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Pathological Aspects of COVID-19 as a Conformational Disease and the Use of Pharmacological Chaperones as a Potential Therapeutic Strategy

Pathological Aspects of COVID-19 as a Conformational Disease and the Use of Pharmacological Chaperones as a Potential Therapeutic Strategy

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC900/

コンフォメーション病

アルツハイマー病やパーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ALS)やプリオン病などの神経変性疾患は、誤った立体構造をとった（ミスフォールディング）蛋白質が凝集体を形成し蓄積することが要因として知られており、これらは「コンフォメーション病」と総称されている。

要旨

年12月に中国・武漢で初報告された7番目のヒトコロナウイルス感染症「コロナウイルス病（COVID-19）」は、その後、世界的に急速に拡大した（死亡者数251,059人、年5月5日、ジョンズ・ホプキンス大学）。初期の臨床報告では、発熱、咳、倦怠感、喀痰分泌、筋肉痛が初期症状であり、病状の進行に伴って肺炎を発症していた。重症患者では血清肝酵素、D-ダイマー、心筋トロポニンI、クレアチニンの上昇が認められ、多臓器不全を起こしていることが示唆された。

リンパ減少やインターロイキン-6（IL-6）の増加も認められた。COVID-19患者には、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）感染症に対する過剰な免疫反応を治療するためにグルココルチコイド療法が行われているが、この療法の有効性は不明である。

重症症例ではウイルス感染が認められ、II型肺胞上皮細胞のほか、血管内皮細胞、心筋細胞、腎尿細管細胞、神経細胞、リンパ球など多くの細胞型が障害を受けている可能性が示唆されている。生存率の向上には、ウイルス感染時に細胞が損傷を受けるメカニズムの解明が必要である。

抗ウイルス療法に加えて、酸素療法、人工換気、体外膜酸素療法、人工透析などの臓器支援システムとともに、細胞治療が必要である。感染した宿主細胞におけるウイルスの複製は、小胞体（ER）におけるタンパク質の折り畳みを乱し、ERストレスを引き起こす可能性がある。しかし、ウイルスの増殖が続くと、炎症や細胞死を引き起こす可能性がある。

したがって、我々は、プロテオスタシス機能不全がCOVID-19のコンフォメーション障害を引き起こす可能性があることを提案する。また、COVID-19患者に対する薬理学的シャペロン療法の応用についても検討した。

キーワード SARS-CoV-2、COVID-19、ERストレス、アンフォールドタンパク応答（UPR）、アポトーシス、プロテオスタシス、薬理学的シャペロン、BiP

序論

コロナウイルス疾患（COVID-19）を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）は、ヒトコロナウイルスのBetacoronavirus属に属する;SARS-CoV-2および近縁のSARS-CoVは系統Bに属し、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）は系統Cに属し、SARS-CoVおよびMERS-CoVは死亡率の高い重篤な呼吸器疾患を引き起こしている。

SARS-CoV-2は、29,903塩基の一本鎖RNA分子からなるゲノムを有するエンベロープ型ウイルスである。ウイルスは、RNAゲノム、脂質膜、スパイク糖タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質の4つの構成タンパク質から構成されている。 SARS-CoVと同様に、スパイク糖タンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質は、SARS-CoV-2の複製の際にリボソームによって合成され、小胞体（ER）膜に挿入される。新たに合成されたポリペプチドは、カルネキシンなどのER分子シャペロン（Fukushi er al）。成熟したウイルスタンパク質は、ERからER-ゴルジ中間コンパートメントへと輸送され、そこで、ウイルス粒子は、これらのタンパク質とヌクレオカプシドタンパク質、RNA、および脂質膜から組み立てられる。ウイルス粒子は、分泌経路に沿って形質膜に運ばれ、細胞から分泌される。SARS-CoV-2ウイルス粒子を形成するタンパク質のうち、1,273アミノ酸の大きな分子量を有するスパイク糖タンパク質は、N-linkedグリコシル化を示し、宿主細胞へのSARS-CoV-2の侵入およびそれに伴う細胞損傷を媒介する上で重要な役割を果たしている。

SARS-CoV-2は、目、鼻、口の粘膜または気道の上皮細胞に侵入する。SARS-CoV感染症と同様に、ウイルスの侵入時に、SARS-CoV-2のスパイク糖タンパク質は、宿主細胞の細胞表面に発現しているアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）タンパク質に付着し、これを受容体として利用する。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質は、宿主セリンプロテアーゼであるTMPRSS2によってプライミングされ、これによってACE2に結合する能力が付与される。ACE2は、口腔および鼻粘膜、鼻咽頭、肺、胃、小腸、結腸、皮膚、リンパ節、胸腺、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、および脳などの様々な器官で発現している。スパイク糖タンパク質は、細胞表面に発現しているACE2以外の分子を認識することが示唆されている。SARS-CoV-2のスパイク糖タンパク質の構造解析から、このタンパク質が細胞表面のグルコース調節タンパク質78（GRP78）に追加的に結合することが示唆されている。GRP78は、ERシャペロンである結合免疫グロブリンタンパク質（BiP）としても知られている。

