超低用量と生物学的増幅 アボガドロ数に迫る

オフラベル、再利用薬低用量ナルトレキソン(LDN)

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Ultra low doses and biological amplification: Approaching Avogadro’s number

pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34157423/

要約

本論文では、10-18から10-24Mの濃度(例えば、アボガドロ定数(6.022×1023/モル)に基づいて物質/細胞の1原子または1分子に近づくか、あるいはそれ以下)の多様な化学物質を超低用量で投与すると、単細胞生物からヒトまでのさまざまな生物種において、受容体や細胞内のシグナル伝達系に作用して再現性のある効果を引き出すことができることを示す証拠を紹介している。複数の実験的研究により、たった1つまたはごく少数の分子で、増幅メカニズムやプロセスのカスケードを介して細胞や生物全体を活性化できることが示されている。例えば、超低用量のリガンドを用いた実験では、1つの細胞だけでなく、平均して3,000~25,000個の隣接する細胞を約50%活性化することができた。このような細胞や生物全体の活性化は、通常、ホルミシス的な二相性の用量反応を示す。これらの結果は、多数の多様な系統の生物が、生存機能を高めるために高感度の検出およびシグナル伝達機構を進化させてきたことを示している。例えば、感染体に対する防御、様々な種類のフェロモンコミュニケーションに対する応答(例:警報、性的誘引)、複数の種類の細胞保護/耐性プロセスの発達などである。このことは、超低用量の影響が、これまで認識されてきたよりもはるかに一般的であることを示唆している。このような知見は、進化論、生態学、システム生物学、そして臨床医学にとって重要な意味を持つと考えている。

1. はじめに

系統発生的に、細胞や生物のシグナル伝達機構は、用量/濃度-反応関係を最大化するように進化してきた。異なる薬剤(リガンドや環境因子)の濃度範囲による影響は様々であり、受容体に基づくパターンとエンザイマティックなパターンの多くは、それぞれ10 6~10 9 M、10 4~10 6 Mの濃度範囲で作用する(すなわち、相対的な解離定数に基づく)。一般に,低用量とは,作用部位における生理活性物質の濃度が,平衡解離定数よりも1桁以上低いことと考えられてきた[1]。しかし,現在では,はるかに低い濃度(10 18~10 24M)で機能する細胞および生物のシグナル伝達プロセスの証拠がある。これらの観察結果を補強し、さらに発展させたのが、1つの分子が波状のバイスタンダー通信プロセスを介して、数万個の隣接する細胞にまで影響を及ぼすような、重大な生物学的増幅メカニズムの発見である。このような知見を踏まえて、本論文では、超低用量生物学(10 18~10 24 M)の5つの分野、すなわち、マクロファージの活性化、単細胞受容体シグナル、フラーレンの生物学、非常に多様な無脊椎動物のフェロモンのエンドポイント、哺乳類モデルにおける複数の受容体シグナル伝達経路とエンドポイントを明らかにした。これらの生物学的システムにおける超低用量効果は、用量反応パターン/結果、およびメカニズム機能の両方の定量的特徴の文脈で説明され、対処される。

2. 免疫活性化:ファゴサイトーシス

マクロファージは、自然免疫において重要な役割を果たしており、食作用、細胞障害性、炎症性の分子機構を多面的に働かせることで、微生物の脅威に対する初期防御として機能している。様々な種類や大きさのストレスは、マクロファージの貪食能力に大きな影響を与える(すなわち、増加および/または減少する)可能性がある。このようなマクロファージの反応性の変化の多くは、循環しているカテコールアミンや局所の組織のカテコールアミンのレベルの変化によってもたらされる。

