タンニンは3CLproの触媒ダイアド残基との結合を介してSARS-CoV-2を阻害する。構造の異なる19種類の加水分解性タンニンを用いたin silico・アプローチ

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Tannins inhibit SARS‐CoV‐2 through binding with catalytic dyad residues of 3CLpro: An in silico approach with 19 structural different hydrolysable tannins

要旨

SARS-CoV-2ウイルスに扇動されたコロナウイルスパンデミック2019(COVID-19)は、最近、世界的に騒がれており、世界的な健康不安を刺激している。その複製を操作するSARS-CoV-2の主要な3-キモトリプシン様システインプロテアーゼ(3CLPro)酵素は、薬の発見ポイントとして利用できる可能性がある。

そこで私たちは、分子操作環境(MOE09)を用いて、19種類の加水分解性タンニンがSARS-CoV-2の3CLproの触媒ダイアド残基と組み合わさることで、SARS-CoV-2に及ぼす影響を理論的に調べ、ドッキングさせた。

その結果、ペドゥンクラギン、テルカテイン、カスタリンはSARS-CoV-2の受容体結合部位及び触媒ダイアド(Cys145及びHis41)と強く相互作用することが明らかになった。その結果、上位3つのヒット化合物は、SARS-CoV-2の阻害剤として、COVID-19に対抗するための最適化や創薬プロセスの追加的な最適化につながる可能性があることが示唆された。

この研究により、特定の構造を持つタンニンがCOVID-19に対する天然の阻害剤として利用できることが明らかになった。

実用化への応用

3CLproはSARS-CoV-2のコピーを制御し、その寿命を管理しており、SARS-CoVやMERS-CoVコロナウイルスを対象とした。SARS-CoV-2の3CLproに対して、約19種類の加水分解性タンニンを計算した。その結果、Pedunculagin, tercatain, castalinはSARS-CoV-2-3CLproのCys145およびHis41と相互作用した。

Pedunculagin-SARS-CoV-2-3CLproは、明らかな変動を伴わない安定な状態を維持している。今回の研究で得られた知見は、近い将来、COVID-19の革新的な天然阻害剤の発見や未工業化のためのエビデンスとして評価されるのではないかと予測した。

1 序論

新しく、2019年の後半に新しいコロナウイルス(SARS-CoV-2)が発見された(Xu et al 2020)。COVID-19が突如出現し、保健当局のみならず科学界をもそれに向けた迅速な行動に導いた。その結果、SARS-CoV-2の全ゲノムシリーズが発行され、その後、科学的に注目されるようになった(Jiang et al 2020年;Stebbing et al 2020)。SARS-CoV-2はβ-コロナウイルス群に属し、SARSと同様にコウモリコロナウイルスHKU9-1と祖先を共有しており、そのSpikeタンパク質は配列の多様性に関わらずヒトACE2受容体と激しくネットワークを形成している(Ul Qamar, Alqahtani, Alamri, & Chen, 2020)。7月13日までに世界の死者数は57.4万人を超え、確定症例は13,200.000人、回収症例は213カ国で7,600.000人となった(https://www.worldometers.info/coronavirus)。

 

最近の研究では、SARS-CoV-2遺伝子はSARS遺伝子と80%未満のヌクレオチド一義性を有し、89.1%のヌクレオチド類似性を有することが強調されている(Kim, Kim, & Lee, 2020; Moorthy, Restrepo, Preziosi, & Swaminathan, 2020)。通常、β-コロナウイルスは、ゲノムのディクテーション時に〜800kDaのポリペプチドを産生する。このポリペプチドは、多数のタンパク質を作成するためにタンパク質分解的にスライスされ、タンパク質分解的転用は、パパイン様プロテアーゼによって促進され、ウイルスの複製に不可欠ないくつかの非操作性タンパク質を作成するために16の異なるスポットでポリタンパク質をスライスする(Macchiagodena, Pagliai, & Procacci, 2020)。したがって、このプロテアーゼは、ウイルス複製における重要なタスクを描き、極端な矛盾を示す3′末端に位置する別個の構造/フィットメントタンパク質をコードする遺伝子が存在する(Rut et al 2020)。したがって、3CLPro酵素は、COVID-19に対する天然阻害剤の可能性のあるターゲットとして役立つ可能性がある。

