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The SARS-CoV-2 Delta variant is poised to acquire complete resistance to wild-type spike vaccines
www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.08.22.457114v1
著者
Yafei Liu1,2, Noriko Arase3, Jun-ichi Kishikawa4, Mika Hirose4, Songling Li5, Asa Tada2, Sumiko Matsuoka1, Akemi Arakawa2, Kanako Akamatsu6, Chikako Ono7,8, Hui Jin1, 岸田一樹2、中井渉1,2、小山雅子1,2、中川敦史9、山岸義明10、中神浩則11、熊野郷敦12,13、松浦義春6,14、Daron M. Standley5,15、加藤貴之4、岡田正人6,15、藤本 学3、荒瀬 寿1,2,15*。
www.mpnrc.org/delta-plus-variant-symptoms-cause-precaution-treatment/
概要
mRNAベースのワクチンは、ほとんどの一般的なSARS-CoV-2亜種に対して効果的な防御を提供する。しかし、今後のワクチン開発には、突破口となりそうなバリアントを特定することが重要である。本研究では，Delta変異体が抗N末端ドメイン（NTD）中和抗体から完全に逃れる一方で，抗NTD感染力増強抗体への反応性を高めることを明らかにした．Pfizer-BioNTech社のBNT162b2免疫血清はDeltaバリアントを中和したが、Deltaバリアントの受容体結合ドメイン（RBD）に4つの共通変異を導入すると（Delta 4+）、BNT162b2免疫血清の一部が中和活性を失い、感染力が増強された。BNT162b2免疫血清の感染力増強には、Delta NTDのユニークな変異が関与していた。野生型スパイクではなく、Deltaスパイクで免疫したマウスの血清は、感染力を高めることなく、一貫してDelta 4+変異体を中和した。GISAIDデータベースによると、3つの類似したRBD変異を持つDeltaバリアントがすでに出現していることから、このような完全なブレイクスルーバリアントを防御するワクチンを開発する必要がある。
はじめに
SARS-CoV-2に対する新たに開発されたmRNAベースのワクチンは、感染だけでなく重症化したCOVID-19の予防にもかなり有効であることが証明されています（Jacksonら、2020年、Polackら、2020年）。しかし、新たなSARS-CoV-2の亜種が繰り返し出現し、ヒト集団の中で拡散している。最近の亜種は、ゲノム全体に多数の変異を獲得しており、オリジナルのSARS-CoV-2に比べて感染力が高い。現在承認されているmRNAベースのワクチンに使用されているスパイクタンパク質は、変異のないオリジナルのスパイクタンパク質で構成されているが、それでもこれらのワクチンは、懸念される変種（VOC）に対して有効である（Collierら、2021年、McCallumら、2021年、Muikら、2021年、Wangら、2021b）。スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）は、宿主細胞の受容体であるACE2と結合し、この相互作用がSARS-CoV-2感染時の膜融合を仲介する（Hoffmannら、2020年）。SARS-CoV-2に対する中和抗体は、主にRBDに向けられ、RBDとACE2の相互作用をブロックする。ほとんどのSARS-CoV-2亜種は、RBDの中和抗体エピトープに変異を獲得しており、中和抗体から逃れる結果となっている（Celeら、2021年、Collierら、2021年、Daviesら、2021年、Madhiら、2021年、Planasら、2021a、Tegallyら、2021年、Wangら、2021a）。しかし、RBDの変異は、ACE2との結合にも影響を及ぼす傾向がある。したがって、RBDの進化には、ACE2との結合を維持しつつ、中和抗体による認識を逃れる変異との間にトレードオフが存在する。さらに、mRNAワクチン免疫血清には、スパイクタンパク質のさまざまな部分のエピトープを認識するさまざまな中和抗体が含まれている。SARS-CoV-2は、現在のmRNAベースのワクチンで誘導される免疫に対して完全に耐性を持つ亜種が出現する可能性があるかどうかを確認することが重要である。次世代ワクチンの開発には、このような耐性亜種への警戒が不可欠である。
