の阻害 | [ 107 ] |
| Roundup （120 g / L） |
ダニオレリオ | 21日 | 0.01〜10 mg/L のグリホサート |
初期胚死亡率の増加と早期孵化、ステロイド産生生合成経路の破壊、酸化ストレス | [ 91 ] |
| Roundup （120 g / L） |
オオミジンコ | 48時間 | 100〜300 mg / L | 全身の酵素活性の喪失と細胞の完全性の喪失 | [ 108 ] |
| Roundup | ダニオレリオ | 96時間 | 0.01〜0.5 mg / L | 成体ゼブラフィッシュの運動の減少、ゼブラフィッシュ幼生の眼の距離、成体ゼブラフィッシュの攻撃的行動の減少、成体ゼブラフィッシュの記憶障害 | [ 94 ] |
| AMPA | オオミジンコ | 21日 | 7.4〜120 mg / L | 新生児の生産量の減少 | [ 109 ] |
| AMPA | Bufo spinosus | 16日 | 0.07〜3.6 µg / L | 胚の生存率の低下、発達の遅れ、体の形態の変化 | [ 110 ] |
| AMPA | ダニオレリオ | 24〜96時間 | 1.7〜100 mg / L | 遺伝子毒性、形態学的異常 | [ 84 ] |
| AMPA | 人工多能性幹細胞（iPSC） | 24時間 | 0.1〜1000 µM | フルオレセインに対する血液脳関門の透過性の増加、神経細胞の代謝活性の変化、および脳微小血管内皮細胞におけるグルコース取り込み | [ 89 ] |
| AMPA | ヒト赤血球 | 4時間と24時間 | 0.01〜5 mM | ROS産生、溶血、ヘモグロビン酸化の増加 | [ 111 ] |
| AMPA | Paracentrotus lividus | 24時間と48時間 | 1〜100 µg / L | 発育遅延、呼吸数の増加、幼虫のサイズの縮小 | [ 112 ] |
備考 グリホサート系除草剤中のグリホサート含量は、製剤名の下にパーセントで表示した。グリホサート系除草剤に関する研究で、著者が使用したグリホサート濃度として計算し結果を表したものについては、例えば「グリホサートmg/L」と記載し、例えば「mg/L」と記載した研究は、グリホサート系除草剤全体の濃度に対する相対値であるとした。
グリホサートとグリホサート系除草剤の毒性はともに、長年にわたり様々な実験モデルで実証されてきた[79]。Agostiniら（2020）は、in vitro細胞モデルを用いた、グリホサート誘発毒性に関する非常に完全なレビューを発表している。観察された影響は、主に細胞生存率の低下、膜の完全性の喪失、遺伝毒性、酸化ストレスの増加、脂質過酸化、細胞内カルシウム濃度（[Ca2+]i）と細胞周期の調節に関するものであった。さらに、グリホサートは内分泌かく乱物質として作用することもある[78]。
遺伝毒性については、最近の知見から、ないと断じる前にさらなる研究が必要であることが示唆されている。HepG2 細胞（ヒト肝癌細胞株）は、肝臓が異種物質代謝に関与していることから、肝代謝の細胞モデルとして頻繁に使用されている。HepG2 細胞にグリホサートを 0.5 ～ 3.5 µg/mL の濃度で暴露し、一日の摂取量、住居暴露および職業暴露の範囲内の濃度を比較した [80] 。細胞生存率に悪影響は観察されなかった [80]。実際、除草剤に暴露した細胞では、対照的な酸化ストレスマーカー（活性酸素種レベルおよびグルタチオン量）により、わずかに高い細胞生存率が観察され、コメットアッセイで評価したところ、DNA損傷は観察されなかった[80]。しかし、著者らは、対照細胞と比較して、小核の形成が増加し、細胞周期の位相が非同期であることを観察した[80]。他の著者らは、異なるモデルにおいてグリホサートに対する遺伝毒性を観察したが、それは高濃度においてのみであった [80,81]。しかし、低濃度であっても共有結合性付加物が形成される可能性がある。ある化合物によるこれらの付加物の形成は、DNAの鎖間架橋を引き起こし、曲げたりほどいたりする原因となる。細胞周期の進行に伴い、これらの修飾はDNA複製を損ない、さらに細胞周期の停止やアポトーシスを引き起こす可能性があるが、遺伝毒性という大きな兆候は現れない[80]。
