単純ヘルペスウイルス(HSV)の再活性化

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Resolution of herpes simplex virus reactivation in vivo results in neuronal destruction

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7058292/

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要旨

単純ヘルペスウイルス(HSV)の発症における基本的な問題は、ウイルスの神経細胞への再活性化の結果である。再活性化後の生存と終息の両方を支持する証拠が発表されている。感覚神経節の神経細胞レベルでのこの事象は非常に稀であるため、この重要な問題を直接調べることは限られていた。

本研究では、再活性化の消失の詳細な生体内試験(in vivo)解析を行った。潜伏感染したC57BL/6マウスを温熱ストレスにより生体内試験で再活性化させた。再活性化刺激の20時間後には、これらのマウスの三叉神経節で高い割合(60〜80%)で感染ウイルスが検出されたが、刺激の48時間後には減少した(0〜13%)。

再活性化刺激後の時間の増加に伴い、細胞カフで囲まれた再活性化ニューロンの割合が増加し、これは検出可能な感染性ウイルスの減少およびウイルスタンパク質陽性ニューロンの数の減少と相関していた。

重要なことは、無傷のウイルスタンパク質陽性ニューロンに加えて、アポトーシス体と形態的に一致し、切断されたカスパーゼ3を含む断片化されたウイルスタンパク質陽性ニューロンが検出されたことである。この表現型の頻度は、再活性化後の時間経過とともに増加した。これらの断片化したニューロンはIba1+細胞に囲まれており、死滅したニューロンの食細胞による除去と一致していた。

再活性化後のニューロン破壊の証拠は、以前に報告された再活性化の制御におけるT細胞の非溶血的役割の再検討を促すものであった。

最近感染したマウスを、再活性化を誘導する前に抗CD4/CD8抗体で処理した。その結果、感染ウイルスの力価も神経細胞の断片化も変化しなかった。対照的に、再活性化中にウイルスのDNA複製を阻害した場合には、ウイルス蛋白質が発現していても神経細胞の断片化は観察されなかった。

我々のデータは、再活性化したニューロンの少なくとも一部が破壊されることを示している。この過程では、T細胞が媒介する直接的な抗原認識の証拠は見られなかったが、ウイルスのDNA複製を阻害することで、神経細胞の断片化はブロックされた。

これらの予想外の知見は、宿主神経系におけるHSV再活性化の解決について新たな疑問を投げかけている。

著者要約

単純ヘルペスウイルス(HSV)は、ニューロンに潜伏し、宿主の生涯にわたって周期的に再活性化するヒトの常在性病原体である。再活性化後にニューロンが生き残るかどうかは議論の余地があり、長期感染に重要な意味を持つ。

HSVの再活性化イベントは、ウイルスが神経系でどのように振る舞うかについての洞察を提供することを目的として、宿主と病原体の相互作用の複雑さを維持したマウスで特徴付けることができる。

本報告では、生体内での再活性化に続く感染性ウイルスの排除は、高度に集中した細胞応答とHSVタンパク質を含む神経細胞の破壊に対応していることが示された。

この応答におけるT細胞の役割を調べた。これまでの研究では、T細胞がHSV再活性化の主要な調節因子であることが確認されていた。しかし、T細胞の抗原認識共受容体が存在せず、感染性ウイルスの力価およびウイルスの広がりがアイソタイプ処理された対照神経節と変わらない場合にも、神経細胞の破壊が観察された。

逆に、ウイルスDNA複製を阻害した場合には、ウイルスタンパク質を発現する神経細胞の破壊は観察されなかった。これらの知見は、再活性化はニューロンの破壊を介して解決されることを示唆しており、これは抗原を介したT細胞の細胞毒性とは独立しているように見えるが、ウイルスの複製を必要とすることを示唆している。

はじめに

単純ヘルペスウイルス(HSV)は、ヒト集団の風土病である[1]。感染は体表で起こり、ウイルスは上皮細胞で複製し、感覚ニューロン軸索を介して感覚神経節に運ばれる。HSVはニューロンに潜伏し、宿主の生涯にわたって再活性化する可能性のある貯蔵庫を形成する(レビュー:[2])。