SARS-CoV-2デルタ型（B.1.617.2）は感染力が強く、急速に拡大している（Callaway, 2021）。ワクチンを接種した人や回復期のCOVID-19患者の血清の中和活性は、野生型と比較してDelta変種では低下する（ , 2021a; Planas et al, 2021b）。Delta変異体には、N末端ドメイン(NTD)とRBDの両方にいくつかの変異がある。DeltaバリアントのRBDにおけるL452RおよびT478Kの変異は、Deltaバリアントほど感染力が強くない他のバリアントでも観察される。そのため、RBDの変異だけでは、Deltaバリアントの高い感染力を説明できない。一方、Delta変異のうち、NTDのいくつかの置換や欠失-T19R、G142D、E156G、F157del、R158del-は、他の主要な変異体では観察されていない。このことから、デルタ型の高い感染力には、NTDの変異が重要な役割を果たしていると考えられる。SARS-CoV-2に対するワクチンによる免疫には、抗RBD抗体が主要な役割を果たしていると考えられているが（Robbiani et al., 2020）、NTDに対する中和抗体もSARS-CoV-2の中和には重要である（Chi et al., 2020; Li et al., 2021; , 2020; Suryadevara et al., 2021; Voss et al., 2021）。さらに、我々などは最近、NTD上の特定の部位に対する抗体が、RBDのオープンフォームを誘導することでSARS-CoV-2の感染力を高めることを明らかにした（Li et al. したがって、新興のSARS-CoV-2亜種の病原性を理解するためには、中和抗体と増強抗体の両方の機能を解明することが重要である。本研究では、Deltaバリアントの高い感染力のメカニズムを理解するために、NTDとRBDにおけるDeltaバリアントの変異を系統的に調べ、Deltaバリアントがワクチンによる免疫から完全に逃れることができる進化経路を提案し、次世代ワクチンの設計に重要な情報を提供した。
結果
COVID-19患者由来の抗NTD抗体および抗RBDモノクローナル抗体のDeltaバリアントに対する中和活性。
SARS-CoV-2デルタウイルスの感染力増加のメカニズムを理解するために、COVID-19患者から得た各種の抗スパイクモノクローナル抗体のデルタスパイクタンパク質への結合を解析した（図1A）。これらのモノクローナル抗体は、SARS-CoV-2亜種がまだ出現していない時期である2020年半ばに感染した患者から得られたものであるため、現在のワクチンで使用されているものと同じ野生型スパイクタンパク質によって惹起されたと考えられる（Brouwerら、2020年、Chiら、2020年、Liら、2021年、Robbianiら、2020年、Suryadevaraら、2021年、Zostら、2020年）。中和抗体の多くはRBDに対するもので、Delta変異体はこのドメインにL452RとT478Kという2つの変異を持っています。L452は、ほとんどではないが一部の中和抗体のエピトープであることが報告されている（McCallumら、2021年、Wangら、2021b）。T478KはACE2結合部位に位置し、主にACE2結合親和性の増加に関与していると思われる（Xuら、2021年）。様々な抗RBD抗体を用いた解析では、Deltaスパイクを認識できなかった中和抗体はわずかで、ほとんどの抗RBD中和抗体は野生型スパイクと同等のレベルでDeltaスパイクに結合することがわかった（図1A）。
Delta変異体は、NTD-T19R、G142D、E156G、F157del、R158delといういくつかのユニークな変異を有しており、野生型スパイクで誘発されるいくつかの抗NTD中和抗体の結合が阻害されている可能性が示唆された。発表されている13種類の抗NTD中和抗体（Chi et al., 2020; Li et al., 2021 ; , 2020; Suryadevara et al., 2021; Voss et al., 2021）に加えて、COV2-2016, COV2-2026, COV2-2150も野生型スパイクに対する抗NTD中和抗体であることがわかった（図1B）。これら16種類の抗NTD中和抗体を解析したところ、いずれの抗NTD中和抗体もDeltaスパイクを認識できませんでした（図1A）。一方、抗NTD感染力増強抗体（Li et al., 2021; , 2021b）の結合を解析したところ、10個の抗NTD感染力増強抗体のうち8個が、野生型スパイクと同等のレベルでDeltaスパイクに結合した（図1A）。中和抗体/増強抗体のいずれの特性もよくわからなかった抗NTD抗体の中には、野生型スパイクと比較してDeltaスパイクへの結合が部分的または完全に減少したものもあれば、強い結合を示したものもあった。Delta 変異体に対する抗 NTD 抗体の認識が低下または強化される頻度が高いことから、NTD の抗原性が NTD の変異によって大きく影響を受けていることが示唆された。
