Construction of a Human Cell Landscape of COVID-19 Infection at Single-cell Level
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8139199/
オンラインで公開 2021 年 6 月 1 日
概要
COVID-19は世界的に大パンデミックしており，小児と成人で異なる臨床パターンを説明することが求められている。本研究では，COVID-19に感染しやすい臓器・細胞タイプと，臨床症状に関連する5つの因子（ACE2, TMPRSS2, MTHFD1, CTSL, CTSB）の年齢別の発現パターンを明らかにすることを目的とした。本研究では、ヒトの成人および胎児の複数の臓器におけるCOVID-19の宿主依存因子5つの発現量を解析した。その結果、リスクのある臓器をグレード分けすることができ、また、上述の各臓器における標的細胞の種類を指摘することができた。これらの結果に基づいて、人体におけるCOVID-19の5つの因子の発現レベルの臓器および細胞タイプ特異的な脆弱性マップを構築し、COVID-19の感染や傷害による非呼吸器系の症状を含む症状の背後にあるメカニズムを解明することができた。また、COVID-19因子の発現パターンの違いから、成人と子供・幼児の臨床パターンの違いを説明することができた。
キーワード
COVID-19, SARS-CoV-2, シングルセルRNA-Seq, ACE2, TMPRSS2
2019年末に出現したCOVID-19は，現在，世界的なパンデミックを引き起こしている[1, 2]。COVID-19の感染を媒介するウイルスとして、SARS-CoV-2が実証されている[1-3]。SARS-CoV-2は、ACE2,TMPRSS2,CTSL、CTSBなどの宿主依存因子を介してヒト細胞に侵入することが報告されており、これらの因子はいずれもSARS-CoV-2の受容体である[4-8]。これらのSARS-CoV-2受容体に加えて、最近では、MTHFD1がウイルスの複製に重要であることが示されている[9]。肺が第一の標的である一方、ウイルスはその後、心臓や血管、腎臓、腸、脳などの臓器に侵入し、損傷を与える[3-7]が、COVID-19の感染に脆弱な細胞の種類はまだ明らかになっていない。また、小児・乳児と成人の間で異なる臨床パターンを説明することも求められている。
本研究では，COVID-19に感染しやすい臓器・細胞タイプと，臨床症状に関連する5つの因子の年齢に依存した発現パターンを明らかにするために，公表されているシングルセルRNA-seqデータを用いて，成人と胎児の両方のヒトの複数の臓器（腸，腎臓，肺，肝臓，心臓など）の異なる細胞タイプにおける5つのCOVID-19宿主依存因子の発現レベルを解析した[10, 11]。
まず，全臓器のRNA-seq解析の結果，TMPRSS2とACE2は，それぞれ前立腺と精巣関連の組織・細胞で高発現していることがわかった（補足図1A, B）。また、ACE2は小腸、三叉神経節、骨格筋にも高発現していた。CTSLとCTSBは、胎盤、子宮体部、胎児の肺、甲状腺、CD71+赤血球前駆細胞に高発現しており、MTHFD1は胸腺、肝臓などの臓器やいくつかの種類の細胞に高発現していた（補足図1D、E）。さらに、ヒト成人の消化器系のさまざまな部位から得られたscRNA-seqデータを調べた（補足図2A-H）。その結果、成人の上行結腸、十二指腸、上行結腸、横行結腸では、腸細胞ではなくパネス細胞が最大の割合を占めているという興味深い現象を発見した。成人の消化器系では、空腸、直腸、S状結腸で腸細胞が優勢であった（補足図3A、補足図4A、補足図5A）。TMPRSS2は、ミエロイド細胞とニューロン細胞を除いて、成人の腸内のほとんどの種類の細胞で陽性に発現していた。