P糖タンパク質:アルツハイマー病におけるアミロイドβの輸出に役割を果たすか?

強調オフ

イベルメクチン毒性学・薬理学血液脳関門

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P-glycoprotein: a role in the export of amyloid-beta in Alzheimer’s disease?

Amanda B. Chai1, Gavin K. F. Leung1, Richard Callaghan2, Ingrid C. Gelissen1

1 シドニー大学医学部薬学部、オーストラリア

2 オーストラリア国立大学生物学・医学部研究科、キャンベラ、オーストラリア

キーワード

ABCB1; アルツハイマー病; アミロイドβ; 血液脳関門; P糖タンパク質

I. C. ゲリセン 薬学部教授

医学と健康の大学

シドニー、シドニー、ニューサウスウェールズ州 2006,オーストラリア

2019年6月24日受領 2019年10月9日改訂 2019年11月19日受理

febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/febs.15148


要約

アミロイドβ(Aβ)ペプチドの蓄積は、アルツハイマー病の脳の病理組織学的特徴の一つである。欠損したクリアランス機構は、可溶性のAβ40およびAβ42オリゴマーの毒性レベルをもたらし、シナプス機能の低下、神経変性および認知機能の低下をもたらす。脳からのAβのクリアランスを促進するために、血液脳関門の内腔側で高度に発現するATP結合カセットトランスポーターであるP糖タンパク質(P-gpまたはABCB1)が関与していることを指摘する証拠が増えている。このレビューでは、我々は、AβクリアランスにP-gpの貢献を検討し、ヒト、動物および試験管内試験の研究からの証拠を要約し、アルツハイマー病の新規薬理学的ターゲットとしてP-gpの可能性について議論する。脳内のP-gpの発現と活性は、加齢、Aβの沈着、アルツハイマー病と逆相関している。さらに、Aβ自体がP-gpの発現を低下させ、それによってAβの沈着と疾患を悪化させることがわかっている。研究の数十年にもかかわらず、アルツハイマー病の病態生理はとらえどころのないままである。Aβペプチドに影響を与える正常と異常な処理およびクリアランスのメカニズムを理解することは、世界中で何百万人もの患者を荒廃させ続けているこの進行性の神経変性疾患と闘うための、より効果的な治療薬の開発を支援することになる。

序論

アルツハイマー病は認知症の主要な原因であり、全診断の80%を占め、世界で推定4,000万人の患者を苦しめている[1,2]。世界的な有病率は20年ごとに約2倍に増加し、2050年には1億3,000万人を超えると予測されている[3]。臨床的特徴としては、進行性の認知機能低下、記憶障害、日常生活活動に支障をきたす実行機能障害などが挙げられる [4]。神経変性の進行を変化させる有効な薬理学的治療法がないことに加えて、代替的な治療ターゲットを特定するために、アルツハイマー病の病態生理である謎をさらに解き明かすことが急務となっている[2,3]。これは、莫大な関連する医療費と患者と介護者の両方のための大幅に損なわれた生活の質の観点から重要である。

病理組織学的には、アルツハイマー病はアミロイドプラークの沈着と脳の海馬と皮質領域における神経原線維のもつれによって特徴づけられる。これらの高度に不溶性の凝集体は、それぞれアミロイドβ(Aβ)ペプチドと高リン酸化タウタンパク質で構成されている [5,6]。増加する証拠は、年齢、遺伝学、炎症、酸化ストレス(OS)生活習慣などが病気の多因子起源であることを示唆している [4,7]。広く認められているアルツハイマー病のAβ仮説は、Aβの蓄積がタウ病理を促進するカスケードの引き金となり、神経毒性、シナプス機能の低下、臨床症状をもたらす主要な因子であると仮定している[2,6]。このことは、いくつかの遺伝学的知見によって裏付けられている。例えば、APP、PSEN1とPSEN2遺伝子の変異は、まれな早期発症家族性アルツハイマー病(家族性アルツハイマー病)の結果、Aβの産生を増加させる。さらに、アポリポタンパク質(Apo)Eの3つのアイソフォームのうちの1つ、すなわちApoE4の発現は、Aβクリアランスに障害を与え、キャリアを散発性の後期発症型アルツハイマー病(高齢発症型アルツハイマー病)に強い素因としている[2,8]。アルツハイマー病脳におけるAβのホメオスタシスへの明らかな障害があり、その認識は多くの抗アミロイド免疫療法の開発につながっていた。しかし、臨床試験の残念な結果は、介入が症状に効果をもたらすには、疾患過程の中で遅すぎることを示唆している[9,10]。したがって、将来の治療戦略は、Aβの初期蓄積を防ぐことに向けられるべきである。

略語

AβC、アデノシン三リン酸結合カセット、アルツハイマー病、アルツハイマー病、Apo、アポリポ蛋白質、APP、アミロイド前駆体蛋白質、Aβ、アミロイドβ、BBB、血液脳関門、脳アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、家族性アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、hAPP、ヒトアミロイド前駆体蛋白質、高齢発症型アルツハイマー病、後期発症アルツハイマー病。LRP-1,低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質1;MDR1,多剤耐性1;OS、酸化ストレス;P-gp、p-糖蛋白質;PICALM、ホスファチジルイノシトール結合性クラスリン集合蛋白質;PXR、プレグナンX受容体;RAGE、高度糖化末端産物受容体;SJW、セントジョンズワート;SNP、一塩基多型。