次に，Deltaスパイクタンパク質（Delta疑似ウイルス）または野生型スパイク（野生型疑似ウイルス）を搭載した疑似ウイルスを用いて，Delta変種に対する増強抗体および中和抗体の機能を解析した（図1B-1D）。各シュードウイルスのウイルス力価は、ACE2をトランスフェクトしたHEK293T細胞への感染力で確認した（図S1）。Deltaスパイクに結合した抗RBD中和抗体は、Delta型または野生型のいずれの疑似ウイルスの感染も完全に中和した（図1C）。試験した抗NTD中和抗体はすべて、Deltaスパイクタンパク質を認識できなかった（図1A）。予想通り、これらの抗NTD抗体は、Delta型シュードウイルスの感染を中和しなかったが、野生型シュードウイルスの感染力を低下させた（図1B）。野生型シュードウイルスに対する抗NTD中和抗体の中和効率は，以前に報告されたように抗RBD中和抗体の中和効率よりも低かった（Chiら，2020；Liら，2021 ; ，2020；Suryadevaraら，2021；Vossら，2021）。増強抗体は、RBDのオープンフォームを誘導することで、SARS-CoV-2の感染力を高める（ 、2021b）。上述したように、ほとんどの増強抗体による認識は、Deltaバリアントでよく保存されていた（図1A）。また、増強抗体の効果を調べたところ、いくつかの増強抗体によるDelta型シュードウイルスの感染力増強は、野生型シュードウイルスのそれよりも大きかった（図1D）。これらのデータから、Delta変異体は、機能的な増強抗体エピトープを維持しながら、抗NTD中和抗体から完全に逃れていることが示唆された。増強抗体は、抗RBD中和抗体の効果を低下させることから（Li et al.
BNT162b2免疫血清のDeltaバリアントに対する中和活性。
次に、Delta疑似ウイルスに対するPfizer-BioNTech BNT162b2 mRNAワクチンで完全に免疫された健康な人の20の血清の中和活性を分析した（図2A）。ほとんどのBNT162b2免疫血清は、高濃度のDelta pseudovirusの感染を完全に阻止したが、Delta pseudovirusに対するBNT162b2免疫血清の中和力は、野生型pseudovirusに比べて著しく低下し（図2B）、以前の報告と同様であった（ , 2021a; Planas et al. 抗NTD中和抗体はいずれもDelta変異体に対して有効ではなかったことから（図1Aおよび1B）、BNT162b2免疫血清のDelta変異体に対する中和活性には抗RBD中和抗体が主要な役割を果たしていると考えられる。
Delta変異体に対するBNT162b2免疫血清の抵抗性におけるNTDとRBDの寄与を明らかにするために、NTD、RBDまたはS2サブユニットが野生型（W）またはDelta（D）変異体のいずれかにコードされたキメラ型スパイクタンパク質を作製した（図3A）。抗NTD増強抗体COV2-2490は、野生型NTDとDelta NTDの両方に結合するが、抗NTD中和抗体4A8は、野生型NTDには結合するが、Delta NTDには結合しない。同様に、抗RBD中和抗体C144は、野生型RBDとDelta RBDの両方に結合するのに対し、抗RBD中和抗体C002は、野生型RBDには結合するが、Delta RBDには結合しない。予想通り、C002は、野生型RBDのスパイク（WWDまたはDWD）にはよく結合したが、Delta RBDのスパイク（DDDまたはWDD）には弱く結合した（図S2）。同様に、抗NTD中和抗体4A8は、野生型NTDを持つスパイク（WWDまたはWWD）には結合するが、デルタNTDを持つスパイク（DDDまたはDWD）には結合しなかった。また、COV2-2490とC144は、すべてのキメラ型スパイクタンパク質に結合した。これらのデータは、キメラ型スパイクタンパク質の各ドメインが、元の抗原性を保持していることを示唆している。