マクロファージの活動の変化が注目されるようになったのは、ワオキツネトカゲの冬眠を中断すると、必ず細菌感染により急速に死に至るという初期の観察結果に基づいている。このことから、冬眠解除によるストレスでカテコールアミン(CA)濃度が上昇し、マクロファージの食細胞反応が抑制されて、微生物感染症にかかりやすくなり、死に至るケースが多いのではないかと考えられた。ワタリトカゲを用いた実験では、ドーパミン(DA)、ノルエピネフリン(NE)、エピネフリン(E)といった複数のCAを幅広い濃度(10 15~10 5 M)で投与し、マクロファージの貪食機能に及ぼす影響を調べた。各々のCAリガンドについて、二相性の濃度勾配が見られ、食作用の最大の刺激は試験した最も低い濃度(10 15 M)で発生し、100%の対照群と比較して160%から180%の範囲で刺激があった。CA濃度が高くなると、反応は徐々に低下した。低濃度のNEおよびEによる刺激は、β-アドレナリン拮抗薬を事前に投与することでブロックされた。予想通り、DAはDA-(1型および2型)受容体を介して作用するが、β-アドレナリン拮抗薬の部分的な遮断効果が示すように、β-アドレナリン受容体依存性のメカニズムも介して作用する。受容体のクロストークが、CAによるマクロファージの活性化に影響を与えている可能性がある。この仮説を裏付けるように、β-アドレナリン受容体連動シクラーゼのcAMPによる活性化がマクロファージの貪食に必須であることが示された。このように、NE/E受容体を遮断すると、アデニラーゼシクラーゼを介したcAMP活性の関与が妨げられる。

その後、cAMPによるファゴサイトーシス活性化の効果を調べるために、10 18~10 2 Mの濃度範囲で効果を評価したところ、評価した最低濃度で約50%の刺激を受けるという二相性の濃度関係が示された(図1)。このことから、低濃度ではcAMP刺激によるタンパク質合成が食作用を増強するのではないかと考えられた。この仮説は、転写阻害剤であるアクチノマイシンDと翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドを用いて裏付けられた。両者とも、低濃度ではcAMPによるマクロファージの貪食作用の刺激を阻止したが、高濃度では貪食作用の誘導を抑制することができなかった。特筆すべきは、10 18 MのcAMP刺激は40万細胞あたり120分子でしか起こらず、これは約3,300細胞あたり1分子の割合であり、有意な増幅効果があることを示している。低濃度の刺激反応はゲノム経路を介するものであり、高濃度の効果は非ゲノム経路を介するものであった[2]。

3. 単細胞の活性化 テトラヒメナ

1970年代に,単細胞生物であるTetrahymenaが高等動物種の内因性リガンドの多くを結合できることが初めて報告された[3,4]。さらに研究を進めると,テトラヒメナが哺乳類と同様のシグナル伝達過程を示すことが明らかになり[5,6],これらの観察結果を受けて,テトラヒメナの受容体の感度やリガンドの産生を評価する一連の研究が行われるようになった。これらの研究では,リガンド濃度が10 21 Mであっても,セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン;5HT)やインスリンが組織のヒスタミン量に及ぼす影響など,複数のエンドポイントに対する生物学的効果がTetrahymenaで生成されることが示された[7-9]。

4. フラーレン

フラーレンは,炭素の特異な同素体であり,フラーレンをポリヒドロキシル化して水溶性にしたナノサイズの誘導体である。酸化ストレス下での一般的な毒性反応の評価には,有機または無機酸化剤(それぞれ1,4-ベンゾキノンまたはフェリシアン化カリウム)の溶液を用いた細胞および酵素アッセイが用いられている。また,酵素バイオアッセイでは,溶液の酸化的毒性(OXT)を評価することができる。OXT酵素アッセイでは、毒性物質の酸化還元の特徴を説明し、一般毒性(GT)アッセイでは、システムに対する正味の毒性効果を統合する。同様に、発光性海洋細菌と細菌酵素を用いて、いくつかのフラーレンの抗酸化特性を評価している。GT法では最大の生物発光強度を測定し,OXT法では誘導生物発光期間に特定の速度論的パラメータ値を用いる。

GTバイオアッセイでは,1×10 20~1×10 21Mという低濃度で,選択したフラーレンに生物学的効果が認められた[10]。VeoikovとYablonskaya[11]は,水和フラーレンが10 23 Mでルシフェラーゼ活性を~75%向上させることを報告した(図2)。これらの結果から、水和フラーレンであるC60は、バクテリアを用いたアッセイにおいて、高希釈の溶液中で抗酸化作用を示すことが明らかになった。特に、C60(10 19 M)は、ルシフェラーゼに対して顕著な安定化効果を示し、室温で長期間にわたって活性が失われるのを防いだ。