また、ACE2は成人腸管の多くの細胞型で発現している。MTHFD1は、従来のDC、腸管グリア細胞、ミエロイド細胞を除き、より広い範囲で発現している。CTSBは全ての細胞種に発現しており、成人腸内の免疫細胞（DC、マクロファージ、ニューロン細胞）に高発現しているのに対し、CTSLはCD8+T細胞には発現が見られなかった（補足図3A、補足図5A）。TMPRSS2の発現量は、炎症を起こした上皮細胞や杯細胞に濃縮されていた。また、ACE2の発現は、腸管系の上位2種類の細胞であるパネス細胞と腸細胞に集中していた。MTHFD1の発現レベルは、増殖中のB細胞、神経細胞、腸細胞前駆細胞に濃縮されていた。CTSLとCTSBの発現レベルはともに、ストローマ細胞、ニューロン、骨髄系細胞、マクロファージに濃縮されており、CTSBはDCsと従来型DCsにも濃縮されていた（補足図3A）。興味深いことに、これらの因子のほとんどは腸細胞や杯細胞で共発現しており、腸細胞や杯細胞がCOVID-19感染の標的として考えられ、腸がハイリスクな器官であることを示唆している（補足図3A, B; 補足図6A, B）。胎児の腸では（補足図2 I)成人の十二指腸と空腸ではそれぞれ腸細胞のサブタイプである腸細胞-APOA4 highに高発現のACE2レベルが検出された。胎児腸では、新たに腸細胞前駆細胞とリンパ管内皮細胞が検出され（Supplementary 図2I; Supplementary 図5A, B; Supplementary Table 2)ゴブレット細胞、腸細胞、増殖細胞は、胎児の腸の方が成人の腸よりもACE2の発現量が多いことがわかった（Supplementary 図3A, B; Supplementary 図5A, B）。このことから、胎児の腸も成人の腸と同様にリスクの高い臓器であり、さらにリスクのグレードも高いが、感染ターゲットは成人のパネス細胞や腸細胞ではなく、異なるものであることがわかった。また、これらの因子はB細胞や抗原提示細胞などの抗体関連細胞に濃縮されており、胎児が感染に対して異なる免疫反応を示すことを示唆していると考えられる（補足図3A、B、補足図6B）。
図1 リスクのある成人および胎児の臓器を格付けする
各臓器における各遺伝子の発現割合を基にしたランキングである。ランク1は最も発現割合が高く、最もリスクが高いことを示す。総合ランキングは、個々のランキングの平均値である。
また、3人の成人ドナーと4人の胎児ドナーの泌尿器系の腎臓のscRNA-seqデータを解析した。その結果、成人ドナーと胎児ドナーの両方で、間充織細胞にTMPRSS2の発現が濃縮されていることが検出されたが、成人ドナーではIC-tran-PC細胞のみTMPRSS2の発現が濃縮されていた（補足図2J, K; 補足図3C, D, 補足図4B, G; 補足図6C, D）。ACE2, MTHFD1, CTSL, CTSBの発現は、いずれも近位尿細管細胞に集中している。また、CTSLとCTSBは骨髄系細胞、マクロファージに、CTSBは上皮系細胞、DC、従来型DC、B細胞にそれぞれ多く発現していた。共発現解析の結果、近位尿細管細胞と間充織細胞では、これらの因子の組み合わせがより多く共発現している可能性が示された。さらに、近位尿細管細胞と介在細胞は、細胞集団の主要部分を占めている（補足図4,補足図6）。したがって、近位尿細管細胞と介在細胞は、成人の腎臓を高リスクにするターゲットと考えられる（補足図5C、補足図6C、D）。成人腎と比較して、胎児腎では、TMPRSS2は、尿細管間充織細胞や遠位尿細管前駆細胞に濃縮されるほか、尿管上皮細胞にも濃縮される（補足図5C）（補足図4G、補足図5D、補足図6D）。また、近位尿細管前駆細胞ではACE2の高い発現が見られたが、TMPRSS2とMTHFD1は他の細胞種でのみ陽性発現していた。これは、胎児期の腎臓では、受容体や細胞の種類によって発現パターンが異なることを示している（補足図5D、補足図6D）。最後に、成人の腎臓ではB細胞がCTSBを高発現していたが、胎児の腎臓ではB細胞が検出されなかった（補足図4B、G、補足図5D、補足図6D）。共発現解析の結果、成人腎でも胎児腎でも近位尿細管細胞がウイルス誘引の標的となっていることがわかった（補足図5D、補足図6D）。