次に、これらの組換えスパイクタンパク質を含む疑似ウイルスを作成し、BNT162b2免疫血清の効果を分析した。WWDシュードウイルスに対するBNT162b2免疫血清の中和活性は、野生型シュードウイルス（WWW）と比較してわずかに低下したことから、S2ドメインの変異がDeltaバリアントの耐性に関与していることが示唆された（図3Bおよび3C）。野生型のNTDをDelta NTDに置換したDWDシュードウイルスの感染力をWWDシュードウイルスと比較すると、BNT162b2免疫血清の中和活性はさらに有意に低下した。野生型RBDをDelta型RBDに置換したWDDシュードウイルスに対して、DWDシュードウイルスと比較して、BNT162b2免疫血清の中和活性が低下した。BNT162b2免疫血清の中和活性は、Delta pseudovirus（DDD）に対してさらに低下した。これらのデータは、DeltaスパイクのNTDとRBDの両方の変異が、Delta変種に対するBNT162b2免疫血清の耐性に関与していることを示唆している。
Deltaスパイクのクライオ電子顕微鏡解析
COVID-19患者の抗NTDモノクローナル中和抗体はすべてDeltaスパイクに結合できなかったのに対し、増強抗体のほとんどはDeltaスパイクとの反応性を維持していた（図1A）。Delta spikeのNTDにはいくつかの変異があるが、抗NTD中和抗体の既知のエピトープはDeltaバリアントに保存されている。Deltaバリアントの変異が抗NTD中和抗体のエピトープ構造に及ぼす影響を評価するため、単粒子クライオ電子顕微鏡解析を行った。データは、不均一なリファインメントとab-initio再構成に続いて、不均一なリファインメントによって解析された。その結果、スパイクタンパク質の密度マップが3.1Åの解像度で得られた（Figure S3 and Table S1）。スパイクの原子モデルを構築するために、AlphaFold2（Jumper et al.、2021年）を用いて、DeltaバリアントのNTDの構造を予測した。予測されたDeltaバリアントのNTDモデルは、得られたマップにフィッティングするための初期モデルとして使用された。Deltaバリアントのスパイクのモデルの統計値を表S1にまとめた。Delta variantと野生型スパイクのNTDモデルを比較したところ、増強抗体の主要なエピトープ残基であるH64、W66、V213、R214は構造的によく保存されていた（図4）。一方、抗NTD中和抗体のエピトープの残基では、大きなコンフォメーション変化が見られた（図4）。Delta変異体と野生型の間の原子間距離は最大で9Å以上であった（図4B）。Delta変異体のNTDでは、4つのエピトープ残基-Y144、K147、K150、W152を含むβ鎖が、野生型に比べて大幅に短くなり、シフトしていた（図4A）。これらの構造変化は、F157とR158の欠失によるものと考えられる。その結果、これらの4つの残基は野生型とはかなり異なっていた。R246とW258は野生型と比べて大きな変化を示し（図4）、これら2つの残基をつなぐループは非常に柔軟であるように見えた。これらのデータは、抗NTD中和抗体のエピトープ残基の構造が劇的に変化したことが、Deltaスパイクに対する抗NTD中和抗体の反応性が完全に失われた原因であることを示唆している。
Deltaバリアントの将来起こりうる変異の予測
Deltaバリアントは、NTDに変異を獲得することで、BNT162b2免疫血清中の抗-NTD中和抗体に対して完全に耐性となったため、BNT162b2免疫血清中の中和活性には主に抗-RBD中和抗体が関与していると考えられる（図1、図2、図3）。これらの結果から、Delta変異体は、抗RBD中和抗体の認識を阻害するRBDの追加変異を獲得することで、BNT162b2免疫血清に対する完全な耐性を獲得する可能性が示唆された。実際、AY.1（Delta plus）と呼ばれるRBDのK417N変異を獲得したDeltaバリアントが既に出現しており、一般集団におけるその頻度は増加している（Gupta et al.、2021年）。追加変異の発生の可能性を調べるために、GISAIDデータベースでDeltaバリアントが獲得した変異の相加効果を解析した（図S4）。Deltaバリアントは、すでにRBDに大量の追加変異を獲得しており、そのうちのいくつかは抗RBD中和抗体のエピトープに生じている（Greaneyら、2021a、Greaneyら、2021b、Greaneyら、2021c、Wangら、2021b、Weisblumら、2020）。K417N変異に加えて、E484K、F490またはN501Y変異を有するDelta変異体（Alpha、Beta、Gammaおよび/またはLambda変異体で観察される）も増加している（図5A）。