アミロイドβの形成およびクリアランス

Aβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解に由来する。APP は、アストロサイト、ミクログリア、脳のニューロンを含む全身に発現する膜貫通型タンパク質である。中枢神経系で発現しているAPPは、脳の発達や神経細胞の機能維持に重要な役割を果たしている[11,12]。一方、アミロイド生成経路では、c-セクレターゼによって切断されたb-フォロアーゼによって切断され、Aβ37-43が生成される [5] (図1A)。Aβ40とより疎水性の高いAβ42のアイソフォームが最も一般的であり、Aβ42:Aβ40の比率が高いほど、より大きな毒性や疾患と関連している[13,14]。Aβは急速に除去され、生理学的濃度では重要な神経保護機能を果たす正常な細胞産物であることを強調しておくべきである[12,15]。異常な蓄積の状況でのみ、それは過剰生産(家族性アルツハイマー病で観察されるように)またはクリアランスが損なわれた(高齢発症型アルツハイマー病で最も可能性の高いケースである)Aβは毒性になる[16]。Aβペプチドは、モノマー、可溶性オリゴマー、プロトフィブリルおよび最終的に老人斑として堆積する成熟した不溶性フィブリルを含む7つの形態で存在することができる(図1B)。凝集するAβペプチドの傾向は、濃度依存性である[17-19]。Aβフィブリルに富むプラークが犯人であるという長年の信念にもかかわらず、プラーク密度は疾患の重症度とはあまり相関していない。むしろ、可溶性オリゴマーが細胞死と疾患発症を媒介していることが広く知られるようになった[13,19,20]。Aβ42オリゴマー誘発性神経毒性のメカニズムには、長期増強障害(学習や記憶の基礎となるシナプス可塑性の一形態)カルシウムの不均整、タウの高リン酸化、酸化的損傷、シナプスの損失などがある[19,21,22]。しかし、オリゴマー種のどの特定の形態またはグループが原因であるかはまだ不明である[22,23]。

脳からのAβの除去には複数の因子が関与している(図1C,D)。これらのメカニズムは、「プロテオスタシス」(細胞プロテオームの完全性の恒常的な調節)を促進し、健康な脳では、誤って折り畳まれ、アグリーゲートされたタンパク質の病理学的な蓄積を防ぐ[24,25]。細胞内では、Aβ分解はユビキチン-プロテアソーム系とオートファジー-リソソソーム系によって媒介される [26]。これらのシステム内での機能不全は、加齢やアルツハイマー病を含む神経再生疾患と関連している。プロテアソーム活性はAβによって阻害される可能性があり、これはAPPの処理とAβ産生をさらに促進することが報告されている[27,28]。しかし、Aβ の蓄積は細胞外空間でも起こるため、ペプチドがどのようにして細胞外に出ていくのかという疑問が生じる。エキソソームが役割を果たすことが示唆されている一方で [29,30]、Aβペプチドの疎水性と非常に膜関連性は、細胞からのその構成的な放出は、主にアクティブな輸送に依存していることを示唆している [31]、まだ特定の輸出メカニズムが解明されていない。それにもかかわらず、一度排出されたAβは、ミクログリアおよびアストロサイトによる貪食トーシス、ネプリリリーシン、インスリン分解酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ2,3および9,およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIを含む様々な酵素によるタンパク質分解、または間質および脳脊髄液のバルクフローを介してクリアランスを経る可能性がある[26,32,33]。あるいは、Aβの少なくとも50%は、血液-脳関門(BBB)を横切る直接輸送を介して脳から排出される [34-36]。Aβはアストロサイトやミクログリアから分泌される脂質トランスポータータンパク質であるApoEと結合している可能性があり、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP-1)のリガンドとしても機能している。LRP-1はBBBのAbluminal(脳に面した)表面に位置しており、末梢循環へのAβの輸出に寄与している。LRP-1は、内皮細胞へのAβの取り込みを媒介することができる一方で、それはトランスサイトーシスを促進するために不十分である[38]、末梢へのAβの流出のための第二のトランスポーターの必要性を示唆している。最近、ATP結合カスセット(AβC)トランスポータースーパーファミリーのいくつかのメンバーが、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の発症に関与していることが明らかになってきており[39-41]、ABCB1(P糖タンパク質(P-gp)としても知られている)がAβの輸出において重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えてきている。

図1 脳内でのAβの産生、分解およびクリアランス

(A) APPは、a-セクレターゼによって切断されてsAPPaを生成するか、またはb-およびc-セクレターゼによって切断されて長さの異なるAβアイソフォームを生成する。

B)Aβペプチドは容易に凝集し、オリゴマー、プロトフィブリル、フィブリル、プラークを形成する。

C)Aβの細胞内分解は、ユビキチン-プロテアソーム系またはオートファジー-リソソソーム系を含む。細胞外Aβは、ファゴサイトーシスを受けるか、またはネプリリシン、インスリン分解酵素、マトリックスメタロプロテアーゼおよびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIなどのプロテアーゼによって分解される。

D)アポリポタンパクE-Aβ複合体は、BBBのAβluminal surface上の低密度LRP-1と相互作用する。LRP-1は、内皮細胞へのAβのエントリを仲介し、一方、P-gpは、その後、周辺部にペプチドをエクスポートする。


