DNAクローニングとアセンブリー メソッドとプロトコル
DNA Cloning and Assembly

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ケビン・マッカーナン、SV40、DNA混入

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Contents

DNA Cloning and Assembly

シリーズエディター

ジョン・M・ウォーカー

ハートフォードシャー大学生命医科学学部英国ハートフォードシャー州ハットフィールド市

35年以上にわたり、生物科学者は絶賛されたMethods in Molecular Biologyシリーズの研究プロトコールと方法論に信頼を寄せていた。このシリーズは、バイオメディカルプロトコルの出版において標準となったステップバイステップのプロトコルアプローチを最初に導入したものである。各プロトコルは、再現性の高いステップバイステップで提供され、序論、実験に必要な材料や試薬のリストで始まり、詳細な手順が続き、ヒントやコツ、トラブルシューティングのアドバイスを提供する役立つノートセクションでサポートされている。これらの特徴は、Methods in Molecular Biologyシリーズの編集者であるJohn Walker博士によって導入されたもので、Methods in Molecular Biologyシリーズの各巻に共通する重要な要素となっている。本シリーズのプロトコルはすべてPubMedにインデックスされている。

スニル・チャンドラン、ケビン・W・ジョージ編著

Amyris, Inc, Emeryville, CA, USA.

エディター Sunil Chandran Amyris, Inc.

米国カリフォルニア州エメリービル

Kevin W. George Amyris, Inc.

米国カリフォルニア州エメリービル

分子生物学的方法

序文

生物学は、その分子の多様性、複雑なシグナル伝達のカスケード、そして環境に適応するための独自の様式を持つさまざまな生物において、ほぼ無限に広がっている。科学者たちは、さまざまな目的のためにこれらの生物学的システムをエンジニアリングすることに多大な進歩を遂げ、その結果、複数の分野にまたがるインパクトのあるソリューションが生まれた。これらの解決策に共通するのは、DNAを操作し、生体システムから反応を引き出すような形で設計する必要があるということである。DNAアセンブリーとは、2つ以上のDNAパーツを結合して目的の構造体を作ることで、おそらく最も一般的なDNA操作である。DNAアセンブリーの最も基本的な方法は、1つのDNAパーツを生物特有のベクターにクローニングすることである。このような単純なDNAアセンブリは何十年も行われていたが、生物工学の範囲が拡大するにつれて、複雑な機能をコードする、より大きく複雑なDNAアセンブリを構築することが必要になっていた。このようなDNA集合体は、現代の生物工学で必要とされる迅速なプロトタイプ作成、試験、反復作業を容易にするために、高い精度で、できるだけ効率的に生成する必要がある。このような要求に応えるため、過去10年間で、幅広い機能性をカバーするDNAアセンブリの手法と標準が爆発的に普及した。本書では、効率性、品質、複雑性に重点を置き、過去10年間に開発された革新的なDNAアセンブリ法の多くについてプロトコルを紹介する。本書は4つのパートに分かれており、DNA集合体の構築を設計・追跡するための計算ツール(パートI)、DNA構築物のハイスループットな組み立てを可能にするワークフロー(パートII)、DNA集合体の標準化ツールキットと特性化パーツ(パートIII)、パスウェイ全体の構築と最適化を可能にする組み合わせソリューション(パートIV)が取り上げられている。

第I部では、ユーザーが迅速かつ効率的にアセンブリを設計し、研究室のワークフローを計画できるようにする計算機ソリューションについて説明する。第1章では、Ernst Oberortnerらが、JGIが開発した多様なBiological Computer-Aided Design and Manufacturing (bioCAD/CAM) ツールを解説している。これらのツールの威力を示すために、著者らは、マルチジーン生合成経路の設計、階層的アセンブリ、および検証のための完全なワークフローを共有している。第2章では、Michael FeroとTeselaGenのチームが、選択したアセンブリ手法に基づき、堅牢で自動生成されたプロトコルをユーザーに提供する高度なデザイン/プランニングツールであるj5について説明している。第3章では、ポツダム大学のLena HochreinとFabian MachensがAssemblXツールキットを紹介する。このツールキットは、ソフトウェアプログラムと新しいクローニング法を統合し、あらゆる発現ホストに対応するDNAアセンブリの合理的なプロトコルを提供する。この方法は、最大25の機能ユニットの組み立てに使用されており、各ステップをガイドするAssemblXウェブツールが含まれている。