ERストレスとUPR

分泌タンパク質や膜タンパク質は、リボソームによって小胞体膜上で合成され、小胞体に挿入される。これらの新生ポリペプチドは、BiP、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）、カルレティキュリン、カルネキシンなどのER分子シャペロンと相互作用して、正しい折り畳み、糖鎖修飾、および複合体形成を受ける（Wang and Kaufman, ; Rapoport et al ）。正しく折り畳まれたタンパク質は、コートプロテインコンプレックスII（COPII）小胞によってERからゴルジ装置に分泌され、その後、形質膜に輸送される。ホルモンなどのタンパク質は細胞から分泌されるが、Gタンパク質共役受容体（GPCR）などの他のタンパク質は細胞表面受容体として細胞膜上に発現する（図1）。

図1

新しく合成されたポリペプチドは小胞体（ER）に挿入される。適切に折り畳まれたタンパク質は分泌経路に運ばれる。BiPなどのERシャペロンとの相互作用により、新生タンパク質の適切な折り畳みが促進される。成熟したタンパク質は、コートプロテインII（COPII）小胞輸送を介して分泌経路に放出される。BiPのようなKDELタンパク質の一部は、折りたたまれていないタンパク質と結合して分泌され、これらのタンパク質はKDEL受容体を介してシスゴルジからCOPI小胞輸送を介してERに回収される。

BiPは小胞体の主要な分子シャペロンであり、その多くは、活性化転写因子6（ATF6）、イノシトール要求性キナーゼ1（IRE1）、PKR様小胞体関連キナーゼ（PERK）などの小胞体膜タンパク質と結合して小胞体腔内に分布している。BiPは、さらに、折り畳まれていない新生ポリペプチドを結合させ、凝集体を形成することなく適切に折り畳むことを保証する。

虚血、酸化ストレス、栄養不良、毒性物質への曝露などの外的要因や、突然変異タンパク質の産生をもたらす遺伝的異常などの内的要因は、ERにおけるタンパク質の折り畳みを混乱させる。ER内で適切な三次元構造または複合体を形成することができないミスフォールドされたタンパク質の蓄積は、ERストレスを引き起こし、アンフォールドされたタンパク質応答（UPR）として知られる適応細胞応答を導く。

BiPは、ミスフォールドされたタンパク質に結合し、ATF6、IRE1、およびPERKから解離し、これらの膜タンパク質の活性化をもたらす。ATF6は2型の膜貫通型タンパク質で、ERからゴルジ複合体に運ばれ、そこで細胞質アミノ末端側の切断を受けて転写因子となる。ATF6は核に移動し、ER分子シャペロンをコードする遺伝子など、UPRに関与する遺伝子の転写を誘導する。IRE1とPERKはホモ多量体を形成し、自己リン酸化により活性化される。IRE1はRNase活性を持ち、X-box binding protein-1 （XBP-1） mRNAをスプライシングする。スプライスされた形態はXBP-1タンパク質に翻訳され、転写因子として作用し、UPRの進行を媒介する。

IRE1はまた、c-jun N末端キナーゼ（JNK）などのマイトジェン活性化タンパク質、炎症を誘発し、オートファジーを促進する。PERKは、真核生物の開始因子2α（eIF2α）をリン酸化し、一般的なタンパク質翻訳の抑制につながり、ER上の新しく合成されたアンフォールドポリペプチドの負荷を減少させる。UPRは、ER分子シャペロンなどの細胞保護分子の産生増加、大部分のタンパク質のタンパク質翻訳の抑制、ミスフォールドされたタンパク質の分解の促進（ER-associated degradation; ERAD）を促進する（図2）。

図2

ERストレスは、アンフォールドタンパク応答（UPR）を誘発し、ER内にアンフォールドタンパクの蓄積を引き起こす。本質的な欠陥（配列の変異、サブユニットの欠落など）や外傷（虚血、栄養失調、低酸素、毒性など）が原因でタンパク質のフォールディングが障害されると、ミスフォールディングされたタンパク質が小胞体に蓄積される。

BiPはATF6、IRE1α、PERKから解離し、誤って折り畳まれたタンパク質と結合する;BiPからの解離はUPRを開始する。ATF6はゴルジ体に運ばれ、そこで切断されて細胞質部分が核に運ばれ、転写因子として機能し、ERストレス応答エレメント（ERSE）と結合し、UPRに重要な遺伝子の転写を促進する。BiPから解離した後、IRE1α、PERKは多量体化し、自己リン酸化により活性化される。IRE1αは、セリン/スレオニンキナーゼドメインとエンドリボヌクレアーゼドメインを細胞質のカルボキシル末端に持つI型膜タンパク質である。