デルタ型に感染した人の数が非常に急速に増えていることを考えると、デルタ型は感染者の中でさらに変異を獲得し、感染力がさらに高まった人が選ばれる可能性が高い。実際、GISAIDデータベースによれば、抗RBD中和抗体エピトープに複数の変異を持つDeltaバリアントが既に出現している（図5B）。特に、EPI_ISL_2958474は、NTD配列が代表的なDelta変異体と同一ではないものの、抗RBD中和抗体エピトープにさらに3つの変異を有している。そこで、SARS-CoV-2の変異体で観察された主要な変異がDelta変異体のRBDに及ぼす影響を解析した（図5C）。Delta変異体にはT478K変異が含まれており、隣接する残基が同様の効果を示す可能性があるため、S477N変異は除外した。そこで、Deltaスパイク（Delta 4+）にK417N、N439K、E484K、N501Yの4つの変異を導入し、これらの変異の影響を解析した（図5D）。
いくつかのBNT162b2免疫血清によるDelta 4+シュードウイルスの感染性の増強。
RBDに1つの追加変異または複数の変異を加えたDeltaスパイクに対するいくつかの抗RBD中和抗体の結合を解析した（図6A）。ほとんどの抗RBD抗体は、単一の追加変異を持つDeltaスパイクを認識したが、Delta 4+スパイクタンパク質は認識しなかった。R346およびN440を主要なエピトープとするC135抗RBD中和抗体（Greaneyら、2021b；Weisblumら、2020）は、やはりDelta 4+スパイクを認識した。次に、変異したスパイクタンパク質を持つシュードウイルスを作製した。単一のRBD変異を追加したDeltaシュードウイルスは、BNT162b2免疫血清に対してわずかに耐性があった（図6B）。追加の単一変異の効果は、最高濃度の血清では感染が完全に阻止されたものの、個体によってわずかに異なっていた。次に、RBD変異を4つ追加したDelta 4+シュードウイルスを解析した（図6C）。驚くべきことに、ほとんどのBNT162b2免疫血清は、比較的低濃度のBNT162b2免疫血清でDelta 4+シュードウイルスの感染性を用量依存的に増強したが、最高濃度の血清でのみ弱い中和を示した（図6Dおよび6E）。特に、PFZ7は比較的低濃度の血清で感染力を大きく増強した。PFZ13やPFZ14のように、最高濃度の血清でも中和活性を示さない血清もあった。PFZ13およびPFZ14の野生型またはDeltaバリアントに対する中和力は、他のものより明らかに低かった（図2A）。一方，PFZ15はDelta 4+シュードウイルスを効果的に中和したが，野生型およびDeltaバリアントに対するPFZ15の中和力は他に比べて特に高くなかった。NTDまたはRBDのいずれかに対するほとんどの中和抗体はDelta 4+シュードウイルスに対しては機能しないが、ほとんどの増強抗体はDelta 4+シュードウイルスに対しては機能を維持していることから、BNT162b2免疫血清の存在下での感染性の増加は、抗NTD増強抗体を介していると考えられる。
感染力の増強に対するDelta NTDの寄与を解析するために、野生型NTDとDelta 4+ RBDを持つスパイクタンパク質を有するシュードウイルスを作製した（図6C）。BNT162b2免疫血清の中には、Delta 4+疑似ウイルスの感染力を高めるものがあるが、野生型NTDを持つDelta 4+ウイルスでは、BNT162b2免疫血清による感染力の増強は見られなかった（図6Dおよび6E）。これらのデータから、DeltaバリアントのNTDの変異は、ウイルスを野生型よりもBNT162b2免疫血清中の抗NTD増強抗体に対して感受性を高め、抗RBD中和抗体の中和効果を低下させていることが示唆された。
Deltaスパイクを免疫したマウスの血清は、Delta 4+シュードウイルスに対する感染性の増強を示さない。
BNT162b2 mRNAワクチンには野生型スパイクを使用したため、一部のBNT162b2免疫血清によるDelta 4+シュードウイルスへの感染性の増強は、Delta 4+シュードウイルスに対する抗NTDおよび抗RBD中和抗体の中和抗体価が低下したことに起因すると考えられる。したがって、Deltaスパイクで免疫した場合、増強抗体のエピトープがDeltaスパイクタンパク質に保存されているにもかかわらず、Deltaバリアントに対する中和抗体価は増強抗体に比べて相対的に高くなる可能性がある。Deltaスパイクによる免疫の効果を調べるために、野生型またはDeltaスパイクタンパク質を一過性にトランスフェクトしたB16F10マウスメラノーマ細胞をマウスに免疫した（図7A）。