ACE2の発現は、成人の肺ドナー3人と胎児の肺ドナー2人のすべてにおいて、概して低かった（補足図2L-M;補足図5E、F）。成人の肺組織でも胎児の肺組織でも、ACE2陽性細胞はほとんど検出されなかった。さらに、肺感染症の「推定メカニズム」として説明されているAT1細胞でのACE2レベルの発現は、成人ドナーではかなり低く、胎児ドナーではAT1細胞もAT2細胞も見られなかった（補足図4C, H; 補足表2）。一方、成人の肺では、AT1,AT2およびその他の細胞タイプで高いTMPRSS2の発現が検出されたが（補足表2)胎児の肺ではほとんどの細胞タイプでTMPRSS2の発現が検出されなかった（補足図5E、F）。成人肺では、TMPRSS2の発現は巨核球と骨髄系細胞を除くすべての細胞種で、MTHFD1の発現は気管支軟骨細胞、繊毛細胞、間質細胞を除くすべての細胞種で陽性であった。CTSLとCTSBは共に成人肺の全ての細胞種で発現している（補足図3E;補足図5E）。ACE2などを共発現している細胞はなかったが、遠位前駆細胞はTMPRSS2やMTHED1,CTSL、CTSBなどを共発現していた。また、MTHFD1-CTSLとMTHFD1-CTSBの共発現は、成人肺の多くの細胞種で検出された（補足図6）。これらのことから、ACE2はCOVID-19感染の鍵となる因子（または唯一の因子）ではなく、TMPRSS2やMTHFD1などの他の因子（さらには他の補因子）の高発現がCOVID-19感染の標的となり、成人肺をハイリスク臓器としていると考えられる。また、成人および胎児の肺組織では、様々な種類の細胞でMTHFD1の発現が確認された（補足図3E, F）。胎児の腎臓と比較して、成人の肺ではTMPRSS2が普遍的に発現しており、CTSLとCTSBの発現・共発現レベルが高いことから、成人の肺は胎児よりもハイリスクな臓器であると考えられる。第二に、成体の肺間充織細胞（心肺前駆細胞）の多くが因子を発現していることから、成体は胎児や乳児よりもウイルス感染に対して脆弱であることがわかった（補足図3E, F; 補足図4C, H）。さらに、これらの因子は、マクロファージや巨核球・赤血球前駆細胞に共発現していたことから、免疫細胞もウイルス感染の標的となったり、いわゆるマクロファージ活性化症候群（MAS）を引き起こすサイトカインストームに関与している可能性が示唆された（補足図5E、F、補足図6E、F）。
MTHFD1は、3人の成人肝ドナーの肝細胞に発現しており、好中球、エフェクターT細胞、単球、T細胞など多くの免疫細胞に陽性であった（補足図2N, O; 補足図3D, I; 補足図4D, I; 補足図5M, N）。一方、成人および胎児の肝臓では、上皮細胞以外に、ACE2もTMPRSS2も発現しておらず、肝臓はACE2やTMPRSS2ではなくMTHFD1が高発現していることから、ハイリスク臓器であることが示唆された。CTSLとCTSBの発現は、腸、腎臓、肝臓と同様に、肝臓でもすべての細胞タイプに広く分布していた（補足図5G, H）。共発現解析の結果、洞内皮細胞と上皮細胞が、COVID-19感染に脆弱な成人肝の標的であることが明らかになった（補足図3G、H、補足図6G、H）。肝類洞内皮細胞（LSEC）は、血液細胞と肝細胞および肝星状細胞との境界に位置する、高度に特殊化した内皮細胞である。LSECは伝染性のあるバリアーを形成している。このことは、COVID-19の成人患者の肝不全を、小児や乳児の患者よりもよく説明できるだろう。最後に、ほとんどの因子が成人の肝細胞ではなく、内皮細胞や上皮細胞に濃縮されていることがわかった（成人に特異的で大きな割合を占める）。これは、成人が乳児よりもCOVID-19感染に弱い理由が内皮細胞や上皮細胞にあることを示しているのかもしれない（補足図3D, I; 補足図5G, H; 補足図6G, H）。