活性化されたIRE1αはXBP1 mRNAをスプライシングする。XBP1タンパク質は、UPRに必要な様々な遺伝子の転写領域にあるUPRエレメント（UPRE）に結合し、その転写を促進する。PERKはセリン/スレオニンキナーゼであり、eIF2αをリン酸化して不活性化することで、ほとんどのタンパク質の翻訳を停止させる。

しかし、ATF4の翻訳は誘導される。ATF4は転写因子として作用する。UPRは、シャペロン産生、翻訳抑制、およびER関連タンパク質分解（ERAD）を介して、ミスフォールドされたタンパク質の増加レベルに対処する細胞の能力を増強する。IRE1αの活性化は、MAPキナーゼ（JNK）とNF-κBの活性化を介して炎症を引き起こし、TNF-αやIL-6などの炎症性サイトカインの発現上昇を誘導する。持続的な小胞体ストレスはCHOPの発現を誘導し、アポトーシスを引き起こする。

このようにして、ER内のミスフォールドされたタンパク質を処理する細胞の能力が拡張され、細胞はある程度までERストレスに耐えることができる。しかし、高いウイルス負荷のようなより大きな侵入によるミスフォールドタンパクの過剰負荷に応答して、UPRは延長される。PERKの活性化は、ATF4の発現を誘導し、転写因子C／EBP相同タンパク質（CHOP）の産生をもたらし、これは、抗アポトーシスBcl-2のダウンレギュレーションを誘導し、アポトーシス細胞死をもたらす。

持続的な小胞体ストレスはCa2+の恒常性を緩和する。ERはCa2+の主要なプールを構成し、BiPなどのER分子シャペロンはCa2+を結合することができる。ERストレスは、ERからのCa2+の流出とミトコンドリアへのCa2+の流入を誘導し、チトクロムCの放出とカスパーゼ9と3の活性化を引き起こし、アポトーシス、細胞死をもたらす。

プロテオスタシスとコンフォメーション病

プロテオスタシスネットワークは、ER分子シャペロンやヒートショックプロテイン70（HSP70）などの細胞質分子シャペロンとの相互作用によって媒介され、タンパク質の適切なフォールディングと複合体の組み立てを確保するための品質管理プロセスとして機能している。プロテオスタシスの失敗は、ミスフォールドされたタンパク質の蓄積をもたらし、これは、ERにおけるUPRおよび細胞質におけるヒートショック応答を含む持続的な統合ストレス応答。

ミスフォールドされたタンパク質の蓄積とERストレスは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病などの神経変性疾患と関連している。）、心筋症、肺線維症、慢性腎管疾患、糖尿病、肥満、ヒトおよび動物モデルにおける老化などの疾患が挙げられる。呼吸不全および虚血再灌流傷害などの急性疾患は、さらに、ERストレスおよびUPRの誘導を伴う。

遺伝子変異により、いくつかのタンパク質はプロテオスタシスネットワークを回避し、細胞内外でタンパク質の凝集を引き起こす可能性がある。アルファ1-アンチトリプシン欠損症（AATD）は、分泌タンパク質であるアルファ1-アンチトリプシン（AAT）をコードするSERPINA1遺伝子（セリンプロテイナーゼ阻害剤、A群、メンバー1）の突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患である。AATDにおけるこのタンパク質の最も一般的な変異体であるAATのZ変異体は、適切なフォールディングを受けずに肝細胞のERに蓄積され、これがERストレスと細胞機能不全を引き起こす。さらに、AATは血液中の好中球セリンプロテアーゼの活性を阻害する。したがって、適切に折り畳まれたAATの欠乏は、好中球セリンプロテアーゼの活性化を引き起こし、肺損傷をもたらす。遺伝性疾患のもう一つの例である嚢胞性線維症は、肺や膵臓などの上皮細胞に発現する塩化物イオンチャネルである嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）タンパク質の変異によって引き起こされる。CFTR遺伝子の最も一般的な突然変異であるF508delは、障害されたトラフィッキングを示す変異型CFTRの翻訳をもたらす。CFTRの細胞表面発現の損失は、厚い粘液の産生および下駄の形成をもたらす。ERにおけるF508del変異体CFTRの蓄積は、ERストレスを誘導し、気道上皮における細胞機能不全および炎症を引き起こし、そして自然免疫細胞によるインターロイキン-6（IL-6）および腫瘍壊死因子α。