 

構造に基づく効果解析および高出力の知見は、SARSおよびMERS-3CLproの可能性のある阻害剤を認識している(Pillaiyar, Meenakshisundaram, & Manickam, 2020)。生物活性物質、特に加水分解性タンニンは、副作用のない医薬品開発のために評価されうる大きな注目を集めている(Liu et al 2016)。加水分解性タンニンはまた、いくつかの化学療法的なものの反対効果を排除するだけでなく、永続性を延長し、抗がん剤の可能性と肯定的な全体的な健康を達成する上で貴重であると測定され、代替の抗がん剤供給として利用することができる(Buzzini et al 2008; Lin et al 2011; Aires、2020; Jia et al 2019; Zhu, Khalifa, Peng, & Lic, 2018)。punicalagin、punicalin、およびgeraniinを含む加水分解性タンニンは、cccDNAの生成を回避し、cccDNAの減少を支持することにより、Bウイルスに対して抗ウイルス効果を発揮し、これはHBV感染症を救済するための新規な薬剤の拡大のための主成分として援助することができる(Liu er al)。同様に、エピアクチシミンAおよびB、カスタリン、ベスカリン、チェブラーギン酸、およびプニカラギンなどのタンニン型化合物は、ウイルスの糖タンパク質-グリコサミノグリカン結合を標的とし、アクセスおよび細胞間の饗宴を阻害することを介して抗ヘルペスウイルス活性を示した(Lin et al 2011; Aires、2020)。最も重要なことは、抗ウイルス効果を含むタンニンの生物学的活性が構造依存的であるという仮説が立てられたことである。例えば、水酸化、メチル化、グリコシル化、ガロイル化、重合などの付加反応がタンニンの生物活性に影響を与える主な要因である。そこで、我々は、タンニンの構造相関活性を表す観点から 19種類の異なる構造のタンニンを選択した。

本研究では、19種類の構造の異なる加水分解性タンニンの中から、SARS-CoV-2の主要なプロテアーゼを標的としたCOVID-19に対する強力な阻害剤をin silicoアプローチ(分子ドッキングおよびドラッグライクネススキャン)を用いて探索することを目的とした。本研究の成果は、COVID-19に対する天然治療薬の地位を向上させることを可能にするものである。

2 材料と方法

構造ベースの模擬検査戦術は、後続の規定(Intel(R) Core(TM) i7-3210M CPU @ 2.50 GHz、5 Core(s) CPU 4.00 GB RAM、64-bit Windows-10 Functioning System)を備えた高性能コンピューティングワークステーションを使用して実行された。Molecular Operating Environment (MOE 09)を用いて構造ベースの薬物検査を行った。

2.1 リガンドデータベースの配置

カスタリン(CID-99973)、ビコーニン(CID-71308161)、グランディニン(CID-492392)、テルカテイン(CID-14411424)を含む19種類の加水分解性タンニンの構造を明らかにした。グラナチンA(CID-131752596)、テルリマグラジンI(PubChem CID-73179)、ゲラニン(CID-3001497)、カズアリニン(CID-13834145)、ストリキニン(CID-73330)、ペドゥンチュラギン(CID-442688)。punicalin(CID-5388496)、chebulagic acid(CID-250397)、casuarictin(CID-73644)、ß-pedunculagin(CID-5320441)、potentillin(CID-5315734)。isoterchebin (CID-442685)、roxbin B (CID-176131)、repandusinic acid A (CID-147900)、およびterchebin (CID-3084341)をPubChemデータベースから検索した。タンニン構造は、別途、Protonate-3DとMMFF94X強度場を用いて、部分電荷の付加とエネルギーの最小化を行い、ドッキングに最適化した。また、19種類のタンニンについて調整したリガンドアーカイブをリガンドカタログに保存し、最後にドッキング研究のためのインボルブメントファイルとして利用した。

2.2 2019-nCoV構造の3CLproの精密化

同様に、SARS-CoV-2(PDB: 6y84)の3CLproの3次元構造をProtein-Data-Bank(http://www.rcsb.org)から2.16Åの分解能で取得した。3CLpro構造を強化するために、MOE-09では、これまで相互作用していたリガンドやH2O物質を3CLpro構造から切り離し、3次元プロトン化、エネルギーの最小化を行った。このようにして得られた最小化された構造は、次のステップでのドッキング操作に利用された。