アセンブリが設計され、プロトコルが確定されると、次のステップはアセンブリに必要なパーツの生成、パーツの組み立て、そして最後に組み立てられた構築物の同一性を確認することである。第2部第4章から第6章では、Amyris社のDavid Reif、Kristy Ip、Ron Yadin、William Christieが、PCRで何千ものDNAパーツを同時に生成し、これらのパーツを酵母の相同組換えを用いて複雑なDNA構築物に組み上げ、高度な多重化NGSワークフローでこれらのDNAアセンブリを検証する方法について述べている。これらのプロトコルは、一般的な合成生物学のワークフローに適用可能であり、ハイスループット業務の確立に関心のある読者にお勧めの内容である。

第III部では、様々なDNAアセンブリー法を包括的にまとめ、効率性、スループット、複雑性などの点で各々がユーザーに独自の利点を提供する。第7章と第8章では、Sylvestre Marillonnet氏らが、今やどこにでもあるGolden GateとModular Cloning(MoClo)アセンブリシステムの最新プロトコルを紹介している。これらのプロトコルは、DNAアセンブリーにおけるIIS型酵素の使用を普及させ、本巻で紹介する多くのツールキットの基礎となった。Ramona Gru¨tzner は、第7章でGolden Gateを用いたMoClo標準パーツの生成について説明し、Stefan Wernerは第8章でこれらのパーツを複雑なマルチ遺伝子構築物に組み立てるプロトコルについて説明している。第9章では、オックスフォード大学のChristopher A. O’CallaghanとDa Linが、大規模なDNAコンストラクトを階層的にモジュール化するために単一のタイプIIS酵素を使用する柔軟なアセンブリ手法であるMetCloを紹介している。この方法の主な特徴は、「メチル化スイッチング」を用いることで、IIS型酵素の認識部位がメチル化され、IIS型制限酵素に認識されなくなることである。この技術革新により、モジュール部品設計にありがちな配列の制約がなくなり、DNAアセンブリ設計の柔軟性が高まった。第10章では、エディンバラ大学のMaryia Trubitsynaらが、経済的で柔軟性のある組立方法であるPaperClipを取り上げ、組立反応に複数のフォーマットで保存された様々なDNAパーツを使用することができる。パーツは任意の順序で組み立てることができ、組み立てを指示するオリゴヌクレオチドは、与えられたパーツを含むあらゆる組み立てに再利用することができる。第11章と第12章では、Phytobricks規格に依存する方法について説明する。第11章では、ニコラ・パトロンとアールハム研究所のチームがPhytobricks規格について述べている。Phytobricksは標準化された植物由来のDNAパーツで、様々なIIS型制限酵素依存のアセンブリー法に対応している。本章では、新しいPhytobricksパーツの設計と構築のためのプロトコルと、それらをマルチ遺伝子コンストラクトに組み立てるためのプロトコルを説明する。この方法の主な特徴は、標準化されたオーバーハングを使用することで、他の適合するパーツとの新しいアセンブリにおいて、DNAパーツを修正することなく再利用できることである。本章では、最新のナノスケール液体処理ロボットを用いたハイスループットなアセンブリとシーケンスの手法も紹介する。第12章では、エディンバラ大学のAndreas I. AndreouとNaomi Nakayamaが、Phytobricks標準と最小限のベクターツールキットに基づくDNAパーツを利用する方法であるMobius Assemblyについて述べている。また、このプロトコルは、ポジティブなアセンブリを特定し、効率を向上させるために、発色性in vivoスクリーンを組み込んでいる。第13章では、インペリアルカレッジのGeorge TaylorとJohn Heapが、Start-Stopアセンブリ法を用いたマルチジーンライブラリーの設計と構築のためのプロトコルを解説している。この方法の主な特徴は、パーツ間の「傷のない」接合部を生成することで、mRNAの構造や機能に対する不要な変化を回避することである。また、Start-Stopの合理的なアセンブリ階層は、非モデル生物へのDNAアセンブリの移植を容易にする。第14章では、Marko StorchとImperial Collegeのチームが、標準化された18bpのフランキング配列を利用し、4パーツアセンブリで99%の成功率を提供するBASICアセンブリメソッドの詳細を紹介している。BASIC規格でフォーマットされたDNAパーツは、アセンブリのどの位置にも、どのような文脈でも配置することができ、ユーザーにモジュール性と柔軟な設計を提供することができる。最後に、第15章では、エディンバラ大学のMarcos Valenzuela-OrtegaとChristopher FrenchがJUMPプラットフォームについて述べている。JUMPベクターは、Standard European Vector Architectureに準拠し、モジュール式クローニングシステムにおけるいくつかの制限を克服するように設計されている。設計上の重要な特徴の一つは、直交する二次クローニングサイトの存在であり、これによりユーザーはベクターバックボーンを目的の用途に合わせて容易に変更することができる。