リン脂質および肺サーファクタントタンパク質（SP）-A、-B、-C、および-Dからなる肺サーファクタントは、肺胞表面張力を低下させ、自発的な生理的呼吸を促進する。SP-C前駆体は、アミロイド形成を防止するBRICHOSドメインを含む。SP-C遺伝子のBRICHOSドメインにおけるいくつかの変異は、タンパク質の凝集およびERストレスを誘導し、その結果、細胞死および慢性間質性肺疾患を引き起こすことが報告されている（Beers and Mulugeta, ; Peca et al ）。嗅覚GPCRのようないくつかのタンパク質は、その固有の構造のために、適切に折り畳むことが困難である。GPCRは、膜を7回貫通する非常に複雑な構造を持つ膜タンパク質である;この複雑な構造のために、通常の遺伝子配列を有するにもかかわらず、初期化ポリペプチドは、すべてが適切なフォールディングを受けないことがある。多くの新生ポリペプチドは、誤って折り畳まれ、ER内に保持され、ERADおよびオートファジーによって分解されることがある。

プロテオスタシスの機能不全に関連する疾患は、コンフォメーション病（Carrell and Lomas, ; Kopito and Ron, ）として知られており、様々な細胞型で発生し、それに対応する臓器特異的な症状を特徴としている。このようなコンホメーション疾患は、特定のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされることがあり、その結果、誤って折り畳まれた突然変異タンパク質の凝集が生じることもあるが、プロテオスタシスシステム自体の機能不全によって引き起こされることもある。BiPはERに存在する腔内シャペロンであり、アンフォールドされたタンパク質に結合したBiPタンパク質の一部は、COPII小胞によってERから分泌される。ゴルジ体では、BiPのLys-Asp-Glu-Leu（KDEL）カルボキシル末端がKDEL受容体に認識され、COPI小胞を介してBiPがERに戻るのを促進する。このKDEL回収システムは、プロテオスタシスネットワークの一部である。正常なBiPの代わりに、KDELアミノ酸配列が欠失した変異BiPを発現するホモ接合ノックインマウスは、メンデルの法則に従って生まれてくる。その結果、すべてのホモ接合変異型BiPマウスは、出生後1日目に新生児急性呼吸窮迫症候群。これらのマウスのII型肺胞上皮細胞では、界面活性剤タンパク質の折り畳みが障害され、肺の界面活性剤の分泌が失われていた。また、誤って折り畳まれた界面活性剤タンパク質が小胞体に蓄積することで小胞体ストレスが発生し、CHOPの発現が誘導され、アポトーシスが誘発されることがわかった。肺胞を開放して呼吸を可能にする肺サーファクタントの産生・分泌には、個々のサーファクタント蛋白質が正しく折り畳まれていることが必要である。このように、プロテオスタシスは肺サーファクタントの生産と分泌に重要な役割を果たしている。

慢性合併症とプロテオスタシス

散発的な神経変性疾患は、しばしば加齢に伴うものである。ヘテロ接合変異BiPマウスは生存能力があり、その寿命は野生型マウスのそれと大きな差はない。しかし、これらのマウスは野生型BiPに加えて、KDEL配列を欠いた変異BiPも発現している。変異型BiPに結合したミスフォールドされたタンパク質は、たとえERから分泌されたとしても、ゴルジ体複合体のKDEL受容体に認識されることなく、プロテオスタシスネットワークから脱出する可能性がある。高齢変異BiPマウスでは、脊髄や脳でユビキチン化したタンパク質の凝集が観察された。運動機能障害および認知機能障害が追加的に観察された。加齢に伴い、腎尿細管障害などの臓器症状も認められた。プロテオスタシスの減衰は、急性の細胞機能障害や細胞死だけでなく、慢性の細胞機能障害や臓器障害を引き起こす可能性がある。プロテオスタシスネットワークにおいて重要な役割を果たすERシャペロンの機能は、加齢とともに低下する。

前臨床研究は、血管内皮細胞、心筋細胞、肺胞上皮細胞、神経細胞、およびリンパ球が、高血圧などの併存疾患を有する個人において、すでにERストレスにさらされている可能性を示唆している（Hasty and Harrison, ; Young, ; Ochoa er al）。）、糖尿病、肥満、慢性閉塞性肺疾患、および神経変性疾患。肥満は、プロ炎症性サイトカイン、TNF-α、およびIL-6の発現上昇を誘導するマクロファージと同様に、脂肪細胞において慢性的な炎症を引き起こす。薬理学的シャペロンによるERストレスの緩和は、食事誘発性肥満マウスにおいてNF-κB活性と炎症を抑制する（Chen er al）。

合併症患者や高齢者では、ER内のタンパク質フォールディングがある程度損なわれていると考えられており、さらなるERストレスに対応するためのUPRの能力が制限されている可能性がある。その結果、そのような個体におけるプロテオスタシスは、例えば、ウイルスタンパク質過負荷のような条件下では、ERにおける更なるストレスに対して敏感であり得る（Hrincius et al ; Guan et al ; Zhou et al a）（図3）。