ヒト細胞株に関する研究に加え、グリホサート系除草剤、その有効成分および賦形剤の影響については、表2に見られるように、多種多様な動物モデルにおいてかなりよく説明されている。動物実験によく用いられるモデル、例えば、Wistar ラット、ショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)、ゼブラフィッシュ (Danio rerio)、ミジンコ (Daphnia magna) および回虫 (Caenorhabditis elegans) からである。遺伝毒性、神経毒性、腫瘍の研究において、ヒトへの外挿によく使用されるマガキ（Crassostrea gigas）やヒキガエル（Bufo spinosus）などのあまり知られていない種では、さまざまな影響が観察された。
Agostiniら（2020）がヒト細胞株でレビューしたデータを裏付けるように、グリホサートのみを投与した動物モデルも毒性を示し、そのほとんどは体重、運動性、繁殖性、飼料摂取量などの形態的または一般的な健康パラメータとして測定されている [78]．酸化ストレスやホルモン調節などの代謝バイオマーカーを考慮した研究はわずかしかない。グリホサート毒性に関与する代謝経路に関する証拠がないため、in vivoモデルでの広範な研究がまだ必要である。離乳豚における最近の研究では、腸管上皮の形態とバリア機能に対するグリホサートの毒性作用が報告されている[82]。しかし、発表された研究を詳しく分析したところ、著者らはラウンドアップ®を使用し、その含有量の30%のみがグリホサートであることが再び明らかになった。したがって、グリホサートのmg/kg of dietとして結果を表現しているが、動物モデルに与える混合飼料には他の賦形剤が存在した。しかしながら、著者らは、除草剤が腸管レベルのタイトジャンクションタンパク質の発現を調節し、タイトジャンクションタンパク質-1（ZO-1）およびクローディン-1の両方のmRNA発現が低下することを確認した[82]。さらに、酸化ストレスマーカーも変化し、酸化ストレス反応に関与するタンパク質であるNuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)の発現が増加した。さらに、炎症マーカーであるインターロイキン-6（IL-6）および活性化B細胞の核因子κ-ライトチェーン-エンハンサー（NF-kB）の発現が増加したが、IL-1βおよびIL-8のmRNA発現には影響を与えなかったと報告した[82]。
さらに、表 2 に見られるように、AMPA とグリホサートは、遺伝毒性 [84] および酸化ストレス [111] に関連したより一般的な影響から、形態および繁殖力の問題 [110] まで、試験した動物モデルにおいて多数の影響を共有していることに議論の価値がある。ヒトに対するAMPA毒性は、まだほとんど研究されていない。最近の研究は、AMPAの曝露、生物蓄積および毒性について、その検出に関するさらなる立法化につながり、グリホサート禁止に寄与しうる大規模な議論を正当化するのに十分な科学的証拠をまだ提示していない。
5. グリホサート系除草剤に使用される界面活性剤の毒性効果