2.3 分子ドッキングと薬物類似性解析

MOEドッキングツールを用いて、19種類の構造の異なるタンニンをSARS-CoV-2-3CLproのアロステリックリガンド相互作用スポットにドッキングさせた。その結果、結合可能なコンパクトは、MOE-09のサイトロケーターツールを用いて同定され、ドッキングの手順を経て占有された。ドッキングした10の最高の姿勢は、スコアリングジョブLondon dGを適用して作成された。ドッキングプロセスの強化は、受容体を保存する力場アルゴリズムを操作することによって終了した。それらから、最高級の関連リガンドとコンポーネントは、しばしばオングストローム(Å)で計算されている根-平均-二乗偏差(RMSD)、およびドッキングスコアに基づいて選択された。リガンド受容体相互作用解析は、MOE-09のLigXツールを用いて行った。これは、各リガンドと結合している可能性のある残基をリアルに表示することを目的としている。それは、受容体の結合ポーチ内のリガンドを安定化させる力を示す2Dイメージを作成する(Khan er al)。 19 種類のタンニンの薬効性を調べるために、COVID-19 に対する阻害剤候補となる挙動に適した分子特性を基に、すべてのタンニンの薬効性をさらに明らかにした。

2.4 分子動力学シミュレーションとファーマコフォア解析

分子動力学シミュレーション(MD)は、我々のドッキング結果を洗練し、SARS-CoV-2 3CLpro結晶モデルを用いて、トップ3の加水分解性タンニンのアセンブリー性能と不変性を解析するために行われた。GROMOSソフトウェアは、以前に説明したように同様の手順を引き継いで80nsのMDシミュレーションに従事するために使用された(Ul Qamar et al 2020)。リガンドトポロジーファイルは、CGenFFサーバ64,65,66を介してCHARMM force fieldを使用して構築した。リガンド-タンパク質複合体は、TIP3P水モデルを用いて八面体ボックス内で溶媒和した。また、ペドゥンクラギンの予測ファーマコフォアも作成した(Khaerunnisa, Kurniawan, Awaluddin, Suhartati, & Soetjipto, 2020)。

3 結果と考察

COVID-19プロテアーゼと19の構造の異なるタンニンのアロステリック結合の分析は、最初に多くのポーズを明らかにし、我々は小さなSスコアを持つ最高のポーチを使用していた。共結晶化したインヒビターで採用されていたレセプターコンパクト内に最高級のドッキング分子を再現的にドッキングさせた。私たちの19の構造の異なるタンニンの化学構造は、図1に示されている。SARS-CoV-2-3CLproの物理化学的パラメータを解析したところ、酵素は306残基の鎖状ポリペプチド(L)からなり、分子量は33.796 kDaであり、他のリガンドとH結合を形成することができる安定な親水性分子であることがわかった(図2)。最近、集まったSARS-CoV-2-3CLproタンパク質の配列をコウモリSARS様と比較すると、99.02%の配列個性が開示されていることがわかった(Ul Qamar et al 2020)。さらに、SARS-CoV-2はMERSよりもはるかにSARSに匹敵し、コウモリ由来のコロナウイルスとの相互の先祖を付与していることが明らかになった(Ji, Wang, Zhao, Zai, & Li, 2020; Xu er al)。この知見はまた、SARS-CoV-2が、SARS-3CLpro(Cys145およびHis41)、TGEV-3CLpro(Cys144およびHis41)、およびHCoV-3CLpro(Cys144およびHis41)と信頼できるCys-His触媒ダイアド(Cys145およびHis41)を有することを発見した(Yang et al 2003)。SARS-CoV-2-3CLproの受容体結合凹凸構成と類似していることが開示されており、SARS-3CLproに対して投影されたインヒビターがSARS-CoV-2-3CLproの動きをも緩和する可能性があることが機会を増加させる。