図3

慢性的な併存疾患はERストレスと関連している。合併症患者や高齢者では、ER内のタンパク質フォールディングがある程度損なわれているため、さらなるERストレスに対応するUPRの能力が制限されている可能性がある。

SARS-COV、SARS-CoV-2、ERストレス

SARS-CoV-2のゲノムの組織はSARS-CoVのそれと密接に関連しており、両ウイルスのタンパク質の構造は類似している。さらに、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2の両方は、宿主細胞上に発現する同一のACE2受容体を認識し、ウイルスの侵入は、それらのスパイク糖タンパク質を介して媒介される。両方のウイルスは、それらの複製のために宿主細胞のタンパク質翻訳機械を利用する。SARS-CoVおよびSARS-CoV-2のスパイク糖タンパク質、膜タンパク質、およびエンベロープタンパク質は、リボソームによって翻訳された後、ERに挿入され、そこでタンパク質の折り畳みおよびグリコシル化を受ける。SARS-CoVおよび他のウイルスに関する前臨床研究では、急速なウイルス複製の結果として、初期化されていないウイルスポリペプチドがER内に蓄積し、ERストレスを引き起こす可能性があることが明らかにされている。

SARS-CoV感染患者では、肺、脾臓、リンパ節で肺細胞、TおよびBリンパ球、単球のアポトーシスが起こることがわかっている。リンパ球減少症およびCD4陽性およびCD8陽性T細胞数の減少は、SARS患者の疾患経過の初期に観察されている。 SARS-CoVを培養細胞で発現させると、スパイク糖タンパク質がERに蓄積し、UPRを誘導した。また、BiPやGRP94などの分子シャペロンの転写に加え、CHOPの発現も誘導された。この研究から、SARS-CoV が UPR を誘導した場合、ATF6 は活性化せず、代わりに PERK が優先的に活性化され、eIF2α のリン酸化と転写因子 ATF4 の活性化を介して CHOP が誘導されることが示唆された。SARS-CoV感染培養細胞では、ER内のアクセプター3αタンパク質の蓄積が見られ、PERKの活性化、ATF4およびCHOPの誘導につながることがさらに観察された。 SARS-CoVオープンリーディングフレーム（ORF）8bタンパク質もまた、感染細胞において凝集を受け、ERストレスを誘導することが見出されている。SARS患者におけるこれらの臨床観察およびSARS-CoVの前臨床研究は、SARS-CoV感染が感染細胞においてERストレスおよびそれに続くアポトーシスを誘導することを示唆している。

いくつかの研究は、ACE2媒介シグナル伝達がERストレスの影響を減少させることを示唆している。リガンドであるアンジオテンシン1-7によるACE2の刺激は、変異型界面活性タンパク質Cの蓄積を伴う歯槽上皮細胞において、ERストレスによって媒介されるアポトーシスを抑制する。スパイク糖タンパク質によるACE2の脱落は、ERストレスを悪化させる可能性がある。喘息や慢性閉塞性肺疾患などの疾患を有する個人は、健康な人と同様のレベルのACE2発現を有するが、タバコを吸う人は発現が上昇している。これらの併存疾患を有する人が、そのACE2発現レベルに基づいてSARS-CoV-2感染のリスクが増加しているかどうかは不明である。

MERS-CoVのスパイク糖タンパク質は、ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP4）を受容体として認識する;BiPに結合したDPP4は、DPP4単独よりも強く認識され、感染性が増強される。ERストレス下では、UPRはBiPの産生を誘導し、KDEL受容体による逆輸送を飽和させる。これは、ゴルジ体から細胞表面へのBiPのミスソートをもたらすと考えられている。BiP分子の中には細胞外に分泌されるものもあれば、カルボキシル末端付近のプロリンに富んだ領域を介して細胞膜に付着するものもある。細胞膜上に発現するBiPは、細胞表面受容体としてシグナル伝達に関与している可能性がある。SARS-CoV-2のスパイク糖タンパク質は細胞表面でBiPを認識する可能性がある;したがって、ERストレスは、様々な併存疾患を持つ患者や高齢者において感染性を高める可能性がある（図4）。

図4

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）への感染は、ERストレスを引き起こし、UPRとして知られる適応応答を誘発する可能性がある。SARS-CoV-2はACE2を発現する細胞に感染する。中近東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）感染症で観察されるように、細胞表面のBiPは感染性を高める可能性がある。成熟したウイルスタンパク質は、小胞体から小胞体-ゴルジ中間コンパートメント（ERGIC）に輸送され、そこでは、これらのタンパク質、核カプシドタンパク質、RNA、脂質膜と同様に、ウイルス粒子が組み立てられる。ウイルスタンパク質の複製はERストレスを引き起こし、これはUPRのために細胞によって許容される。嗅覚受容体や味覚受容体のようなGPCRのような不安定なタンパク質は、ERADの影響を受けやすい可能性がある。