B16F10細胞を使用したのは、B16F10メラノーマ細胞株の免疫原性がかなり低いからである（Priem et al.、2020）。また、トランスフェクタントで発現させたスパイクタンパク質のコンフォメーションは、mRNAワクチンで発現させたスパイクタンパク質のコンフォメーションと類似していると考えられる。すべてのマウスはスパイクタンパク質に対する抗体を効果的に産生した（図S5）。野生型スパイクを免疫した血清は、野生型シュードウイルスをよく中和したが、Deltaシュードウイルスに対する中和効果はBNT162b2免疫血清と同様に低下した（図7Bおよび7C）。一方、デルタスパイクを免疫した血清は、野生型とデルタ型の両方のシュードウイルスをよく中和した。たった1匹のマウスが、野生型のシュードウイルスよりもDeltaシュードウイルスを中和する抗体を産生した。Delta-4+シュードウイルスを解析すると、野生型スパイクを免疫したマウスの血清のいくつかは、BNT162b2免疫血清のいくつかと同様に、比較的低濃度の血清で用量依存的に感染力の増強を示した（図7Dおよび7E）。特に#w1マウスの血清は、同じ血清が野生型シュードウイルスをよく中和するにもかかわらず、どの濃度でも感染力の増強を示した。一方、Deltaスパイクを免疫に用いた場合には、免疫血清による感染力の増強は認められなかった。デルタスパイクを免疫したマウスの血清は，どの濃度の血清でも感染力の増強を示さなかった．これらのデータは、将来出現する可能性のあるDelta亜変異体を制御するためには、野生型ではなくDeltaスパイクを含むワクチンが必要である可能性を示唆している。
考察
Delta亜型は感染力が強く、完全にワクチンを接種した人へのブレイクスルー感染がしばしば観察される(Lopez Bernal et al., 2021)。このことから、完全にワクチンを接種した人の中和抗体では、Delta亜型による感染を防ぐのに十分ではないと考えられる。抗RBD抗体は、SARS-CoV-2の感染防御に大きな役割を果たしていると考えられる。Delta変異体は、RBDにL452RおよびT478Kの変異を有しており、L452は一部の中和抗体のエピトープであることが示されている（McCallumら、2021年、Wangら、2021b）。しかし、ほとんどの中和抗体はDelta RBDに結合し、感染を中和した。したがって、RBDの変異だけでは、Deltaバリアントに対するBNT162b2免疫血清の中和力の低下を説明できない可能性がある。
Delta変異体は、NTDにT19R、G142D、E156G、F157del、R158delという複数の変異を持つ。すべての抗NTD中和抗体がDeltaスパイクを認識できなかったことから、Deltaバリアントは、広く使用されているmRNAワクチンの抗原成分である野生型スパイクタンパク質によって誘発される抗NTD中和抗体に対して完全に耐性があることがわかった。一方、ほとんどの抗NTD増強抗体は、Deltaスパイクを野生型スパイクと同じレベルで認識し、一部の抗NTD増強抗体は、Deltaシュードウイルスによる感染力増強を野生型シュードウイルスに比べて示すことがわかった。この観察結果と一致するように、増強抗NTD抗体のエピトープの構造は、野生型とよく保存されていた。増強抗体は、抗RBD中和抗体の中和活性を低下させることから（Li et al.、2021; 、2021b）、NTDの変異は、Delta変異体のBNT162b2免疫血清に対する耐性に重要な役割を果たしている可能性がある。実際、野生型NTDを有するDelta型シュードウイルスは、完全なDelta型シュードウイルスよりもBNT162b2免疫血清による中和を受けやすかった。Delta NTDの影響は、Delta 4+のシュードウイルスでより明らかであった。これらのデータは、NTDの変異がSARS -CoV-2の中和抗体からの逃避に関与していることを示している。中和抗体の結合を無効にし、増強抗体の結合を維持するNTDの変異は、ウイルスにとって有益であると考えられる。Delta変異体のこれらの変異は、免疫を受けた宿主や過去に感染した宿主において、抗NTDおよび抗RBD中和抗体からの回避を維持しつつ、増強抗体の存在に適応していることを示唆していると考えられる。