再活性化イベントは新しい宿主への伝播を可能にするが、失明 [3]、脳炎 [4, 5]、アルツハイマー病 [6-9]などの様々な疾患の後遺症にも関連している。神経変性疾患におけるHSVの役割についての証拠が増えてきているが(レビュー:[8, 10])、長期感染が神経学的損傷に寄与するメカニズムはまだ未解明である。

神経細胞レベルでの再活性化イベントの結果を理解することは、長期のHSV感染の結果を理解し、神経疾患の発症における役割を確固たるものにするための重要な一歩である。さらに、神経節における再活性化に対する宿主の反応を明らかにすることは、HSV感染の予防および/または治療のためのワクチンおよび治療法の開発の指針となる。

 

生体内での神経細胞レベルでのHSV再活性化の時間的・定量的解析はまだ行われておらず、再活性化後の神経細胞の運命についてはまだ論争の的となっている。

免疫細胞の浸潤はHSV感染したヒト神経節において死後に検出されており、ウイルスタンパク質の発現とは無関係である[11, 12]が、細胞溶解または非細胞溶解のメカニズムを介して生体内でのHSV再活性化イベントを直接的に制御する免疫細胞の役割は不明である。

潜在感染マウス由来の解離三叉神経節培養物を用いた研究では、HSV特異的CD8+T細胞が非細胞溶解的な方法で潜在感染ニューロンと相互作用することが示されており、T細胞はニューロンを保存するために機能し、再活性化に対する潜在的な障壁となっていることが示唆されている [13-15]。

しかし、ウイルスタンパク質の発現に成功し、感染性ウイルスを産生するニューロンの運命は調べられていない [14]。

マウス神経節の組織学的検査では、生体内での再活性化後の神経細胞の組織学的検査で、HSVタンパク質陽性ニューロンを取り囲む免疫浸潤が確認されており、再活性化の結果、炎症性宿主反応が起こり、ウイルスタンパク質陽性ニューロンが破壊されることが示唆されている[16-21]。

しかし、ニューロンが破壊されるという結論は、極めて少数の事象から推測されたものであり、細胞死の直接的なマーカーではなく、炎症性浸潤の検出に基づいたものであった。

 

生体内試験(in vivo)での再活性化の分解能は、ex vivoでは再現されない狭い時間枠内で起こる[22, 23]。したがって、再活性化をサポートするニューロンは、生きている宿主の文脈の中でのみ破壊される可能性がある。

HSV感染のマウス眼球モデルと、生体内での再活性化を誘導するための高熱ストレスを利用して、生体内での再活性化の転帰に取り組んだ。高熱ストレスは、ヒトにおけるHSVの再活性化と相関のある刺激である発熱を模倣するため、再活性化を誘導するための生理学的に適切な方法である[17, 24]。

HSVはプログラムされた細胞死を抑制する性質があることから(レビュー:[25])、再活性化刺激後の神経細胞死が再活性化イベントの終盤に発生した場合、単一の時間点、または限られた数の神経細胞のみを検査することで、神経細胞死を検出する確率を大幅に低下させる可能性があると考えられた。

そこで、本研究の目的は、C57BL/6マウスを用いて、(i)神経細胞レベルでのHSV再活性化の時間的解析を行い、(ii)生体内でのHSV再活性化イベントの解消機構を調べることである。C57BL/6マウスは、CD8+T細胞がニューロンと相互作用して非細胞溶解性のメカニズムを介して再活性化を阻害すると結論づけた以前のex vivo研究との直接比較を可能にするために選択された[14, 15]。

我々のデータは、再活性化中のニューロンと感染性ウイルス力価が再活性化刺激の20時間後頃にピークを迎え、これらは刺激の48時間後までにほぼ完全に解消されたことを示している。カスパーゼ-3(アポトーシスを示す)が切断された断片化されたウイルス蛋白陽性ニューロンは、再活性化刺激後の時間が長くなるにつれて頻度が高くなった。

ウイルス性タンパク質陽性ニューロンは、マクロファージやミクログリアで発現するマーカーであるイオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)を発現する細胞を主に含む高細胞性カフに囲まれていた。