前述の例で重要なのは、用量反応の特徴がホルミシス学的なパターンに従っており、低濃度の薬剤で生物学的活性が増強されたことである。このような高希釈濃度でのホルミシス効果の根本的なメカニズムは、負電荷を帯び、電子密度容量を持つと思われるC60を取り囲む水性エンベロープが関与していると推測される。したがって、試験した薬剤には直接フリーラジカルを消去する活性と効果があると考えられる。C60の効果はさらに、ヒト胎児肺線維芽細胞の培養においてホルミシスの再反応を誘発することが報告されている[12,13]。

5. 合成トリペプチド:ムツゴロウのポンピングフェロモン

このフェロモンは孵化した卵から放出され、卵の膜を溶かして母親の体から幼虫を押し出す定型的なポンピングプロセスを介して幼虫の放出を刺激することが実証されている多くの研究がある。本来のリガンドを探すために、(1)セリンプロテアーゼによる卵膜の酵素分解によってフェロモンが生成されること、(2)合成トリペプチドフェロモンがムツゴロウの幼生のポンプ機能に影響を与えること、などの研究が行われた。これらの試験では、40mLの海水中に異なる濃度の試験剤を入れたときに、放出された幼生の数および/またはポンピング反応を示した卵生のカニの割合を調べた。フェロモンを模倣したものは、両方のエンドポイントでホルミシス的二相性の濃度反応を示した[14]。特に興味深いのは,5種類の合成トリペプチドを10 22 Mという低濃度で調べたことである。これらのアッセイでは,10 22 Mから10 16 Mの範囲のリガンド濃度で刺激反応が誘発され,典型的なホルミシスパターンが示された。試験した最低濃度(10 22 M)では,試験開始時に40 mLの海水中に24個の分子が存在していたと計算される.10匹のムツゴロウを40mLの海水で連続して試験した後、新しい試験液を使用した。このことから,試験した最低濃度のリガンドでは,超低濃度(例えば,カニ1匹あたり1~数分子程度)のリガンドでもポンプ機能反応を活性化できることが示唆された。

6. Gタンパク質共役型受容体(GPCR):リラキシンなどの低用量効果

HallsとCooper[16]は、リラキシンがその再受容体に結合すると、大規模なシグナル伝達複合体の形成が活性化され、その過程でリラキシンのシグナル伝達が増幅され、主要な標的組織で機能的反応を引き起こすのに必要なリラキシン分子の数がはるかに少なくて済むことを報告した。リラキシン受容体は、4つの密接に関連したGタンパク質共役型受容体(GCPR)の(サブ)クラスである。GCPRは、下流の標的を優先的に作用させる受容体結合タンパク質複合体であるシグナロソームを形成することにより、効率が向上する。サブピコモル濃度のペプチドは、この複合体に作用してリラキシン受容体とcAMPをカップリングさせ、細胞内シグナル伝達機構を増幅させる。HallsとCooper[16]は、循環しているリラキシンが、心臓などのリラキシンが産生されていない臓器を活性化するという観察結果と、循環しているリラキシンの濃度が他のシグナル伝達系で有効であるとされている濃度よりも低いことから、リラキシン-GCPR-シグナルソームのプロセスを概念化した。

CivciristovとHalls[17]は、これらの観察結果を一般化し、超低濃度のリガンドに対するGCPRの反応を示した35以上の論文があるにもかかわらず、このような高感度はかなり一般的であるにもかかわらず、科学的(および生物医学的トランスレーショナル)研究では一般的に見過ごされてきたことを指摘した。これらの報告における生物活性は,典型的には10-15~10 18Mの範囲であり,10 19~10 21Mという低濃度のものもいくつかあり,すべてホルミシス学的な用量反応パターンを示していた[18-23]。