P-glycoproteinの発現とその機能的役割

P-gpは、多剤耐性1(MDR1)遺伝子によってコードされる140 kDA膜タンパク質は、積極的に肝臓、腎臓、腸[42,43]を含む、排泄やバリア機能を持つ組織の膜を介して物質を輸出するためにATPを利用している。脳では、P-gpは、それが中枢神経系[44]のうち、エンドおよび異生物性化合物の多種多様な通路を調節するプロアクティブな役割を果たしているBBB内皮の腔内(血液に面した)表面上に優勢に発現している。P-gpはまた、ラットおよびヒトの神経細胞[45-48]、アストロサイト、ミクログリア[41,44]、BBB[49]の隔膜上でも同定されている。

約20年前にAβがP-gpのサブ基質として初めて同定されて以来 [31]、脳からのAβのクリアランスにおけるP-gpの重要な役割を支持する豊富な証拠が存在している。このレビューでは、我々は、アルツハイマー病の病態生理の文脈でP-gpとAβの関係を調査するヒト、動物および試験管内試験研究からの知見を要約し、アルツハイマー病のための新しい治療戦略としてのP-gp変調の可能性について議論する。

P糖タンパク質を介したAβの輸出

人間研究からのエビデンス

健常者では、Aβは1時間あたりの総Aβ量の7.6%および8.3%の割合で構成的に産生され、脳からクリアーされる [15]。高齢発症型アルツハイマー病では、このクリアランス率は約30%低下する [16]。いくつかの研究では、P-gpがBBBを越えたAβの正常なクリアランスに必要であることが示唆されている。脳毛細血管P-gp発現と脳内Aβ沈着との間の逆相関は 2002年にVogelgesangらが50~91歳の高齢の非健常者の脳を対象に免疫組織化学的分析を行った際に、初めてヒトで観察された。Aβ40とAβ42の両方のアイソフォームが関与していたが、前者の方がより強い逆相関が観察された [17];これは、Aβ42のフィブリロジェニックな傾向が強く、クリアランスに対してより抵抗性があるためであると考えられる [20]。脳の血管へのAβの沈着は、脳アミロイドアンギオパシー(脳アミロイド血管症)としても知られており、アルツハイマー病の特徴であるが、神経学的に健康な人にも起こりうる。したがって、障害されたP-gp活性は、より高いAβ蓄積と脳アミロイド血管症と関連しており、アルツハイマー病発症のリスクを増加させるようである[17]。

年齢はアルツハイマー病の最大の危険因子であり[50]、P-gp発現は年齢とアルツハイマー病の両方で低下する。Chiuら[51]は、20~100歳の21人のアルツハイマー病および健康な被験者のBBB内皮P-gp発現が、41~60歳頃に大きな減少を示し、61~80歳頃にはわずかに回復し、その後、さらなる加齢に伴って継続的に減少することを観察した。このような年齢に依存したタンパク質発現の低下は、タンパク質機能の低下にもつながる。18-86歳の健康なボランティアでの陽電子放射断層撮影(PET)研究は、BBBを介してラベルされたP-gp基質(R)-[11C]-ベラパミルのクリアランスが若いボランティア(24 2歳)に比べて高齢のボランティア(平均年齢60 11歳)の間で有意に低いことを実証した[52]。アルツハイマー病の脳の検査では、Aβの沈着ははるかに大きい、とP-gpの発現は、年齢を一致させた認知的正常コントロール[51,53]よりも、有意に低かった。Jeynesらは、アルツハイマー病脳(60-88歳)におけるP-gp発現とAβ40(Aβ42ではなく)を含むプラークとの間に有意な負の相関を報告した。不思議なことに、この関係は、コホートの年齢範囲が若い(41-75歳)[44]のためかもしれないが、病変をはるかに少ない数の病変を示した非アルツハイマー病対照群では無視できないものであった。2つのセパレート研究では、P-gp活性もアルツハイマー病で低下することが確認されている。(R)-[11C]-ベラパミルを用いたPET研究では、認知的に正常な年齢の対照群と比較して、軽度から中等度のアルツハイマー病患者ではBBBを介したP-gp介在性クリアランスが最大50%減少することが示された[54,55]。これらをまとめると、年齢、P-gp発現、およびアルツハイマー病との間に以下のような関係があることが示唆される。P-gpの発現は中年の認知的に健康な人では低下し始め、徐々にAβの蓄積につながる。これは、臨床症状の発症の20年以上前からAβの蓄積が始まることを示すプロスペクティブな縦断的研究の結果からも裏付けられている[56]。疾患の初期段階では、Aβの蓄積および/または沈着を減少させる試みとして、P-gpの代償的なアップレギュレーションが起こる。しかし、疾患が進行するにつれて、他の因子[17,51,57]の中でも加齢がP-gpの発現と活性を低下させ、Aβ沈着をさらに悪化させる。