図1

原文参照

図2

原文参照

COVID-19に対する天然の治療薬としての新規かつ有効な低分子化合物の継続的な必要性に対応するために、研究は現在、より多くの計算機的な薬物発見に向けられている(Desai et al 2008)。タンニンの抗ウイルス性がコンピュータを用いた投薬戦略によって証明された報告がいくつかある(Buzzini er al)。 このような状況の中で、抗ウイルス剤をベースとした治療法を発展させ、より効果的な阻害剤を実現するためには、コンピュータを用いた創薬手法が非常に重要な役割を果たしている。本研究では、加水分解性タンニンの構造の多様性という革新的な側面から、COVID-19に対する阻害剤としての新規アロステリック化合物の実現に向けて、シミュレーションによる選択を終了した。このように、アロステリック指令は、取り返しのつかない阻害を克服するための有効な戦術として記述されている。その結果、この4つのトップランカーの空間配置とドックスコアは、最大の結合親和性を持つ機能性残基が効果的に相互作用していることを示している。これらのタンニンは、表1およびS1に示されている薬物展望の規範に適合しており、卓越した結合親和性を証明している可能性がある。1およびS1に示されている薬物の見通しの規範に適合し、準備段階として使用するための例外的な知覚を証明する可能性がある。

表1. 19の加水分解性タンニンとSARS-CoV-2の3CLproの触媒ダイアド残基との間の相互作用のトップ5のポーズとそのドッキング特性

加水分解性タンニン Mol S E-conf E-place E-score
  • カスタリン -14.04 156.57 -98.32 -15.69
  • ビコーニン -24.36 122.35 -82.19 -14.60
  • グランディニン -21.86 220.85 -127.95 -16.66
  • テルカテイン -23.11 85.43 -133.94 -16.82
  • グラナチン -15.38 187.54 -98.06 -13.28
  • テリマグラディンI-29.53 81.89 -107.41 -13.83
  • ゲラニン-22.17 152.74 -93.78 -12.09
  • カスアリニン -24.15 122.36 -61.90 -15.24
  • ストリクチニン -23.96 98.31 -96.30 -16.82
  • ペダンクラギニン -18.58 110.04 -70.23 -12.96
  • プニカリニン-18.01 81.58 -61.70 -14.78
  • チェブラーギン酸 -22.35 132.94 -124.68 -13.74
  • Casuarictin  -24.88 112.87 -112.35 -16.09
  • ß-pedunculagin-19.05 99.45 -116.44 -15.71
  • Potentillin -17.40 124.16 -44.06 -17.23
  • イソテルチェビン -25.38 120.42 -139.58 -16.83
  • ロクスビンB-23.82 100.86 -97.63 -19.67
  • レパンドシンAイメージ -24.15 -41.28 -167.41 -13.87
  • テルチェビン -29.06 119.45 -60.55 -13.21

Mol. 出力ポーズ,S:Noneに設定されていなかった最終ステージのスコア,E-conf. コンフォーマーのエネルギー、E-place。E-place: 配置段階からのスコア,E-score. E-score:再スコア段階からのスコア。


LigXを用いた19種類のタンニンの相互作用親和性解析を行った結果、図3に示すように、19種類のタンニンの相互作用親和性が明らかになった。19種類のタンニンがSARS-CoV-2-3CLproの異なる残基と異なる相互作用を示すことが明らかになった。詳細には、ペドゥンクラギンが最も加水分解性の高いタンニンであり、SARS-CoV-2-3CLproの12アミノ酸残基と結合することができ、5つのH結合力が発生していることがわかった。

最も重要なことに、ペドゥンクラギンは、H結合力を介してHis41およびCys145と直接相互作用し、3CLproの触媒ダイアド残基と相互作用する能力を示した。同様に、カスタリンとテルカテインは、アレーンアレーン相互作用とH-結合力を介してHis41とCys145と直接ネットワークを形成していた。

また、Bicornin, Repandusinic acid A, grandinin, granatin A, roxbin B, and terchebinもまた、H-bondingやアレーン相互作用を介してHis41と正確に相互作用し、3CLproの触媒的なダイアド残基に影響を与えていることを示した。また、加水分解性タンニンの中には、Tellimagradin I, strictinin, punicalin, chebulagic acid, casuarictin, ß-pedunculagin, potentillin, isoterchebin などが二次的に His41 または Cys145 の両方と相互作用しており、3CLpro の触媒的なダイアド残基に部分的に影響を与えていることが示された。