Civciristovら[24]は,特定のリガンドのフェムトモル(fM)(10 15M)の濃度で,B2アドレナリン再受容体(ß2AR)とムスカリン性アセチルコリンM3受容体(M3R)の2つのGPCRが活性化されることに注目した。数学的モデリングに基づき、1fMのリガンドは、2つの可能な受容体結合イベントによる活性化の結果、5分という時間間隔の中で、調製物中の約40%の細胞を活性化することができると予測された。低濃度での受容体の活性化は,高濃度での活性化とは質的に異なり,細胞間シグナル伝達の空間的・時間的に異なるパターンと,細胞レベルでの明確な応答パターンを有する[24].高効率で増幅された同様の形態のシグナル伝達には,細胞あたり1~2回の結合イベントで応答に影響を与えるのに十分な大きさの活性化速度定数(Kact)が必要であることが示された。さらに、CHO-K1細胞に10 18M濃度のトロンビンリガンドを結合させると、cAMPの産生が促進されることも示された。Civciristovら[24]は,30,000個の細胞を10 18 Mの濃度で200 μLインキュベートしたところ(200 μLあたり約120分子),約1分子/250個の細胞が得られた。同様に、CHO-K1細胞は、10 20 Mのトロンビン濃度に反応することが示された(すなわち、25,000細胞あたり1分子と推定される)。

7. 考察

本研究では、10 18 Mから10 24 Mのリガンド濃度で、複数の生物系で再現性のある生物学的反応が誘導されることを証明した。これらの発見は、多くの生物系が超低濃度のリガンドに対して並外れた感度を示す能力を解明するものである。これまで、細胞(ある程度は器官系や生物全体)が、幅広い生物学的プロセスに影響を与える超低濃度の検出およびシグナル伝達機構を持ち、機能する能力については、あまり認識されていなかった。この論文で紹介されているような発見は、これらの能力が、単細胞生物から哺乳類生物までの系統的な種を超えて存在することを明らかにしている。しかし、微生物、植物、動物の領域におけるこれらの非常に繊細な検出、シグナル伝達、増幅のメカニズム、活動、効果、そしてそれらの恒常的および/または適応的な機能は、基礎研究およびトランスレーショナルリサーチの焦点としてようやく明らかになり、特定されつつある。

CivciristovとHalls[17]は、細胞膜の限られた空間領域しか占めていない受容体複合体の中で、シグナル伝達タンパク質が事前に集合することによって、超低用量効果が生じるのではないかという仮説を立てた。このような構造は、受容体のKdよりも桁違いに低い濃度でリガンドと受容体の結合効果が生じることを説明できるかもしれない。複合体内でのタンパク質の相互作用が、特定の(GPC)受容体のリガンド結合領域のアロステリックな変化を誘発および/または媒介し、リガンドとの親和性を高めるオープンタイプの構成を作り出す可能性があるという。実際,このような変化によって,結合親和性が15,000倍以上になることが示されている[25]。CivcirostovとHalls[17]はさらに,超高感度の結合複合体は細胞膜内に制限されたドメインを持っている可能性が高いので,この領域は受容体が豊富になり,「リガンドのシンク」ができ,親和性が高まり,シグナル伝達活性のホットスポットができるのではないかと推測している。

10 18~10 24 Mの範囲で細胞と直接相互作用できる分子の数は極めて少ないが、実験的には、「バイスタンダー・ブロードキャスティング効果」システムの中に統合された生物学的増幅プロセスが存在することが示されている。例えば、1個のcAMP分子/3,300個のマクロファージの比率は、統計的に平均的な食細胞反応を50%増加させた。同様のバイスタンダー増幅放送効果は、Offen[26]によって、パーキンソン病モデル系のPC12細胞に対する2種類の血管作動性腸ペプチド(VIP)由来のペプチドの神経保護作用で報告されている。両剤の濃度は10 18 M(600分子/1 mL)で,30万個のPC12細胞の生存率を50〜60%高めた。これは,約5,000倍の増幅反応である。Sowaら[27]は、モルヒネが10 20 Mのマクロファージの貪食作用を8.5%低下させ、約3,500細胞/分子に影響を与えることを示した(注:cAMPによって誘導される貪食作用について報告されている値と同様)。このように、1つの分子で数千の細胞が活性化されるという例は、ホルミシスの偏在性と有効性の理解を深める上で重要な概念的展開となる。