COVID-19のコンフォーメーション病としての疾患

SARS-CoV-2の侵入は、目、鼻、口の粘膜を介して起こる。これに続いて、発熱、咳、倦怠感、喀痰の分泌、息切れ、および筋肉痛などの症状が出現するが、多くの感染者は明確な症状を示さないが、感染した人の中には、味覚および嗅覚の異常を訴える人もいる。一部の人は、初期症状として味覚および嗅覚の異常を訴える。嗅覚は、嗅細胞の表面に発現する様々な嗅覚受容体によって感知される。嗅覚受容体はGPCRであり、膜を7回貫通する複雑な構造を持っている。その結果、嗅覚受容体のナッセントペプチドは高いミスフォールディング率を示し、ミスフォールディングされたペプチドはER内に保持され、ERADやオートファジーによって分解される。味覚は、味覚受容体タイプ1（T1R）および味覚受容体タイプ2（T2R）受容体によって感知されるが、これらはまた、舌、軟口蓋、および喉頭蓋の味蕾に分布する味覚細胞に発現する7つの膜貫通型GPCRタンパク質である。これらの受容体タンパク質のフォールディングは、SARS-CoV-2感染によるプロテオスタシスの障害を受けやすいと考えられている。

COVID-19患者における最も一般的な致死的合併症は肺炎であり、次いでARDSである（Guan et al ;Huang et al ;Yang et al ;Zhou et al a）。低酸素血症を自覚しない患者もいる。肺炎のCT所見を有するCOVID-19患者のうち、発熱および咳などの他の症状を伴わない患者が報告されている。この無症候性の無症候性肺炎は、炎症ではなく、SARS-CoV-2に感染したII型肺胞上皮細胞における肺サーファクタントの合成障害が原因である可能性がある。

重症患者では、IL-6、IL-2、IL-7、IL-10、G脳脊髄液、IP10、MCP1、MIP1A、およびTNF-αなどのサイトカインの血清レベルが上昇している。COVID-19の肺炎およびARDSは、重度のサイトカインストームである過剰な全身炎症に起因すると考えられている;したがって、これらの患者にはコルチコステロイドが投与される（Guan et al ; Huang et al ; Zhou et al a）。しかしながら、SARS、MERS、およびCOVID-19の臨床データは、コルチコステロイドの臨床的有効性を支持していない。血管壊死、ウイルスクリアランスの遅延、精神病、糖尿病などの合併症がSARS患者で観察されている。世界保健機関は、COVID-19に対するコルチコステロイドの使用を推奨していない。重症のCOVID-19患者において、低リンパ球数が観察されている）。さらに、過剰な全身性炎症が、COVID-19を有する患者において観察される細胞損傷にどの程度寄与するかは、依然として不明である。

COVID-19の病因に関する追加の説明は、SARS-CoV-2の細胞内複製自体が宿主細胞に対して細胞毒性を有することである。SARS-CoV-2は、II型肺胞上皮細胞などのACE2発現細胞に感染し、宿主細胞のタンパク質翻訳機序を乗っ取ることで増殖する。新規コロナウイルスの主要構成タンパク質であるスパイク糖タンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質は、ERに共翻訳的に挿入されている。このような新生ウイルスポリペプチドの爆発的な産生は、ERストレスを引き起こし、UPRを誘発する可能性がある。ほとんどの個体では、細胞がウイルス感染によるERストレスに耐える能力を持っているのは、UPRがプロテオスタシスの能力を拡張し、感染した細胞が生存できるようにするためである（図4）。しかし、ウイルスのタンパク質複製の負担がUPRによって収容できなくなると、宿主細胞での機能性タンパク質の産生が抑制され、細胞機能が損なわれ、最終的にはアポトーシスに至る（図5）。II型肺胞上皮細胞における肺サーファクタントの集合・分泌は、プロテオスタシスの障害に敏感であり、II型肺胞上皮細胞のアポトーシスに加えて、肺サーファクタントの分泌が失われると、ARDSを引き起こす可能性がある。COVID-19患者の肺組織の超微細構造研究では、II型細胞の細胞質にウイルス粒子が存在し、ミトコンドリアが著しく膨潤し、ERが拡張していることが明らかになった。肺細胞では、ピロプトーシスおよびアポトーシスが観察された。IL-6、IL8、TNF-α、IP10、MCP1およびRANTESを含む血清サイトカインの上昇を伴う、肺組織におけるCD68+マクロファージおよび好中球の大量浸潤も観察された。SARS患者では、SARS-CoV感染した肺の肺胞上皮細胞やマクロファージなどのACE2発現細胞において、MCP-1、TGF-β、TNF-α、IL-1β、およびIL-6などのプロ炎症性サイトカインの発現がアップレギュレートされていた。ウイルスのERストレスによって活性化された自然免疫が本疾患に寄与している可能性がある。