ヒトABCB1遺伝子は多型であり、60以上のコード一塩基多型(SNP)が同定されている。これらの遺伝子変異のうち、C1236T、G2677T/A、およびC3435Tを含む多くの遺伝子変異が高齢発症型アルツハイマー病に対する感受性に関して研究されてきた[58,59]。しかし、これらの研究の結果は相反するものである。234人のアルツハイマー病患者と225人の対照者を含む症例対照研究では、C3435T多型のみが有意であり、C/C遺伝子型はアルツハイマー病発症リスクの増加と関連していた[59]。対照的に、9つの個別の研究を検討した最近のメタ解析では、C3435T、G2677T/Aおよび1236T/2677T/3435Cハプロタイプ(ただしC1236Tは含まない)はすべてアルツハイマー病感受性と有意に相関していると結論づけられている[60]。非アルツハイマー病患者では、Vogelgesangら[17]は、C3435TまたはG2677Tポリ型と脳内P-gp発現量(またはAβ負荷)との間には関連性がないことを発見した。P-gpタンパク質発現に対するC3435T SNPの機能的効果については議論の余地があり、そのハプロタイプとの関連性と関連している。このSNPはタンパク質発現を調節することなくP-gp活性に影響を与えることが示唆されている[61]。van Assemaらによる別の示唆は、ABCB1 SNPは健康な対照者には影響を与えないが、すでにアルツハイマー病を発症している一般人のBBB P-gp機能を著しく損なう可能性があり、病気の進行に寄与している可能性があるということである。P-gp基質[11C]-ベラパミルを用いた陽電子放射断層撮影法は、C1236T、G2677T、C3435Tの1つ以上のT対立遺伝子を持つアルツハイマー病患者ではP-gp活性が障害されることを示したが、同じSNPを持つ対照患者では障害されないことを示した[62]。全体として、現在の遺伝的証拠はP-gpとアルツハイマー病の間の潜在的な関連性を示唆している。いずれにしても、脳内のP-gpの発現および/または活性に対するABCB1多型の効果を具体的に測定し、これらが脳内Aβ沈着の変化を示すかどうかを測定する大規模な研究は、いかなる決定的な遺伝的関連を確立するためにも必要である。

全体的に、ヒトの研究から得られたデータは、脳内Aβ輸出におけるP-gpの役割を支持するものである。P-gpの発現と機能は、老化、Aβの沈着とアルツハイマー病と逆相関しているように見える。しかし、さらなる調査のための多くの道筋がまだある。現在のところ、P-gpの発現と活性はBBBでのみ研究されている。P-gpが、Aβのペプタイドが生成される神経細胞を含む、アルツハイマー病に関与している神経血管ユニット内の他のいくつかの細胞タイプで同定されていることを考えると、P-gpがこれらの細胞でAβの輸出に役割を果たしているかどうかを評価することは興味深いことであろう。将来の研究により、加齢に伴う脳内のP-gp発現の変化について、より明確なデータが得られる可能性がある。最後に、前述の多くのヒト研究の注意点は、非常に小さなサンプルサイズを使用していることである。より大規模で質の高い研究を行うことで、アルツハイマー病におけるP-gpの役割に関するより具体的なエビデンスが得られるであろう。

動物実験からのエビデンス

動物ベースのアルツハイマー病研究の課題の一つは、ヒトで観察される生物化学的異常や病理学的特徴を完全に再現できるモデルがないことである。アルツハイマー病のために最も広く使用されている動物モデルであるげっ歯類は、自然に病気を発症しない [63]。したがって、家族性アルツハイマー病で観察された突然変異を利用して、遺伝子導入技術を用いて人為的に疾患発症の側面を導入しなければならない。これらには、APP、PSEN1,PSEN2(後者の2つはc-セクレターゼの触媒サブユニットをコードする)遺伝子への変異が含まれる[64]。最も確立されたADモデルの一つは、トランスジェニックTg2576マウス株である。これらのマウスは、ヒトAPP(hAPP)を過剰発現させ、それぞれAβ40とAβ42レベルの5倍と14倍の増加につながる [65]。別のマウスモデルでは、APPとPSEN1の変異を組み合わせてAPP/PS1ダブルトランスジェニック系統を作製しており、シングルトランスジェニックモデルと比較して、より大きなAβ42産生とプラーク沈着の促進をもたらしている[66]。生体内でのAβ沈着におけるP-gpの役割を調査するために、これらのモデルは、P-gpノックアウトマウスおよびP-gp発現および活性の薬理学的調節因子と組み合わせて使用される。