Deltaだけでなく、Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.135)、Gamma(P.1)といった他のVOCでも、RBDよりもNTDに多くの変異が見られる。NTDは、RBDのコンフォメーションの調節には関与しているが、宿主の受容体であるACE2との直接的な結合には関与していないため( , 2021b)、多くの変異を許容することができる。Deltaバリアントと同様に、ほとんどの抗NTD中和抗体は、AlphaおよびBetaバリアントには結合しないことが報告されている(Voss et al., 2021; Wang et al., 2021a)。最近では、L-SIGNがSARS-CoV-2のエントリー受容体であることが報告されている（Amraeiら、2021年、Kondoら、2021年、Sohら、2020年、Thepautら、2021年）。L-SIGNは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のRBDではなくNTDに特異的に結合し、膜融合を誘導することで非ACE2発現細胞のSARS-CoV-2感染を媒介した（Soh et al. さらに、抗NTD中和抗体は、L-SIGN発現細胞へのSARS-CoV-2感染を、ACE2発現細胞への感染に比べて効率的に阻止した。In vitroでは抗RBD中和抗体に比べて中和効率が低いにもかかわらず、ほとんどのVOCが抗NTD中和抗体から完全に逃れていることを考えると、NTDがL-SIGNやその他の未知の受容体を介してSARS-CoV-2の感染を仲介することは、in vitroよりもin vivoでより重要な役割を果たしているのかもしれない。SARS-CoV-2の病原性を解明するためには、抗NTD中和抗体だけでなく、NTDの機能についてもさらなる解析が必要である。
増強抗体は、NTD上の特定の部位に結合し、RBDのオープンフォームを誘導することで、スパイクタンパク質のACE2に対する親和性を高める（ , 2021b）。最近では、増強抗体は生体内での感染力を高めないことが報告されている(Li et al., 2021)。しかし、11種類の既知の増強抗体の中で、1種類のヒトIgG1モノクローナル増強抗体のみが、生体内でテストされている。増強抗体のNTDに対する親和性やエピトープ、さらには増強抗体のIgGサブクラスが、生体内での機能に影響を与えている可能性がある。近年、中和抗体が生体内で中和活性を発揮するためには、Fc受容体への結合が必要であることが報告されている（Schaferら、2021年、Suryadevaraら、2021年、Winklerら、2021年）。実際、in vivo研究で最も頻繁に使用される抗体サブクラスであるIgG1は、Fc受容体への親和性が最も強く、強いエフェクター機能を示すのに対し、IgG2およびIgG4はFc受容体に弱く結合する（Nimmerjahn and Ravetch, 2008）。したがって、抗NTD増強抗体のin vivo機能は、抗体サブクラス、特定の可変領域配列、あるいはその両方によって異なると考えられる。Delta変異体では増強抗体エピトープが維持されており、増強抗体に対する感受性も高いことから、増強抗体が生体内でのSARS-CoV-2感染力の増強に関与していると考えられる。
BNT162b2免疫血清のいくつかは、1:10希釈でDelta 4+シュードウイルスに対する中和活性を示したが、逆に1:30希釈では感染力が増大した。一般に中和抗体の活性は、3倍の濃度差があってもそれほど急激には変化しない。したがって、Delta 4+シュードウイルスに対するBNT162b2免疫血清の効果は、単に中和抗体の濃度では説明できない。BNT162b2免疫血清は、どの血清濃度においても、野生型NTDを含むDelta 4+シュードウイルスに対する感染性の増強を示さなかった。抗NTD感染力増強モノクローナル抗体の効果は、抗RBD中和抗体の濃度に影響されるため（Li et al., 2021; , 2021b）、BNT162b2免疫血清における感染力増強抗体の効果は、抗RBD中和抗体の濃度がある閾値以下になると、より顕著になると考えられる。実際、Delta疑似ウイルスに対する中和抗体価が低いBNT162b2免疫血清は、血清濃度が高くてもDelta 4+疑似ウイルスに対する感染力増強効果を示した。中和抗体価は、2回目の免疫から3週間後に最も高くなるものの、徐々に低下していく（Doria-Roseら、2021年、Widgeら、2021年）。希釈血清の場合と同様に、中和抗体価と増強抗体価が同じように低下しても、免疫後しばらくしてから感染力増強抗体の効果がより明らかになる可能性がある。また、アデノウイルスワクチンや不活化ワクチンで誘導される中和抗体価は、mRNAワクチンで誘導される中和抗体価よりも低い(Lim et al., 2021; Shrotri et al., 2021)。