SARS-CoV-2 RT-PCRにおけるサイクル閾値(Ct) ガイダンス

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Guidance Cycle threshold (Ct) in SARS-CoV-2 RT-PCR

www.gov.uk/government/publications/cycle-threshold-ct-in-sars-cov-2-rt-pcr

Published 28 October 2020

重要なメッセージ

サイクル閾値(Ct)は半定量的な値で、RT PCRによる検査後の患者サンプル中のウイルス遺伝物質の濃度を低、中、高のいずれかに大別することができる。

低Ctはウイルス遺伝物質の濃度が高いことを示し、これは一般的に感染性のリスクが高いことと関連している。

高Ctはウイルス遺伝物質の濃度が低いことを示し、一般的には感染性のリスクが低いことと関連している。上気道サンプルの場合、高 Ct は感染リスクが高いシナリオ(例えば、早期感染、不適当な採取、劣化したサンプルなど)を表すこともある。

臨床的な背景がない場合の単一のCt値は、その人の感染性についての決定は信頼できない。

Ct 値は、異なるタイプのアッセイ間で直接比較することはできない – すべての検査室が同じアッセイを使用しているわけではないし、複数のアッセイを使用している検査室もある。

RT-PCRとは何か?

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、酵素を用いた増幅の生化学的プロセスを通じて特定の遺伝物質の存在を識別するために使用することができ、特定の標的の認識に基づいている。遺伝物質にはDNAとRNAがあるが、RT-PCRで検出されるのはRNAである。SARS-CoV-2はRNAゲノムを有する。RT-PCR の主な利点は、非常に少量の病原体 RNA を非常に短時間で検出できることにある。したがって、RT-PCR は臨床診断のスピードと感度に革命をもたらし、技術的な専門知識の必要性を低減した自動化を用いて大規模なスループットでの検査に適応することができる。RT-PCR の最新のアプリケーションでは、リアルタイム RT-PCR として知られている各段階で反応をモニターすることができる。

RT-PCR はどのように実行されるのか?

分子生物学における最も重要な科学的進歩の一つとしてしばしば紹介される PCR は、DNA の研究に革命をもたらし、その生みの親である Kary B. Mullis は 1993 年にノーベル化学賞を受賞した。SARS-CoV-2 RT-PCRの最初のステップは、ウイルスRNAをサンプルから抽出して精製、安定化、濃縮し、少量のウイルスを含むサンプルの検出を高めることである。精製された抽出物は、以下を含む生化学反応混合物に添加される。

  • プライマー – ターゲットとなる生物のゲノムの一部と一致する短い核酸の伸張。
  • ヌクレオチド塩基
  • 反応を開始し、完了させるための酵素
  • 蛍光標識されたプローブ – 反応生成物(反応指示薬)を認識して付着する核酸の短い鎖。

プライマーはウイルス核酸の標的領域に付着し、酵素がヌクレオチドを付加して相補的DNA(cDNA)鎖を伸長させることができる。サンプル反応混合物は、ウイルス標的のコピーが1サイクルあたり2倍になるように、繰り返し熱サイクルにさらされ、指数関数的に上昇する。標識されたプローブは、新たに合成された標的の存在下で蛍光シグナルを発する。指数的上昇が早く起こるほど、サンプル中のウイルス量が多くなる。

図 1 は、RT-PCR 後の実行解析のステージを示している

RT-PCRアッセイ

英国全土で使用されている多くの異なるSARS-CoV-2 RT-PCRアッセイ/プラットフォームがある。各アッセイは、わずかに異なる検出限界(LoD)すなわちアッセイによって確実かつ一貫して検出できるウイルスの最低濃度を持ち、地域の取り決めに従って構成される。RT-PCRの中には、単一の遺伝子標的を同定するように設計されているものと、複数の標的を検出するものがある。複数の標的を検出するものは、結果を解釈する際に、より確実性を与えることができる。遺伝子標的間の結果の不一致は、特に市販のアッセイが使用されており、生データにアクセスできない場合には、解釈の不確実性につながる可能性がある。複数の標的を持つ高度に複雑なアッセイでは、非特異的な検出が起こりやすく、不正確に陽性と報告されることがある。

図 2. 最も一般的なRT-PCRターゲットが強調表示されたSARS-CoV-2のゲノム

RT-PCRは、サンプル中のウイルス遺伝物質の存在を検出するが、感染性ウイルスが存在するかどうかを区別することはできない。上気道スワブ中の無傷のウイルスの量は、実験室の方法に内因性および外因性の要因によって影響を受ける。

実験室外因性因子
  1. サンプル収集の妥当性。
  2. 採取場所のウイルス量。
  3. 阻害剤の存在。
実験室の内因性因子
  1. 試料採取バッファー/メディウムの総量。
  2. 試料調製方法(加熱法、溶解法)。
  3. RT-PCR プロセスの各ステップで使用した実験用試薬の量。
  4. 選択した RT-PCR アッセイ

Ct値とは何か?