Aβクリアランスは、P-gp阻害剤の存在下で妨げられ、BBBでP-gpを復元することは、アルツハイマー病動物モデルでの脳-ブラールAβ濃度を減少させる。Hartzらは、フルオレセイン標識ヒトAβ42(hAβ42)で野生型マウスから分離された脳毛細血管をインキュベートした。タリイカダール、バルスポダール、イベルメクチン、シクロスポリンA、ベラパミルなどのP-gpインヒビターを添加することで、バスから血管空間へのAβの輸送を表す毛細血管の管腔内蛍光が有意に減少した[67]。同様に、Tg2576マウスにタリイカダールを静脈内投与すると、無処置マウスと比較して脳内のAβ濃度が有意に上昇した[42]。hAPP過剰発現のTg2576マウスの脳毛細血管は、年齢をマッチさせたコントロールと比較して、P-gp発現が60%減少し、輸出活性が70%減少した。フルオレセイン-hAβ42輸送も大幅に減少しており、Aβは本当にP-gpの基質であることを示唆している[67]。妊娠X受容体(PXR)リガンドであるプレグネノロンを生体内試験で投与すると、Tg2576マウスにおけるP-gpの発現が回復し、NBD-CSAおよびフルオレセイン-hAβ42のP-gp介在性の流出が未処置の野生型マウスで観察されるレベルまで回復した。さらに、免疫染色は、プレグネノロンとの治療が有意にAβ40と毛細血管膜中の沈着を減少させたことを明らかにした、アップレギュレーションP-gp活性は、アルツハイマー病における脳アミロイド血管症を逆転させる可能性を持っていることを示唆している[67]。セントジョンズワート(SJW)はP-gpのよく知られた誘導因子であり、そのメカニズムはPXR活性化に関与している可能性が高い[68]。SJWを含まない食事で年齢を比較した対照マウスと比較して、5%のハイパーフォリンを含むSJW抽出物を60日間摂取させたC57BL/6Jで飼育されたAPP/PS1+/マウスでは、可溶性Aβ40とAβ42の濃度とプラークサイズが有意に減少するとともに、脳血管内P-gpの発現が有意に増加していた。治療期間を120日に延長すると、結果はさらに顕著になった[69]。これらの結果は、脳内Aβ蓄積を減少させる効果的な方法としてのP-gpのアップレギュレーションを支持するものである。一方、ある研究では、脳内AβクリアランスにおけるP-gpの役割は最小限であることが報告されている。伊藤らは、P-gp阻害薬であるキニジンとベラパミルがSprague Dawleyラットの脳からの[125I]-Aβ40クリアランスに及ぼす影響を調べたところ、未治療の被験者と比較して、消去半減期に有意な差は認められなかった。しかし、[125I]-Aβ40クリアランスはhAβ40(79.1%)と(36.4%)の両方によって有意に阻害され、これらの基質は共通の排泄プロセスを共有していることを示唆していることに注目している[70]。

それにもかかわらず、ノックアウトモデルは、脳からのAβクリアランスがP-gpの機能に依存していることをさらに支持している。ウイヌのP-gpは2つの遺伝子によってコードされている。ABCB1aとABCB1bである。ABCB1a遺伝子をノックアウトしたマウスは、野生型のFVBマウス(一般的に使用されている近交系統、別名Friend Leukemia Virus Bマウス)と比較して、[125I]-Aβ40の蓄積が有意に増加し、BBBでの排出活性が低下していることを示した。同様に、ABCB1a/マウスをTg2576マウスと交配して二重トランスジェニックモデルを作製したところ、ABCB1a遺伝子産物の欠失は脳からの[125I]-Aβ40クリアランスを有意に低下させるのに十分であった。著者らはさらに、P-gpの欠失によって可溶性Aβのみが影響を受けるのに対し、脳ホモジネートのギ酸画分(不溶性Aβフィブリルを再構成する)は影響を受けないことを指摘した[71]。これらの結果は、12ヶ月齢のTg2576 ABCB1a/double-knockoutマウスにおけるAβ沈着が、P-gpが無傷のTg2576マウスに比べて有意に大きいことを観察したCirritoらの知見を支持するものである。さらに、放射性標識された[125I]-Aβ40および[125I]-Aβ42をマイクロインジェクションしたFVB ABCB1a/b/ダブルノックアウトマウスの中枢神経系へのクリアランスは、野生型FVBマウスの半分であった[42]。しかし、P-gpサイレンシングは野生型マウスと比較して脳毛細血管のLRP-1発現が51%減少することが指摘されており、このLRP-1抑制がAβ流出障害にも寄与しているかどうかを結論づけることはできなかった。Wangら[71]による前述の研究では、LRP-1の発現は調べられていない。このLRP-1とP-gpの間の相互関係は、他の研究でも示唆されている。マウスにおける内皮Lrp-1の遺伝子欠失は、P-gp発現の60%の減少を伴っており、その結果、対照と比較してBBBを横断するAβの流出が50%減少した[72]。ラットの加齢モデルでは、P-gpおよびLRP-1のmRNAおよびタンパク質の両方のレベルは、生後3ヵ月から36ヵ月の間に全体的な減少を示したが、脳内へのAβの侵入を媒介する高度糖化最終産物受容体(RAGE)は増加した [73,74]。興味深いことに、12週齢の若いTg2576マウスから分離された脳毛細血管は、野生型マウスと比較して、P-gpの発現は劇的に低いが、LRP-1タンパク質の発現はわずかに増加していることが、ウエスタンブロット分析によって示された [67]。加齢とともに減少する代償的および/または協調的な機能がある可能性が考えられる。それにより、あるトランスポーターへの変化が、脳のAβホメオスタシスを維持するための複合的な努力において、他のトランスポーターの発現に影響を及ぼす可能性がある。

現在、多くの生体内試験での研究は、BBBを越えたAβの流出は、脳から毛細血管内皮細胞へのLRP-1媒介のアブレイム-鼻表面での取り込みから始まる2段階のプロセスであるという考えを指摘している[71,72,75]。第二段階では、内皮から血液中への通過のために、内腔表面でのP-gpによる積極的な輸送が行われる。例えば、P-gpおよびLRP-1特異的阻害剤の両方が、野生型マウス脳毛細血管におけるフルオレセイン-hAβ42の輸出を有意に減少させた[67]。さらに、P-gp(valspodarまたはCSAを使用)とLRP-1(抗LRP-1抗体11E2を使用)の二重阻害は、[125I]-Aβ42の輸出において、単一のトランスポーター阻害に勝る利点はなかった[72]。実際、最近の研究では、LRP-1とP-gpがホスファチジルイノシトール結合性クラスリン集合タンパク質(PICALM)を介して機能的に連結されていることが示されているが、これは細胞内輸送を指示する細胞質タンパク質であり、Aβのトランスサイトーシスおよびクリアランスを促進する[72]。PICALMの発現低下は、Aβクリアランスおよびアルツハイマー病の病理学的障害に関与していることが示唆されている。免疫沈降実験により、P-gp、LRP-1およびPICALMはコロケーションしており、脳内皮細胞内で相互に作用しうることが明らかになった。RAβ11は、エンドサイトーシス後に内包された粒子の選別ステーションとして機能する初期エンドソームのマーカーであり、P-gpとLRP-1とも染色されていた。このことは、初期エンドソームが、LRP-1からP-gpへの内包されたAβの移行が起こる場所である可能性を示唆している[72,76]。したがって、P-gpとLRP-1は、BBBを越えたAβのトランスサイトーシスを媒介するために協調して作用しているようである。