一方、ゲラニン、カスアリニンはいずれもHis41やCys145とは相互作用していないが、アレーンアレーンやH結合を介して3CLproの8アミノ酸残基や7アミノ酸残基とネットワークを形成していた。ペドゥンクラギンのコンパクト空間部位の重要な触媒残基は、最も深いSスコア(-18.58)でポケット内に安定化され、C145, H41, N142, S46, T45, T24, T25, Q189, E166, H164, M165, M43と結合していることがわかった。

カスタリンは、C145、H41、L27、M49、G143、Q189、N142、S46、T45、T25、およびC44と相互作用した。SARS-CoV-2-3CLproとの各タンニンの結合能の違いは、それぞれの構造に基づく関係活性によるものと考えられる。

図3

19種類の加水分解性タンニンとSARS-CoV-2の3CLpro酵素の結合ポケット残基との結合パターンを示すLigX相互作用図


これらの結果から、SARS-CoV-2-3CLproの受容体結合部位および触媒ダイアド(Cys-145およびHis-41)と相互作用すると考えられる、少なくとも3種類の無害で薬物投与可能な新規タンニンが同定された。これらの加水分解性タンニンのうち、pedunculaginはSARS-CoV-2-3CLproの触媒ダイアド残基(Cys-145、His-41)と強く相互作用し、センス結合親和性、ドッキングスコア、ADMET特性を有していた。

表 S2 に補足したように、ペドゥンクラギンは溶解性、高い腸管吸収性に優れた化合物であり、変異を示さない。また、この分子はHERG lおよびHERG llの阻害剤ではないため、心筋(心筋)に有害な影響を与えることはない。

以前、ザクロ、クルミ、インディアングーズベリー、オーク材、Melaleuca quinquenervia、Terminalia catappa、およびCombretum glutinosumの葉から抽出され得るpedunculagin、tercatain、およびカスタリンは、抗ウイルス活性および他の生物学的活性を示した(Chang et al 1995; Silva et al 2016; Zuo, LI, Chen, & Xu, 2005)。

関連する研究において、Parkら(2017)は、Broussonetia papyriferaのインヒビター対3-chymotrypsin-likeおよびpapain-likeコロナウイルスシステインプロテアーゼから10種類のポリフェノールを単離した。また、Jo, Kim, Kim, Shin, Kim(2019)はMERS-CoVに対する4種類のフラボノイドを検討し、ケルセチン3-β-d-グルコシド、ヘルバセチン、イソバカルコン、ヘリクリセチンがMERS-3CLproの酵素活性を阻害したことを報告している。

 

逆に、加水分解性タンニンは、異なる細菌の酵素の逐次的な作用により、ガリン酸、ピロガロール、フロログルシノール、最終的にはアセテートと酪酸に分解されることが報告されている。ガリック酸、ヘキサヒドロキシジフェニル酸、およびエラグ酸もまた、加水分解タンニンのモノマータイプである(Serrano, Puupponen-Pimiä, Dauer, Aura, & Saura-Calixto, 2009; Smeriglio, Barreca, Bellocco, & Trombetta, 2017)。

エラギタンニンがラットの腸内で加水分解されてエラグ酸を放出することが知らされている。エラグ酸はCaco-2細胞内でパラセルルートを介して注入され、ヒトでは吸収のtmaxは約1.27時間である。エラグ酸の吸収については、いくつかの著者は、ザクロジュースの経口投与後0.5と3時間の間にヒト血漿中のエラグ酸を検出している。

吸収後、エラグ酸は共役を経て、メチル基、グルクロニル基、硫酸基を有する共役形態が血漿中に見出され、尿中に排泄されている。ガロタンニンは細菌、真菌、酵母などによって容易に分解される。微生物のグループによって産生されるタンナーゼは、ガロイルエステルのガロイル残基やヘキサヒドロジフェノイルに活性を示す。

プロアントシアニジンとは異なり、大腸菌は加水分解性タンニンを代謝することができる。明確なタンナーゼ活性を有する乳酸菌の存在は、ガロタンニンからのガリック酸が大腸発酵中に利用可能である可能性を示唆している。