サイクル閾値(Ct)は、蛍光シグナルがバックグラウンドの蛍光シグナルを超えて陽性の閾値を通過する熱サイクル数として定義することができる(図1,5ページ)。

典型的なRT-PCRアッセイでは、最大40回の熱サイクルを持つことになる。Ct値が低ければ低いほど、サンプル中のウイルス遺伝物質の量が多くなる(ウイルス負荷の近似的な代理として)。このようにして得られたCt値は半定量的であり、高ウイルス負荷と低ウイルス負荷を区別することができる。Ct値の3ポイントの増加は、ウイルス遺伝物質の量の10倍の減少にほぼ相当する。

いくつかの状況では、Ct値は、元のサンプルの細胞あたりのウイルスコピー数を正確に測定するためのより定量的な技術として使用することができる – しかし、これは、サンプルが検証された標準希釈と一緒にテストされ、綿棒サンプルの細胞含有量の定量と一緒に固定されたサンプル入力があることを必要とする(1,2)。ほとんどの診断検査室では、呼吸器系のウイルス綿棒のためにこの定量化を日常的には行っていない – 定量PCRは、血液中のウイルス負荷の測定ではより一般的である。

Ct値は、感度(検出限界)試薬の化学的性質、遺伝子ターゲット、サイクルパラメータ、分析的解釈法、サンプル調製および抽出技術のばらつきにより、異なるタイプのアッセイ間で直接比較することはできない。さらに、Ct 値は、すべての SARS-CoV-2 分子検出法について提供されているわけではない。いくつかの市販の RT-PCR 技術は、操作者がリアルタイムで反応を観察することができず、結果はソフトウェアによって質的に非干渉的な陽性または陰性の結果に解釈されるクローズドな「ブラックボックス」システムである。

上気道スワブからの Ct 値の解釈

以下の模式図(https://new-learning.bmj.com/course/10065426 からの引用)は、SARS-CoV-2 RNA(青い線で示されている)の検出を示している。感染に関連した症状の発症とウイルス遺伝物質の検出のタイミングは人によって異なるが、大まかにはこの表現の範囲内に収まっている。

図3. 感染症における SARS-CoV-2 RNA の検出時期

Ctが高い陽性結果の臨床的意義は、病歴や背景がない場合には解釈が困難である。ウイルス負荷が低い(Ctが高い)陽性結果は、感染の初期(人が感染を媒介するようになる前)や、感染のリスクが低い感染後期(赤い点線で示された期間)に見られることがある。しきい値(Ctカットオフ)は、特異的な結果を確実にするために設定されているが、一部のアッセイでは不確定領域が設定されており、結果の重要性を判断するためにフォローアップサンプルが必要になる場合がある。これは、解釈の指針となるような臨床情報を持たない検査室や、再分析が不可能な場合に当てはまる。

Ct値が高いことは感染力の低下と関連しているかもしれないが、ある時点で採取された綿棒だけでは、病気の経過やその後の経過についての情報は得られない。

Ct値は、症状のない人(無症候性)と症状のある人では似たような値を示すことが観察されている(3)。無症状の人では、いつから感染したのか、どのような病気の段階にあるのかがわからないことが多く、それゆえに感染リスクがあることがわかっていない。実験室の細胞培養において、高Ct(>36)を示すサンプルから、生きたウイルスや感染の可能性のあるウイルスが分離されているが、これが人から人への潜在的な感染リスクをどの程度示唆しているのかは完全には理解されていない。

高Ctを示す可能性のある幅広いシナリオの例を以下に詳述する。

  • 感染リスクが不明な無症候性感染(いつ感染したのか、どのような病期にあるのかが不明なことが多い)。
  • 無症候性感染症の前に発症し、その後、高ウイルス負荷と感染性を伴う症候性感染症に発展した場合。
  • 感染性のリスクが高い急性COVID-19の間に不適切に採取された、または劣化したサンプル(最適以下のサンプル保管・取り扱い技術)。症状のある人は発症後10日以内に、無症状の人は綿棒検査の結果が陽性であった後10日間は感染の可能性があると仮定すべきである – COVID-19のコミュニティ症例の自己隔離に関するガイダンスは[6]に記載されている。
  • ウイルス負荷の減少に伴う感染の回復期。非感染性である可能性の高いウイルス遺伝物質の長期検出がSARS-CoV-2で観察されている。初発病後に再検査を受けた医療およびソーシャルケアの現場での PCR 陽性結果の解釈に関するガイダンスは [7] に記載されている。
  • 免疫不全の人や入院している人で、より重度の病気を患っている人は、潜在的に感染性のあるウイルスの排出が長くなる可能性がある(4)。
  • 病院での感染予防策のステップダウンと退院のためのガイダンスは[8]に記載されている。複雑な症例では、検出可能な中和抗体の存在が感染リスクの低下を裏付けるかもしれない。
  • 下気道重症COVID-19疾患(研究では、重症急性疾患時の上気道のウイルス負荷が下気道に比べて低いことが示されている(5)。

まとめ

  • Ct は患者サンプル中のウイルス遺伝物質の濃度を示す半定量的な指標である。
  • 検査室の観点からは、Ct 値は、直線性、検出限界、標準定量曲線が保証されている場合にのみ報告され、臨床的な解釈と処置に適用されるべきである。
  • Ct 値はアッセイ間で直接比較できるものではなく、使用中のいくつかの RT-PCR プラットフォームでは報告されない場合がある。単一の陽性 Ct 値を感染経過のステージング、予後、感染性、または回復の指標として解釈するには、臨床病歴に関する文脈を考慮しなければならない。
  • Ct値が低い(ウイルス負荷が高い)場合は、急性疾患と高い感染性を示す可能性が高い。
  • Ct値が高い(ウイルス負荷が低い)のは、いくつかの臨床シナリオに起因する可能性があり、それによって感染性のリスクが軽減される可能性があるが、解釈には臨床的な背景が必要である。
  • 連続的なCt値の方が解釈には有用であるが、一般的には感染管理の目的ではなく、臨床管理の目的で病院でのみ実施される。
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