現在のところ、Aβ輸出におけるP-gpを調査する生体内試験動物研究はげっ歯類モデルに限られている。しかし、これらのモデルは、脳からアブを排除する際にP-gpが保護的な役割を果たすことを示唆する広範な証拠を提供している。さらに、P-gpの発現を薬理学的にアップレギュレーションすることで、アルツハイマー病の治療におけるAβ濃縮を抑制することができるかもしれない。

試験管内研究からのエビデンス

Lam ら [31] は、P-gp を アミロイドβ エクスポーターとして直接同定した最初の研究者である。当初、RU486およびRU49953という阻害剤を用いてK269sw細胞のP-gpを薬理学的に阻害すると、用量依存的にAβ分泌が有意に減少することが指摘されていた。P-gp過剰発現CHRB30細胞由来の膜小胞では、Aβ40とAβ42がP-gpの実質的な基質であることが2つの証拠から確認された。Aβのインキュベーションで観測された可飽和消光は、これらのペプチドがトランスポーターと直接相互作用することを確認した。最後に、CHRB30細胞由来のインサイドアウト小胞では、Aβの膜貫通輸送がATPとP-gpの両方に依存していることが示された[31]。これらの知見は、BBBの血管内皮をモデル化するためにMDR1を導入したブタ腎LLC細胞(LLC-MDR1)を利用したKuhnkeら[77]によって裏付けられた。BBBを横切って輸出するには、内皮細胞の基底面(Aβluminal)から先端面(luminal)への移動が必要である[43]。試験管内試験では、偏光単分子膜で培養した細胞を特徴とするトランスウェルアッセイを用いて分析することができる。トランスウェル系で培養したLLC-MDR1細胞では、AβはP-gpを介したロダミン-123の基底から先端へのフラックスを競合的に阻害することがわかった。さらに、蛍光標識されたAβ40およびAβ42の基底-先端間輸送および先端濃度は、con-trolと比較してLLC-MDR1細胞で有意に高く、これらはP-gp阻害剤シクロスポリンAの存在下で減少した。P-gp発現と細胞内Aβレベルとの間の逆の関係を支持する追加の証拠は、ヒト結腸腺癌LS-180細胞による125I放射性標識Aβ40の細胞内蓄積の測定によって提供された。蓄積量は、既知のP-gp誘導剤であるリファンピシンとハイパーフォリンで処理すると15-35%減少し、P-gpタンパク質発現はそれぞれ5.6-2.6倍に増加した。ベラパミルによるP-gpの導入は、Aβ40蓄積を有意に増強することが示されている[78]。これらの結果は、P-gpがAβ40とAβ42の膜貫通輸送に積極的に関与していることを示している。

逆に、一握りの試験管内試験研究では、細胞からのAβクリアランスにおけるP-gpの役割に関して否定的な結果が報告されている。Aβ42の存在は、P-gpを過剰発現させたK562/薬物有害反応細胞においてATPアーゼ活性に影響を与えず、また、P-gp基質であるピラルビシンの流出にも影響を与えなかった。これは、ベラパミル(低濃度でのP-gp誘導剤)では刺激的な結果が得られ、オルトバナジン酸ナトリウム(P-gp阻害剤)では阻害的な結果が得られたにもかかわらずである。P-gpの過剰発現もまた、1,2および4μMのAβ42を72時間インキュベーションしても細胞毒性に対する保護を与えず、4μMのAβ42はK562およびK562/薬物有害反応細胞の両方で100%近くの死亡率を誘導した[79]。重大なことに、著者らはK562細胞とK562/薬物有害反応細胞におけるP-gpタンパク質の発現を定量化しておらず、後者の細胞型でP-gpがどの程度アップレギュレートされていたかを評価することは困難であった。セパレート研究では、トランスウェルシステムで増殖させた分極化MDCK上皮細胞において、P-gpの安定した過剰発現と機能が確認された。しかし、これでも[125I]-Aβ40トランスサイトーシスを促進するには不十分であった[38]。hCMEC/D3細胞での細胞間輸送研究では、ビンブラスチンとタリイカダーによるP-gpの阻害は[125I]-Aβ40の先端から基底への移動と細胞内レベルを増加させるが、[125I]-Aβ40の細胞内レベルには影響を与えなかった。基底から頂部への運動。著者らは、BBB P-gpの発現は末梢性Aβの脳循環への進入を制限するが、その逆はしないと結論づけている[80]。これがどのようにして起こるのかは提案していないが、Nazerら[38]は、P-gpがAβのトランスサイトーシスを媒介するためには、別のトランスポーターまたは補因子の機能を必要とする可能性があることを示唆している。これらの知見を支持する証拠は、P-gpのサブ基質が通常、中性または正電荷の小さな(< 0.2-1.9 kDa)有機モルキュールであるという観察から生じる; Aβは、凝集体を形成する傾向がある生理的論理的pHで4 kDa程度の疎水性と負に帯電したペプチドであるため、それゆえに基質としては考えにくいだろう [79]。しかし、注目すべきことに、Aβ輸出におけるP-gpの役割に関する試験管内試験での一見矛盾した証拠は、研究全体で様々な起源の異なる細胞株を使用していることから、少なくとも部分的に生じている可能性がある。他の研究者が示唆しているように、Aβ輸送のメカニズムは細胞型に依存しているようである[41,79,81]。さらに、Aβペプチドの凝集の状態はしばしば報告されていない、それはまた、結果を混乱させる可能性がある。したがって、今後の実験計画の際には、これらの要因を考慮しなければならない。