したがって、中和力の低いBNT162b2免疫血清と同様に、アデノウイルスワクチンや不活化ワクチンの免疫血清では、Delta 4+シュードウイルスに対する増強効果がより顕著になる可能性があると考えられる。一方，BNT162b2免疫血清の中には，どの血清濃度でもDelta 4+シュードウイルスの感染を増強せず，中和力も高いものがあった。同様に、近交系マウスを使用したにもかかわらず、Delta 4+シュードウイルスの感染性に対する血清の影響は、野生型スパイクで免疫したマウスの個体間で大きく異なっていた。あるマウスの血清はDelta 4+ pseudovirusの感染を増強したが、他のマウスはどの血清濃度でも中和を示した。中和抗体と増強抗体の抗体価，親和性，エピトープの微妙なバランスが，血清の感染性への影響に影響しているのかもしれない．免疫後に産生される中和抗体と増強抗体の特徴をさらに分析することが重要である。
SARS-CoV-2は、これまでに多くの変異を獲得しており、それらは感染者の中で生じている。そのため、多くの人が感染している状況では、新しい亜種がより頻繁に出現する可能性がある。Delta変異体は爆発的に広がっているため、スパイクタンパク質のコーディング領域ではすでに多数の追加変異を獲得しており、Delta変異体は今後もさらなる変異を獲得していくことが示唆されている。DeltaバリアントのRBDで観察されたいくつかの変異は、抗RBD中和抗体のエピトープであることが報告されている（Greaneyら、2021a; Greaneyら、2021b; Wangら、2021b）。宿主の免疫系の環境に適応した新しく出現したバリアントが選択され、拡大していく。RBDに4つの追加変異があるDeltaバリアントは、NTDにユニークな変異があるため、ほとんどのBNT162b2免疫血清で中和されなかった。さらに重要なことは、Delta 4+の感染力は、一部のBNT162b2免疫血清によって増強されたことである。さらに、追加された4つの変異のうち、3つの変異を持つDelta variantがすでにGISAIDデータベースに登録されており、RBDで合計5つの変異を獲得したDelta variantは、近い将来、追加の変異を獲得する可能性が高いと考えられる。今回、Delta変異体の追加変異として、K417N、N439K、E484K、N501Yを選択したが、他の抗RBD中和エピトープの組み合わせでも、Delta 4+変異体と同等またはそれ以上の効果が期待できる。実際、Delta 4+は、C135などの抗RBD中和抗体の主要なエピトープ残基の一つであるR346を有している。現在のSARS-CoV-2の高い変異率を考えると、新たに出現するスパイク変異を予測することは、新たに出現するSARS-CoV-2の亜種に対する効果的なワクチンを開発する上で非常に重要である。将来出現する可能性のある危険なスパイク蛋白質の変種による免疫は、そのような変種の出現を防ぐのに有効であると考えられる。
現在、SARS-CoV-2ワクチンによる3回目のブースター免疫を検討している。我々のデータは、野生型スパイクによる反復免疫が、新たに出現するDelta亜種の抑制に有効でない可能性を示唆している。我々は、Deltaスパイクによる免疫は、感染力を高めることなく、Deltaバリアントだけでなく、野生型やDelta 4+バリアントも中和する抗体を誘導することを示した。mRNAワクチンは、今回の動物モデルとは異なる結果が得られる可能性があるが、Deltaスパイクを発現するmRNAワクチンの開発は、出現しつつあるDeltaバリアントの制御に有効であると考えられる。しかし、中和抗体ではなく増強抗体のエピトープは、Delta variantを含むほとんどのSARS-CoV-2 variantでよく保存されている。そのため、野生型のSARS-CoV-2に感染したことがある人や、野生型のスパイクタンパクからなるワクチンで免疫したことがある人では、SARS-CoV-2の変種由来のスパイクタンパクを追加で免疫することで、中和抗体よりも増強抗体が高まる可能性がある。抗NTD増強抗体を誘導しないRBDのみを用いた免疫は、ワクチンの戦略となりうる。しかし、抗RBD中和抗体と同様にSARS-CoV-2感染を防御する抗NTD中和抗体は、RBD単独による免疫では誘導されない（Chiら、2020年、Liら、2021年 ; 、2020年、Suryadevaraら、2021年、Vossら、2021年）。メジャーバリアントで観察されるRBD変異を含むが、増強抗体エピトープを欠く全スパイクタンパク質は、ブースターワクチンとして検討する必要があるかもしれない。