これらの貪食細胞は、アポトーシスニューロンの除去に関連している[26]。抗CD4/CD8欠乏抗体を用いた治療は、神経節内でのウイルスの拡散にはつながらず、再活性化刺激の48時間後のニューロンの断片化した表現型を防ぐこともできなかった。

しかし、再活性化中のウイルスDNA複製をブロックすることで、ウイルスタンパク質の発現にもかかわらず、神経細胞の断片化を防ぐことができた。これらの結果は、再活性化後の神経細胞の破壊があり、ウイルスの複製をブロックすることでこの結果が抑制されることを示している。

議論

長期のHSV感染の病態はまだ十分に理解されていない。臨床研究では神経変性疾患とHSV感染との間に相関関係があることが明らかにされているが [51] ,HSVが神経変性に寄与するメカニズムは未だ不明である.神経系における周期的な再活性化の影響を理解するためには、神経細胞レベルでのHSV再活性化イベントの分解能の検討が必要である。

本研究では、生体内で再活性化をサポートする感覚ニューロンがアポトーシスを受け、断片化された細胞体として可視化され、それがIba1+細胞によって除去されるという証拠を提示した。

意外なことに、我々はT細胞抗原を介した細胞障害機能が、短期間の維持や潜伏からの再活性化の直接的な解決に果たす役割を明らかにしなかった。しかし、これは、潜伏感染したTGのT細胞が疲弊した表現型を持ち、機能が低下しているという観察と一致している[52-54]。

 

我々は、生体内試験(in vivo)での再活性化研究にC57BL/6マウスを使用することを検証し、より感受性の高いマウス株と同様の再活性化頻度を示した[17, 23]。

これまでの研究では、C57BL/6マウスでは再活性化の頻度が低いことが報告されている [55, 56]。これらの異なる結果の背景には、接種量、感染経路、再活性化の誘導方法、感染ウイルス検出プロトコルなど、複数の違いがあると考えられる。我々の研究デザインには、再活性化の2つの補完的な指標、感染性ウイルスの検出、および全神経節におけるウイルスタンパク質発現ニューロンの局在化が含まれていた。

我々の知る限りでは、我々の研究は、C57BL/6マウス背景のニューロンでウイルスの解毒サイクルへの侵入を検出し、定量化した初めての研究であり、再活性化中のニューロンの形態変化とその周辺の細胞の状況についてのさらなる洞察を提供している。

本研究により、再活性化中の個々のニューロンに対する免疫応答が高度に集中していることが明らかになった。主な発見は、ウイルスタンパク質陽性の断片化ニューロンが検出されたことである。

この断片化ニューロンは、再活性化後の時間とともに支配的な表現型となり、TGにおける感染性ウイルス力価の低下と相関した。これらの断片化ニューロンは形態学的にはアポトーシス体と一致しており、切断されたカスパーゼ-3を含んでいることがわかった。

神経節全体では、これらの断片化されたニューロンは印象的な表現型を示し、インタクトから断片化へと進行する段階が観察される(図3)。

再活性化後の神経細胞の破壊の進行速度はウイルス株に影響され、HSV-1株McKraeに感染したマウスでは、17syn+に感染したマウスに比べて再活性化刺激後の早い時間(20時間)に断片化した神経細胞の割合が高いことからも明らかであった(フィッシャーの厳密検定、p<0.0001)。

 

培養ニューロンのHSV感染は、カスパーゼ-3の活性化およびタウ切断をもたらし、神経変性と関連していることが示されている[57]。HSVのタンパク質は、細胞分裂感染中にアポトーシスを阻害することが示されている(レビュー:[25])ので、再活性化したニューロンで細胞分裂サイクルが進行すると、これらの同じウイルス性タンパク質も最初はアポトーシスを阻害する可能性がある。

断片化されたニューロン(無傷のウイルスタンパク質陽性ニューロンではなく)でのみ切断されたカスパーゼ-3が検出されたことは、再活性化の初期段階でアポトーシスが遮断され、生産的なリチン化サイクルが可能になったことと一致している。