これらの例は、現在までに試験された中で最も低い用量/濃度であり、閾値の証拠がないことから、同様の効果がさらに大きな細胞/分子比で生じる可能性を示唆している(例えば、300,000~1,000,000個の細胞/6~120分子を用いて試験されたin vitro条件の生物学的活性の増加)。放送効果のいくつかの例は、生物全体で評価されている(例えば、10 22Mの合成ペプチドで妊娠中のムツゴロウの腹部ポンプ機能が活性化されたが、これはカニ1匹あたり推定2-3分子で有意な効果が誘発された[15])。同様の感度の高さは,有性生殖と無性生殖の両方を行う緑藻類のVolvoxでも報告されている。1973年、Pall[28]は、ホルミシス濃度の関数としての性的誘導を報告した。Volvox carteriを用いた研究によると,生殖器が無性胚ではなく有性胚を形成するためには,わずか2分子のホルモンが必要であることが判明した。

我々は、このような超高感度のシグナル伝達は、共通かつ高度に一般化された生存戦略として、進化上の意義、重要性があるのではないかと考えている。このことは、Civciristovら[24]が、さまざまな生物学的システムにおける超高感度の検出/シグナル伝達の35の確立された例を挙げていることからも明らかである。我々は、リガンドの超高感度は、様々な環境ニッチや条件に対する(細胞や生物の)反応性を確立するために重要であると推測している。超低用量の感度は、比較的「ノイズの多い」環境でホルミシスシグナルを増幅することを可能にし、それによってアロスタティックな能力や適応能力を持つ、より回復力の高い表現型を作り出すことができるだろう[29]。

非常に低濃度のリガンドによって引き起こされる効果は、生物学的に多様であり、マクロファージのファゴサイトーシスのような免疫反応 [2]、ホルミシス機能(例えば、テトラヒメナ[8])などが含まれる。昆虫のフェロモン受容体やメラノトロピック受容体の作用 [20],藻類の性シグナリング [28],いくつかの酵素活性 [12],cAMP産生 [24],マッドクラブのフェロモンポンプ因子 [15]などがある。超低濃度で影響を受ける多様なエンドポイントは、3,300~25,000個/分子の範囲で発生することが特徴的であり、活性化された細胞は、1mLの封じ込められた環境下で多数の他の細胞を巻き込む放送機能を発揮することができることを示している(活動や効果が発生する空間的な距離や体積を評価することはできない)。

このような超低用量効果の研究では、用量反応のホルミシスパターンがよく観察された。このように、ホルミシス学的な用量反応の一般性は、生物学的モデル、測定されたエンドポイント、誘発物質、生物学的組織のレベル、および研究された濃度範囲を超えて生じるものである[30]。様々な動物モデルや細胞タイプにおいて、様々なエンドポイントに影響を与える多くの適応的なホルミシス応答が、Nrf2の活性化を介して行われることが最近示されている[31]。超低用量で報告されたホルミシス様作用が、他の同定されたホルミシス機構とどのように関連しているかは不明であり、したがって、さらなる研究と、科学的な自己批判やパラダイムの修正に対する寛容さが必要である[32,33]。

したがって,ここで紹介する知見は,生物医学研究の新たな地平を切り拓く可能性を秘めていると考えている[34]。これには、細胞生物学や動物生物学における超低用量の役割や、このような低用量が細胞間の生物学的な情報伝達にどのような影響を与え、多数の生存機能を誘発・媒介するかについての調査が含まれる[29]。これは、生物学的、臨床的、環境的に有効で価値のあるエンドポイントを引き出すために、ホルミシス学的メカニズムに関与する新しい技術(評価、リガンドや他の栄養因子の部位特異的な超低用量投与)を採用できる学際的なアプローチの機会を意味する。現在進行中の我々の研究は、このような事業に力を注いでる。

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