図5

SARS-CoV-2の爆発的な複製は、持続的なERストレスを誘発し、炎症とアポトーシスを引き起こす可能性がある。SARS-CoV-2の複製速度が非常に速いため、ERストレスがUPRでは収容できないレベルまで増大し、炎症やアポトーシスを引き起こす。併存疾患を有する患者は、プロテオスタシスの能力が限られており、ウイルスタンパク質の過負荷によって引き起こされるERストレスに敏感である可能性がある。薬理学的シャペロンがERストレスを軽減する可能性がある。

SARS-CoV-2は最初に上気道および下気道の上皮細胞に侵入し、重度のCOVID-19を有する患者ではウイルス感染が観察されている。ACE2は、腎臓、精巣、腸管、心臓などの複数の臓器や血管内皮細胞で発現している。感染細胞内でのウイルスタンパク質の爆発的な産生とその結果としてのERストレスの上昇は、宿主細胞のプロテオスタシスを損ない、機能性タンパク質の翻訳の抑制を誘導し、アポトーシスを誘発する可能性がある。血清肝酵素、Dダイマー、心筋トロポニンI、クレアチニン、およびリンパ球減少症のレベルの上昇が重症患者で観察されている。COVID-19で死亡した患者の逐次臓器不全評価（SOFA）スコアが高いことが報告されており、これらの患者は、腎機能障害、肝機能障害、心血管機能障害、胃腸障害、神経細胞障害、および免疫抑制を含む多臓器不全を有していたことを示している。COVID-19を有する患者の病理学的分析は、血管内皮細胞におけるウイルス粒子の存在を示した。ウイルスの直接感染は、肺、心臓、腎臓、肝臓、および小腸を含む複数の器官において、びまん性の血管内皮炎症を引き起こした。小腸および肺検体における内皮細胞および単核細胞におけるカスパーゼ3およびアポトーシス体の誘導が観察されている。

SARS-CoV-2または感染細胞の除去は、COVID-19の「治療」を表すことになるが、SARS-CoV-2は、宿主のUPRによって細胞機能不全が許容される状態で、感染細胞内で増殖し続ける可能性がある。結果として生じる不顕性感染の持続期間は不明である。SARS-CoV-2の慢性感染が、間質性肺炎、尿細管間質性腎線維症、神経変性疾患など、感染した細胞や臓器に慢性的なコンホメーション疾患を引き起こすかどうかは依然として不明である。

COVID-19の治療戦略としての薬理学的シャペロンの利用について

ウイルスRNAポリメラーゼを阻害するヌクレオチドアナログプロドラッグであるレムデシビルのようないくつかの薬剤は、抗SARS-CoV-2治療のために有望であるように思われる。感染の後期、すなわちウイルスの伝播が起こり、細胞死が開始される時期に抗ウイルス療法を投与すると、効果が限定的になり、細胞死および死亡が避けられない可能性がある。抗ウイルス療法は、急速なウイルス複製の発症前に行うべきである。界面活性剤補充療法は、呼吸機能の改善に有効である可能性がある。さらに、ERにおけるタンパク質フォールディングを促進する薬理学的シャペロンの治療効果は、ERストレスの緩和、および細胞機能障害、炎症およびアポトーシスの抑制に関与すると考えられており、したがって、COVID-19における有望な治療戦略を表している。薬理学的シャペロン療法は、さらに、感染細胞が生きている状態で抗ウイルス療法を行うことにより、患者を効果的に治療するための「より多くの時間を稼ぐ」可能性がある。

タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）および4-フェニル酪酸（PBA）などのいくつかの薬理学的シャペロン候補は、この文脈において有望な治療手段を提供し得る。TUDCAは、現在までのところ、前臨床的および臨床的に最もよく研究されている。TUDCAはウロデオキシコール酸（UDCA）のタウリン抱合体であり、胆汁酸の分泌を促進し、肝細胞保護作用を発揮する。原発性胆管性胆管炎の治療薬として、米国食品医薬品局（Food and Drug Administration）から臨床使用が承認されている。ヒトの胆汁酸にはUDCAが含まれており、TUDCA/UDCAは、ERでのタンパク質フォールディングを促進する薬理学的シャペロンとして、様々な疾患の治療にも臨床応用が期待されている。TUDCAは水溶性であり、経口または静脈内投与が可能である。それは、BiPのPERKからの解離を抑制し、eIF2αのリン酸化とATF4-CHOPの誘導を抑制する。その結果、抗アポトーシスBCL-2の発現は増加し、プロアポトーシスBaxの発現は減少し、カスパーゼ-3の活性化は抑制される。薬理学的シャペロンの活性と、心血管系の虚血、低酸素、圧力過負荷などの急性状態に対するTUDCAの抗アポトーシス効果は、培養細胞やマウスモデルを用いた様々な前臨床研究で実証されている。肥満による慢性的なERストレスは、脂肪性炎症を誘導し、インスリン受容体からインスリン受容体基質-1（IRS-1）へのシグナル伝達を抑制し、インスリン抵抗性につながる。TUDCAはこれらのシグナル伝達異常を改善し、脂肪組織の炎症を抑制する。プリオン病やALSなどの神経変性疾患モデルでは、神経細胞内のタンパク質の凝集によるERストレスが緩和され、神経細胞死が減少する。TUDCAとPBAは、インフルエンザAウイルス誘発性炎症を緩和し、肺上皮細胞におけるIL-6の産生を抑制する。