興味深いことに、アシクロビル投与治療はこの時間枠内で断片化をブロックした。

再活性化を支持するニューロンが断片化状態にまで進行した場合、切断されたカスパーゼ-3が検出可能になり、これらのニューロンがミクログリアによって貪食されることが予想されるが、これはここでの我々の知見や、他のシステムでのニューロンのアポトーシスの後に観察されたものと一致している[58]。

インタクトなニューロンと断片化されたニューロンの両方が同時に存在するのは、再活性化の開始と進行が非同期であるためかもしれない。

あるいは、神経細胞のサブタイプの違い、転写因子レベルの違い、クロマチン状態の違い、ウイルスゲノムの多重性の違いなど、他の変数が断片化への進行に影響を与える可能性もある。また、一部の無傷のニューロンが断片化状態に進行せず、再活性化に耐えられる可能性も残されている。

 

生体内試験(in vivo)での設定とは対照的に、軸索を切り取って培養(explant;一般的に使用される再活性化モデル)した潜伏感染神経節では、再活性化中のニューロンは細胞カフを形成せず、断片化も進行しない[22]。

驚くべきことに、生体内で観察されたウイルスの厳密な封じ込め(図(図33および図6)6)は、エクスプロラントでは維持されず、隣接する細胞へのウイルス拡散の証拠は、24時間以内に観察され得る[22, 23]。

このことは、TG内での拡散の制御が、細胞の封じ込めを促進し、最終的には再活性化ニューロンの断片化を促進する生体内試験(in vivo)の文脈依存性応答にリンクしていることを示唆している。

生体内試験(in vivo)での再活性化または移植前に潜伏感染した神経節内で進化した免疫細胞のコンテクストは、異なるものではないだろうということは注目に値する。このことは、軸索切除および移植のプロセスが、再活性化に対する正常な(生体内試験(in vivo)での)反応を乱すことを示唆しており、この試験管内試験(in vitro)の移植モデルで得られた結果の解釈を複雑にしている[13, 14]。

実際、ex vivoでの研究から得られた結果は、ニューロンが再活性化イベントを生き残るという結論を支持するために用いられてきた[13]。

対照的に、本研究の結果は、異なる結果、すなわち、生体内試験(in vivo)での再活性化の解決には神経細胞の破壊が関与していることを明らかにした。

HSV再活性化の結果としての神経細胞の破壊は、ヒトにおける関連する臨床観察によって支持されているが、これは広くは認識されていない。HSVに感染した患者の角膜は、未感染の対照群と比較して、神経支配密度および刺激に対する感受性に違いを示している [59, 60]。

これらの違いは、HSVの周期的な再活性化が軸索損傷を引き起こし、それが神経細胞の喪失の結果である可能性を示唆している。

さらに、無症候性のウイルス脱落を伴うヒトの皮膚生検では、神経突起の突出が検出されている [61]。神経突起の突出は損傷に対する反応であり[62]、再活性化をサポートするニューロンを失った後の隣接ニューロンの代償メカニズムである可能性がある。

Pengらは、神経細胞をIL-17cで前処理するとHSV感染に関連したアポトーシスが減少することを実証している[61]。IL-17cシグナル伝達は隣接するニューロンを死から守り、HSV再活性化をサポートするニューロンの破壊後の体表での感覚喪失を回避するためにニューロンの伸長を促進している可能性がある。

HSVに感染したヒトの神経節は死後に慢性炎症の徴候を示し、T細胞とニューロンの間の相互作用は非破壊的であるように見えることが確認されている [12, 63]。

興味深いことに、ヒトの死後のサンプルでは、神経節病変に関連した高細胞クラスター(結節)が確認されている [64-66]。HSVの急性感染後の神経細胞の破壊と高細胞性結節の形成は、以前にマウスモデルで報告されており [67]、今回の研究では再活性化後にも同様の過程をたどることが示されている(図3)。

重要なことは、HSVタンパク質陽性ニューロンの除去は非常に選択的であるということである。このことは、再活性化が繰り返されたにもかかわらず、潜伏プールのサイズが有意に減少しないという観察結果に寄与していると考えられる [68]。

再活性化イベントごとに2~3個のニューロンが失われても、宿主の生涯にわたって何千もの潜伏感染部位が枯渇することはないだろう。

 