例えば、caecalコンテンツとインキュベートされたカズアリクチンは、エラグ酸の放出を増加させる。プニカラギンを給与したラットでは、エラグ酸はラット微生物叢によって3,8-ジヒドロキシ-6H-ジベンゾ(b,d)-ピラン-6-オン(ウロリスチンB)誘導体に変換され、総尿中排泄物はラットの摂取したプニカラギンの0.7%〜52.7%を占めている。

また、ヒトボランティアの各群にエラグタンニン含有食品を単回摂取させた場合、代謝物の排泄量は摂取したエラグタンニンの2.8%〜16.6%であった。したがって、タンニンの摂取による健康影響は、その代謝物の生物学的活性の結果であると考えられる。

 

前述のタンニンの抗ウイルス薬としての可能性を考えると、今回の研究は、COVID-19に対する天然阻害剤として、3種類の加水分解性タンニンの化学的性質を明らかにすることを目的としたものである。今回の分子ドッキング研究では、薬用タンニンとCOVID-19の主要なプロテアーゼとの相互作用を明らかにし、His41とCys145の両方を阻害することに成功した。

 

薬用タンニンの薬効を検証するために、MOEのLigXツールを用いてリガンドの特性を検討した。すべての選択されたタンニンは、建設的な結果を開示し、5のLipinskiの規制の基準を達成した(Khan et al 2017)。規制は、可能性のある薬物様成分は、約5つのH-結合ドナー、最大10のH-結合アクセプター、およびオクタノール水パネル係数log Pではない> 5を有するべきであると定義している。

これらの結果は、我々の研究で同定された天然成分、特にペドゥンクラギン、テルカテイン、およびカスタリンが、COVID-19薬物リハビリテーションのためのより価値のある候補を示す可能性があることを示唆している。さらに、ペダンクラギンの分子ドッキング結果を調べるために、ペダンクラギンをMDシミュレーションし、RMSD、RoG、H結合の特性を表現した。

ペドゥンクラギン-SARS-CoV-2-3CLpro-complexは明らかな変動を示さず、典型的なRMSD値が1.4±0.01Åであるタンニン-タンパク質複合体の安定性を示していた(図S1a)。また、ペドゥンクラギン-SARS-CoV-2-3CLpro複合体は、80nsのシミュレーション中、緻密で安定な状態を維持していた(図S1b)。

同様に、タンパク質の重要な安定化力であるH結合は、ペダンクラギン-SARS-CoV-2-3CLpro複合体がシミュレーション期間中、目立った揺らぎもなく安定であることを示唆している(図S1c)。以上のことから、ペドゥンクラギン、テルカテイン、カスタリン、およびザクロやナッツ類などの供給源は、SARS-CoV-2に対する天然の阻害剤として有用であると考えられる。

ペドゥンクラギンは加水分解性タンニンである。二次代謝物成分は薬用植物に定期的に含まれている。そこで我々は、ペドゥンクラギンの活性基に基づいて、ペドゥンクラギンのファーマコフォアを予測した。ペドゥンクラギンに含まれるヒドロキシ基(-OH)、ケトン基(=O)、フェノール環は、SARS-CoV-2-3CLproのエネルギースポットでアミノ酸残基結合の一部を担っていると予想される(図4)。これらの基は、H結合などの力を介してSARS-CoV-2の3CLproと直接相互作用していることが明らかになった。

 

図4

4 結論

その結果、加水分解性タンニンを豊富に含む薬用植物、特にペドゥンクラギン、テルカテイン、カスタリンは、理論的にはCOVID-19の発生を治療するために使用できることが明らかになった。

ここでは、19種類の加水分解性タンニンの構造関係活性をスクリーニングし、SARS-CoV-2のメインプロテアーゼを阻害し、ウイルスコピーを阻害する可能性のあるトップ3のヒット化合物を選択した。これらの加水分解性タンニンの阻害剤を臨床薬に応用するためには、試験管内試験(in vitro)および生体内試験(in vivo)でのさらなる研究が必要である。

今回の研究で得られた知見は、近い将来、COVID-19に対する新規天然阻害剤の発見や未工業化のためのエビデンスとなるだろうと予測した。

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