ERストレスによって誘導されるコンフォメーション病に対するTUDCAの臨床試験がいくつか報告されている（表1）。ALSは、変異型Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）などの不安定なタンパク質が運動ニューロンに凝集し、細胞機能障害や細胞死を誘発し、運動障害をもたらす神経変性疾患である。ある試験では、TUDCAを14名の患者さんに1日2,000mgを54週間経口投与したところ、TUDCA投与群ではプラセボ群15名に比べてALS症状の進行が有意に抑制された。各群2名に軽度の下痢が認められたが、その他の副作用は認められなかった。試験期間中、プラセボ対照群で3名、TUDCA処理群で1名が死亡した（Elia er al）。肥満はERストレスを引き起こし、インスリン抵抗性を誘導する。別の臨床試験では、BMIが35以上の肥満患者10人を対象に、1日1,750mgのTUDCAを4週間投与した。その結果、TUDCAを投与した患者では、投与前に比べて肝臓と筋肉のインスリン感受性が有意に上昇したが、プラセボを投与した10名の患者では有意な変化は認められなかった。また、TUDCA投与群の筋肉細胞では、IRS-1およびAkt（プロテインキナーゼB）のリン酸化が亢進し、インスリン受容体シグナル伝達が改善されていた。副作用は報告されなかった。

表1　薬理学的シャペロンを用いた臨床試験の概要

薬剤疾患ハイライト参考文献

TUDCA ALS プラセボ群よりもTUDCA（1gを1日2回、54週間）群の方が進行が遅い（P＜0.01）。 Eur J Neurol. Jan; 23（1）: 45-52.
TUDCA インスリン抵抗性肥満患者にTUDCA（1,750mg/日）を4週間投与したところ、肝・筋インスリン感受性が約30%上昇した（P＜0.05）。 Diabetes. 年8月;59（8）:-905。
TUDCA 内皮機能障害高血糖症による内皮機能障害は、TUDCA（mg）の経口投与により緩和される。 Clin Sci （Lond）. Nov 1; 130（21）: -.
TUDCA トランスサイクリンアミロイドーシスドキシサイクリン（100mg BID）とTUDCA（250mg 3回/日）を12ヶ月間継続して経口投与することで、神経障害と心筋症の非進行が得られた。アミロイド。 Jun;19 Suppl 1:34-6.
PBA ALS 9～21g/日の薬物投与を受けた26名が20週間の治療期を終了した。PBAは安全で忍容性があった。筋萎縮性側索硬化症。 Apr;10（2）:99-106.
PBAインスリン抵抗性 2週間の経口PBA（7.5g/日）はERストレスを軽減し、肥満ヒトの脂質誘発性インスリン抵抗性とβ細胞機能障害を部分的に緩和する。糖尿病である。年3月;60（3）：918-924。
UDCA ALS 15、30、50mg/kg/日の用量で4週間経口投与した場合、忍容性が高く、用量依存的に血液脳関門を通過する。 Clin Neuropharmacol. 年1月～2月、33（1）:17-21。
AMX（TUDCA・PBA）アルツハイマー病治療薬「AMX」の安全性と生物学的活性を評価するためのアルツハイマー病試験 clinicaltrials.gov/。
AMX ALS ALS患者に対するAMXの長期的な安全性と治療効果の評価 clinicaltrials.gov/

経口投与されたTUDCAは、腸肝循環のため、ほとんどが肝臓で代謝される。このため、十分な量では全身循環への分配が制限される可能性があるため、静脈内投与や皮下投与の方が全身的に有効である可能性がある。

おわりに

TUDCAなどの薬理学的シャペロンは、感染細胞のプロテオスタシスを促進し、機能性タンパク質の適切な折り畳みを維持し、炎症やアポトーシスの進行を抑制すると考えられている。その結果、SARS-CoV-2感染細胞の生存、ひいてはウイルスの生存につながる可能性がある。したがって、抗ウイルス療法と薬理学的シャペロン療法を同時に投与することにより、この2つのモダリティは、COVID-19の有望な治療戦略を構成する可能性がある。