AβはP-gpの発現と機能を調節する

アルツハイマー病の病因の複雑さに加えて、AβはP-gpの発現を減少させることが観察されている。P-gp発現が脳内Aβ沈着と逆相関しているという観察に加えて、Vogelge-sangら[17,57]は、高齢者の非衰弱ヒト脳のいくつかの血管では、Aβが刺激を与え続けると、P-gp発現が完全に消失したことに注目した。現在のところ、この変化がmRNAの転写レベルでのダウンレギュレーションの結果なのか、それとも翻訳後修飾の結果なのかは不明である。後者のメカニズムのサポートでは、いくつかの研究では、P-gpのタンパク質レベルが対照と比較してアルツハイマー病被験者の脳内で減少しているが、mRNAレベルは変化しないままであることが報告されている[51,53]。対照的に、オリゴマーAβ42に曝露したhCMEC/D3脳内皮細胞では、P-gp mRNAレベルが37 9.6%減少し、これはP-gpプロテイン発現と排出活性の有意な減少を伴っていた。Aβ42フィブリル、Aβ40またはスクランブルAβ42とのインキュベーション時のP-gp mRNAおよびタンパク質レベルには有意な影響はなかった [82,83]。In vivoでは、Aβ42を24時間注入したFVB野生型マウスは、対照と比較して脳のP-gp発現のmRNAレベルで63 24%の減少を示した。しかし、意外なことに、これはタンパク質レベルでは反映されなかった。Aβ40はP-gpのmRNAまたはタンパク質に有意な影響を及ぼさなかった[84]。一方、Aβ42およびAβ40の凝集体は、Sprague Dawleyラットの脳毛細血管において、P-gpタンパク質の発現および機能に影響を与えなかったが、単量体Aβ40に6時間曝露すると、P-gpタンパク質発現の40.3 6.2%の減少を誘導することができ、これはP-gp輸送活性の69.4 6.2%の減少に換算された[85]。したがって、AβがP-gp発現をダウンレギュレートする程度は、Aβの沈着とアルツハイマー病の進行を悪化させるのに十分に重要であるかもしれないことが可能である。しかしながら、様々な方法論および使用されたAβの形態(フィブリルのモノマー、オリゴマー)の一貫性のない報告は、どの特定のAβ種が原因であるかについての明確なコンセンサスがまだ存在しないことを意味している。

P-gpの発現に対するAβペプチドの効果を説明するために、いくつかのメカニズムが提案されている。これらには、シグナル伝達経路の変化、転写因子の調節、およびプロタンパク質分解の亢進が含まれる。Wnt/b-カテニンシグナル伝達経路は、ヒトの脳の発達と恒常性において重要な役割を果たしている。この経路への障害は、P-gp発現のダウンレギュレーションと同様に、アルツハイマー病を含む神経学的機能不全や神経変性疾患に関与している[86,87]。In vitroでは、Aβ42に曝露されたhCMEC/D3細胞は、スクランブル化されたsAβ42に曝露された細胞と比較して、b-カテニンとP-gpタンパク質のレベルが有意に低下しており、これらの低下はいずれもWntアゴニストであるWnt3aで前処理することによって阻止された。シグナル伝達の障害は、TCF/LEF転写部位の下流で測定された転写活性の有意な減少によって確認された。Aβ40はこのシグナル伝達経路には影響を与えないようであった[83]。Aβ42はまた、試験管内試験で内因性Wnt阻害剤Dkk-1の発現を増加させ、Dkk-1転写物の有意に高いレベルが年齢をマッチさせたコントロールと比較してヒトAD被験者から分離された海馬パル血管で報告されている[53,83]。それは、アルツハイマー病の脳における高濃度のAβの引き金となるDkk-1のアップレギュレーション、障害されたWnt/ b-カテニンシグナル伝達を導き、それによってP-gpの発現を減少させることが可能である。Parkらによって提案された別のメカニズムは、転写因子NF-KBを示唆している。