グリホサート系除草剤を構成する賦形剤およびアジュバントの毒性もまた、非標的種に対して活性化合物よりも高い毒性を示すことが多いため、取り上げられている。例えば、グリホサート系除草剤ラウンドアップ®に含まれるPOEA（ポリエトキシル化獣脂アミン）に関して、この名前は、アミン部分（図1C）が脂質ベース、すなわち動物性脂肪由来であり、したがって獣脂（パルミチン酸（C16、飽和）、オレイン酸（C18、モノ不飽和）、ステアリン酸（C18、飽和）、その他由来のアミンの混合物）として呼ばれているノニオン性界面活性剤の分類を表す [113]（POEAs of the Nionic surfactants in the mainlyphosate-based haredbicide, ROUNDUP）。これとは別に、分子はエチレンオキシドの2本の鎖を含み、したがってポリエチルオキシル化獣脂アミンと呼ばれる。EU の禁止令（米国では採用されなかった規制）を受けて、非 POEA 界面活性剤を用いた新世代の除草剤処方が代替案として提案されており、POEA の毒性に関する議論は一般的な関心事として維持されている[39]。グリホサートとグリホサートベースの製剤について述べたように、POEAsについても実験モデルの繁殖力、遺伝毒性、総合毒性に対する影響が、それほど広くはないものの、述べられている[84,99,106,114,115]。表 2 に見られるように、一部の著者は除草剤製剤中のグリホサート濃度または除草剤製剤全体の濃度に基づいて結果を報告しており、表示濃度が何を指すのか（活性化合物か製剤か）を特定しない研究さえあり、結果間の比較を複雑にしているため、これは特に注意を要する [39]. 表3は、in vivoおよびin vitroの実験方法で観察されたPOEAsの毒性に関する最近の研究結果を示したものである。
表3in vivo および in vitro の実験モデルを用いた海外製薬会社の毒性評価。
モデル 暴露時間 試験濃度 影響 参考文献
Wistar rat 15 min 1.28-800 mg/L 単離空腸セグメントの自発運動活性の障害 [114] Crassostrea gigas 35 min 1.28-800 mg/L 単離空腸セグメントの自発運動活性の障害 [114
配偶子形成の遅延，結合組織の破 壊，消化管壁の萎縮 [115] Danio rerio
Danio rerio 24-96 h 0.4-16 mg/L 遺伝毒性，形態異常[84]．
マウス セルトリ細胞
(TM4 細胞株) 24 h >0.01% 高い細胞毒性（細胞生存率 0%）[106]。
ショウジョウバエ 24 時間 45 µg/mL 寿命の減少、負の地軸性反応、タンパク質のカルボキシルレベルの増加、繁殖力の減少、卵巣鞘細胞の生存率の減少、プロアポトーシスプロセスを示すカスパーゼ活性の上昇 [99] 。
インビボモデルとしてキイロショウジョウバエを使用し、Bednářováら（2020）はグリホサート対グリホサート系除草剤毒性における新たな知見に貢献した[99]。簡単に言うと、著者らはこのモデルでラウンドアップ®コンセントレートプラス（グリホサートイソプロピルアミン塩143 g/L）の毒性を分析し、15 µg/mLでハエの寿命と繁殖力が低下することを検証したが、100 µg/mLのグリホサートでは同じことが観察されなかった。グリホサートのLC50は5146 μg/mLであるのに対し、ラウンドアップ®のLC50は774.4 μg/mLであった[99]。賦形剤の毒性に関する情報を得るため、著者らはPOEAも試験したが、そのLC50は1322.6 μg/mLであり、グリホサートよりはるかに低い値であった。さらに、ラウンドアップ®とPOEAは、タンパク質の酸化的損傷のバイオマーカーであるタンパク質カルボニル濃度を増加させ、カルボニル還元酵素活性を低下させたが、グリホサートはタンパク質カルボニル濃度を変化させなかった[99]。
同様の知見は、グリホサートと2種類のグリホサート系除草剤を用いたマウスセルトリ細胞（TM4）のin vitro細胞モデルでも観察された[106]。グリホサートは24時間暴露しても細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、同じ濃度では両剤とも用量依存的な細胞毒性を引き起こし、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性が減少した。また、グリホサート製剤でのみ、脂質滴の蓄積が観察された。