TMPRSS2を発現している細胞は皆無であり、成人2名と胎児2名の心臓ドナーにおいてACE2を陽性に発現していたのは、線維芽細胞、心筋細胞、好中球など数種類の細胞のみであった（補足図2P, Q）。免疫細胞以外にも、CTSLとCTSBはともに心室心筋細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、アポトーシス細胞にも富むことがわかった（補足図3I、J）。心室心筋細胞（胎児に特異的で、その割合が最も高い）と胎児の増殖細胞に多くの因子が濃縮されていることから、子供や幼児もCOVID-19の犠牲になる可能性があることを示していると考えられる。また、成人の心臓では線維芽細胞が最も多くの因子を含んでいることから、線維芽細胞がウイルスの標的となり、成人の心臓がCOVID-19の感染に弱くなっている可能性がある（補足図6I, J）。
以上の結果から、各臓器における標的細胞の種類を特定することができ、また、リスクのある臓器を格付けすることができた（図1）。総合ランキングは、個々のランキングの平均値である。総合ランキングから、成人と胎児の肝臓と腎臓は同じリスク値を共有しており、COVID-19感染のリスクが最も高いのは腎臓であることがわかった（肝臓ランク値3,腎臓ランク値1,ランク1が最もリスク値が高く、ランク7が最もリスク値が低い）。胎児の腸と心臓は成人のそれよりもCOVID-19に感染しやすく、胎児の腸は胎児の腎臓と同様に、どちらも感染のリスクがトップである。成人の肺は、CTSLとCTSBの発現がはるかに高く、ACE2の発現がわずかに高いことから、感染しやすい。また、COVID-19因子（TMPRSS2,ACE2,MTHFD1,CTSL、CTSB）の発現パターンの違いは、成人と小児・幼児の臨床パターンの違いを説明できることを示している。
この結果から、リスクのある臓器を分類することができ、上述した各臓器における標的細胞のタイプを特定することができた。胎児と成人の臓器や細胞タイプを比較すると、胎児の腸の腸細胞細胞の様々な亜集団におけるACE2とTMPRSS2の発現レベルが低いこと、胎児の腎臓の間充織細胞の様々な亜集団におけるACE2の発現が低いこと、胎児の肺のほとんどの亜タイプの細胞でACE2が発現していないことが、乳児のリスク低下を示す主要な要因である可能性が示唆された。
これらの結果をもとに、COVID-19の5つの因子（TMPRSS2,ACE2,MTHFD1,CTSL、CTSB）の人体における発現レベルの臓器・細胞型特異的な脆弱性マップを構築し、COVID-19感染症や傷害による非呼吸器症状などの症状の背後に隠されたメカニズムを解明した。また、COVID-19因子の発現パターンの違いは、成人と子供・幼児の臨床パターンの違いを説明するのにも有効であると考えられる。
以上、本研究では、COVID-19感染症に関連するヒトの脆弱な器官をシングルセル解析に基づいて概観した。本研究では、COVID-19の受容体であるACE2,TMPRSS2,およびウイルス複製の鍵となる酵素であるMTHFD1の特定の細胞タイプにおける発現レベルに応じて、脆弱な臓器を解明し、胎児と成人の臓器を高リスクと低リスクに層別化することに初めて成功した。また、成人と胎児では受容体の発現レベルが異なることを調べた。この発見は、成人がCOVID-19感染症にかかりやすく、COVID-19肺炎患者に見られる下痢や多臓器不全などの非呼吸器系症状が発生しやすい理由を説明するものと思われる。