第IV部では、経路の発現を微調整し、あらゆる標的分子の収量を向上させるためにそのフラックスを最適化するために開発された方法について述べる。第16章では、Gita NaseriとBernd Mueller-Roeberが、酵母におけるパスウェイ遺伝子の発現を微調整するために一連の誘導性植物人工転写因子を利用する、配列に依存しないスカーレスアセンブリ法であるCOMPASSの詳細プロトコルを提供している。この方法は大規模なコンビナトリアルライブラリーを生成することができ、またCRISPR/Cas9システムと結合してワンステップで多座ゲノム統合を行うことができる。最後に、17章では、Yizhi CaiらがSCRaM-bLEを紹介している。この方法は、酵母ゲノム上のすべての非必須遺伝子の下流に導入された数千のLoxPサイトに依存するものである。この構造により、Cre-LoxPsym組換えシステムによる複数のゲノム再配置が可能となり、異種発現経路を持つ菌株に適用すると、潜在的に改良された生産菌株を何千も生成することができる。

本書で紹介するツールや方法は、合成生物学が直面する最も差し迫った課題を解決するための複数のボトルネックに対処するものである。これらの方法は、単独で使用することも、研究者の要求に応じて革新的な方法で組み合わせることも可能であり、読者のみなさんには、自身の用途に合わせてこれらのツールを微調整していただくことをお勧めする。合成生物学に特化した自動化ツールやソフトウェアツールはこの10年で急速に進歩し、世界中のバイオファウンドリーが自社のプラットフォームで展開するために1つまたは複数の方法を選択することができる。

これらのプロトコルをまとめ、どのような実験環境でも適用できるような知識を共有してくださった貢献者の方々に感謝いたします。

米国カリフォルニア州エメリービル Sunil Chandran

ケビン・W・ジョージ

目次

  • 前書き
  • 寄稿者
  • パートI DNAの設計と組み立てのためのインシリコツール
    • 1 コンピュータ支援設計と製造の統合
    • 合成生物学のためのワークフロー
    • 2 TeselaGen DESIGNモジュールとj5を用いたコンビナトリアル-ヒエラルキーDNAライブラリーデザイン
    • 3 信頼性と使いやすさを追求したAssemblXツールキット マルチジーンアセンブリー
  • パートII ハイスループットワークフロー
    • 4 DNAパーツ生成のためのハイスループットPCR
    • 5 酵母ホモロガスによるハイスループットDNAアセンブリーリコンビネーション
    • 6 高多重化、半自動化されたNextera Next-Generation シーケンサー(NGS)ライブラリー調製
  • パートIII DNAアセンブリー標準
    • 7 Golden GateクローニングによるMoClo標準パーツの作製
    • 8 モジュラーを用いた多遺伝子コンストラクトのアセンブリクローニングシステムMoClo
    • 9 MetCloを用いた階層的モジュラーDNAアセンブリ
    • 10 PaperClip DNAアセンブリ: リデュース(削減)、リユース(再利用)、リサイクル(再資源化)
    • 11 ファイトブリック植物工学のための構築物の手動および自動アセンブリ
    • 12 メビウス組立
    • 13 Start-Stop Assemblyを用いた多タンパク質発現コンストラクトおよびコンビナトリアルライブラリーの設計と実装
    • 14 BASIC:シンプルで正確なモジュール式DNAアセンブリー法
    • 15 ジョイントユニバーサルモジュラープラスミド:のための柔軟なプラットフォーム あらゆる微生物宿主でのゲートアッセンブリー
  • パートIV パスウェイ最適化のためのコンビナトリアルメソッド
    • 16 コンビナトリアル遺伝子組立てのための合成生物学ツール「COMPASS」のステップバイステッププロトコル
    • 17 SCRaMbLE-in: 合成酵母における異種経路の多様化と収率向上のための高速かつ効率的な方法。
  • インデックス

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