この毒性におけるPOEAの潜在的な影響を確認するために，著者らはPOE-15の効果を評価し，脂質滴蓄積におけるPOE-15の役割を確認するとともに，細胞内における界面活性剤の生物濃縮を示唆した．0.5%のPOE-15では，わずかなインキュベーション時間（2分）でも，細胞生存率の大きな減少が観察された．TM4 細胞を 0.01% の POE-15 に 24 時間暴露したところ，100% の細胞死を引き起こすことが明らかになった [106]．また，TM4 細胞を 0.01% の POE-15 に 24 時間暴露したところ，100% の細胞死を引き起こすことが明らかになった．
グリホサート摂取による重篤な全身毒性と診断されたヒトにおいて、韓国の病院記録（n = 107）の様々な症例の分析から、摂取したグリホサート系除草剤の量が観察された毒性の決定因子であり、界面活性剤とは無関係に摂取した量と相関しているという大きな結論に至った。患者は、高血圧、不整脈、呼吸不全、腎外傷などの症状を呈した。患者のうち2人は、代謝性アシドーシス、呼吸不全、難治性ショックで死に至った[116]。
しかしながら、除草剤製剤中の賦形剤の量を考えると、グリホサートまたはPOEAだけが安全または唯一の毒性成分であると考えることはできない。本来、賦形剤は不活性であるべきだが、石油系化合物、ヒ素、鉛、コバルトまたは多環芳香族炭化水素が農薬製剤中に存在するため、そうとは言えない [117,118] 。実際、これらの化合物の中にはグリホサートよりも高い毒性を予め示すものがあり、化合物間の相乗的相互作用の可能性が、グリホサート製剤の毒性上昇に寄与していると考えられるが、グリホサートを製剤単独ではなく標準分子として適用した場合はそれほど深刻ではない。さらに、これらの成分の中には組成表で申告されていないものもあるため、毒性の源に関する疑問が生じることもある [117,118]。
6. 結論
グリホサート毒性は、発表されたデータが明確でないこともあり、継続的に議論の対象となってきた。ある研究ではグリホサートのみを用い、他の研究ではグリホサートと一連の非差別的化合物を含む製剤を用いている。グリホサートは歴史上最も成功した除草剤とみなされている。しかし、一般住民に対する現在の暴露濃度での安全性を保証するには、決定を裏付ける科学的発表がまだ多く必要である。第一に、実際の曝露量を正確に定義し、土壌、水、空気、食品の汚染を考慮する必要がある。第二に、グリホサートベースの除草剤組成物を製剤ごとに正確に記述し、グリホサート含有量と存在する賦形剤の両方に基づいてその毒性を正しく分析できるようにする必要がある。しかしながら、このような製剤の毒性は現在十分に証明されており、規制の見直しが必要である。これらの製剤の生産、使用、ひいては環境汚染をよりよく規制するための努力が必要である。さらに，これらの農薬による環境への影響や動物への毒性を最小限に抑えるための新たな戦略も研究されており，これらの製品の安全な使用を保証するための有望な戦略であると考えるべきである。
執筆協力
構想、C.M.-G.およびA.M.S.、方法論、C.M.-G.、執筆-原案作成、C.M.-G.、T.L.S、A.M.S.、執筆-審査および編集、C.M.-G.、 T.A. および A.M.S. 、指導、管理、A.M.S.、すべての著者は原稿の公開版を読み、合意している。
資金提供
本研究は，ポルトガル科学技術財団（FCT）およびNORTE 2020の欧州・国家資金によるプロジェクト UIDB/04033/2020（CITAB），FCT による POCI-01-0145-FEDER-029343, POCI-FEDER による研究プロジェクト SafeNPest-Synthesis and Environmental Safety of Nanopesticides によって資金提供されたものである。C.M.-G.は（BIM/UTAD/13/2019）、T.L.S.は（BII/UTAD/2021）、SafeNPestプロジェクトからの支援を受けている。