神経細胞の破壊の選択性は、以前に神経損傷後の神経保護の役割を果たすことが示されているIba1+貪食細胞の作用によるものである可能性がある [69]。Iba1の発現はマクロファージ/ミクログリアの活性化に伴ってアップレギュレートされ、膜の荒れや貪食に関与している [26]。

Iba1の発現は、マウスの急性HSV感染時にTGおよび脳幹で増加することが以前に示されている[70]。我々の研究では、Iba1+細胞はウイルス性タンパク質陽性の断片化したニューロンを取り囲む細胞カフの中で優勢であった。

我々は、これらの細胞がファゴサイトーシスによる再活性化をサポートする特定のニューロンを排除する上で重要な役割を果たす一方で、保護因子や神経栄養因子の放出によって損傷や周囲のニューロンへのウイルスの拡散を制限していることを提案している。

このことは、神経系における死滅したニューロンのクリアランスのメカニズムについて以前に説明されたものと一致している[69, 71-74]。再活性化中のTGで観察されるIba1発現細胞が、常駐集団の拡大(図5)なのか、周辺部からのマクロファージの浸潤なのか、中枢神経系からのミクログリアの浸潤なのかは、現在のところわかっていない。

末梢神経損傷に応答して、細胞デブリを貪食するための中枢神経系ミクログリアの末梢神経系への移動が報告されている[75]。末梢神経系におけるこれらのIba1+細胞のさらなる表現型およびHSV再活性化におけるそれらの役割については現在進行中である。

 

ここで同定したIba1+細胞に加えて、CD4+およびCD8+ T細胞、B細胞、およびCD11b+またはF4/80+マクロファージを含む、潜伏感染した神経節の細胞浸潤において、他のいくつかの細胞型が同定されている[16]。

これらのうち、CD4+およびCD8+ T細胞は急性感染の解決に重要であることが示されており[44]、また、糖タンパク質B上のエピトープに向けられたCD8+ T細胞は潜伏状態を維持すると仮定されており[76]、これがMHCクラスIの発現に依存しているという証拠がある[77]。

さらに、CXCR3+ CD8+ T細胞は、再活性化刺激後のTGおよび上皮表面で増加することが示されており、これは表面でのウイルス脱落の減少と相関しているが、TGでの転帰は調べられなかった[78]。また、調節性T細胞がCD8+ T細胞を抑制し、HSVの再活性化を促進するように機能することも提案されている[79]。

驚くべきことに、我々の研究では、CD4およびCD8コアセプターの喪失は、ウイルスタンパク質陽性ニューロンの数、感染性ウイルスの産生、または48時間phsにおける再活性化ニューロンの断片化状態への進行に関して、再活性化に変化を与えなかった。さらに、CD4/CD8 T細胞の機能が失われても、HSV再活性化を支持するニューロンに対する細胞応答は無傷のままであった。

これらの研究の一つの注意点は、生体内試験(in vivo)抗体治療によりCD4およびCD8表面受容体が検出不可能なレベルまで減少した一方で、一部のT細胞がまだ神経節内に存在していたことである(CD3+、TCRβ+と定義される)。

これらのT細胞は試験管内試験(in vitro)または生体内試験(in vivo)ではHSV抗原に反応しなかったが、T細胞は抗原に依存しないメカニズムでHSV再活性化に反応する可能性がある[80, 81]。サイトカインシグナル伝達を介してウイルスの広がりを制限するT細胞の役割は、T細胞欠損マウスにおける長期のHSV感染を調べたRamakrishnaらの研究によって支持されている[82]。

CD3+CD4-CD8-のような他のT細胞集団が神経節内に存在したままであり、HSV再活性化の解決にも役割を果たしている可能性があることに注意することは重要である[83, 84]。

 

HSV再活性化の結果として神経系に損傷が生じる可能性は、アルツハイマー病などの神経疾患の発症に寄与することが提案されている[6-8, 85]。

HSV再活性化を支持するニューロンの少なくとも一部がこのイベントを生き残らないこと、およびアシクロビル投与治療がニューロン再活性化に関連する断片化を変化させることができるという我々の発見は、神経系におけるHSV感染の長期的な影響を理解するための現在進行中の研究に貢献している。