マウスbEnd.3脳内皮細胞を用いた実験では、Aβ42とRAGEの間の相互作用がNF-KBを活性化し、これがDNAに結合してP-gp遺伝子の転写を抑制することが示された[88]。翻訳後機構も提案されている。例えば、Hartzら Hartzら[85]は、等張ラット脳毛細血管内の単量体Aβ40に曝露すると、P-gpの内在化とプロテアソーム分解によりユビキチン化が促進されることを発見した。ユビキチン活性化酵素E1阻害剤であるPYR41は、P-gpのユビキチン化と分解を防ぐことができ、hAPP過剰発現マウスTg2576の脳内のhAβ40とhAβ42レベルの低下につながった[89]。もう一つの可能性は、アルツハイマー病の病因のドライバーとして認識されるようになってきているニューロイン炎症に関係している [90,91]。Aβは、炎症性サイトカインであるインターロイキン(IL)-1bおよびTNF-aの発現を増加させることで炎症を引き起こすことが示されている[92]。これらのサイトカインは、IL-6とともにモルモットの脳内皮細胞におけるP-gpのmRNA発現および機能を用量依存的に低下させることが示されている[93]。

BBBの機能障害は、アルツハイマー病を含むいくつかの神経変性疾患の病因の重要な構成要素として認識されている [94-96]。P-gpの発現とBBB内皮での活性の改善は、アルツハイマー病の影響を受けた脳で観察されているBBB破壊のすでに広範囲な症状に寄与している可能性がある。これらの脳の死後分析では、タイトジャンクションタンパク質の発現低下、BBBの完全性を維持するペリサイトの変性、毛細血管膜の変化、血液由来タンパク質の脳内への浸潤が明らかにされている[94,96]。これらの要因が相まって、薬物、殺虫剤、環境汚染物質などの内因性化合物や外来物質への曝露に対する脳の脆弱性が増大し、これらの化合物は炎症性、免疫活性化性、神経毒作用に関連している可能性がある[96]。P-gpは様々な治療薬を排出することが知られているが、これまでに内因性基質はほとんど同定されていない[97,98]。Aβ以外のP-gp基質もまたアルツハイマー病の進行に影響を与えるかどうかを確認することは興味深いことであろう。

ヒト、マウス、細胞モデルを合わせると、AβとP-gpの間に潜在的な双方向の関係があることが明らかになる。P-gpは脳からのAβのクリアランスに積極的に関与している。しかし、P-gpの発現が加齢や疾患に伴って低下すると、Aβのレベルが上昇する。この蓄積が閾値に達すると、P-gpの発現に対するAβの抑制効果が脳からのクリアランスを上回るようになり、Aβの沈着、BBB機能障害をさらに悪化させ、アルツハイマー病の進行を助長する複合的な循環効果が生じる可能性がある。

現在の治療の風景:潜在的な薬物標的としてのP-gp

現在承認されているアルツハイマー病の薬理学的治療としては、抗コリンエステラーゼ薬やN-メチル-D-アスパラギン酸受容体阻害薬などがある。しかし、これらの治療薬は交感神経系の緩和をもたらすだけである。そのため、認知機能の低下の進行を抑制することを目的とした臨床研究は、ますます病因論的に焦点が当てられるようになってきている[1]。アルツハイマー病のアミロイド仮説に基づく治療戦略は、Aβ産生を抑制するもの、または脳からのAβクリアランスを高めるものに大別される。Aβ産生の阻害剤には、親タンパク質APPの開裂を阻害するc-セクレターゼおよびbサイトAPP開裂酵素1阻害剤が含まれる。しかし、これらの酵素は、他の多数の内因性基質の切断にも必要であるため、これらを薬物標的として使用することには、固有の複雑さがある[99]。能動的および受動的な免疫療法は、ミクログリア食細胞応答を活性化し、周辺部を介してAβのクリアランスに結合して促進する[9]。驚くべきことに、これらの化合物を研究してきた数十年間の臨床試験では、薬物動態学的プロファイルの悪さ、耐え難い副作用、疑わしい低用量の使用、主要な臨床エンドポイントを満たす有効性の欠如などが原因で、実行可能な治療法の選択肢は得られなかった[9,10]。それにもかかわらず、これらの失敗は、この疾患の基礎となる病態生理学的メカニズムに関する我々の知識のギャップを浮き彫りにし、将来の実験デザインを改善するための道を開いた。

高齢発症型アルツハイマー病の病態生理学の現在の理解を要約すると、排便性内因性クリアランス機構により脳内のAβ濃度が臨界濃度に達すると、アミロイド沈着とプラークの蓄積が起こる。Aβの種のプリオンのような伝播と凝集への強い熱力学的駆動力は、一度開始されると、この雪だるま式効果を止めることが困難であることを意味する [8,100,101]。何十年にもわたって、これは臨床症状を呈する広範で不可逆的な神経変性にまで至る [55,99]。したがって、早期の介入が非常に重要であり、Aβの初期沈着を防ぐためにトランスポーター媒介の欠損したクリアランスを回復させることは、疾患の進行を遅らせるか、あるいは食い止めることができるかもしれない。

脳内のP-gpの発現と機能を高めることは、アルツハイマー病における神経毒性Aβ種のレベルを低下させるための効果的な治療戦略として提示することができる。2つのヒトを対象とした研究では、抗生物質ドキシサイクリン(200mg)リファンピン(300mg)のアルツハイマー病の臨床転帰に対する効果が調査されている。101 人の軽度から中等度の アルツハイマー病 被験者を含む無作為化三重盲検対照試験では、3 ヶ月間、これらの抗生物質の組み合わせの毎日の投与は、プラセボと比較して有意に低い機能障害行動と認知機能の低下をもたらした。この効果は、治療期間[102]の後9ヶ月間パーシステッド。この有益性の根本的なメカニズムは、抗生物質が介在するアミロイド沈着障害に起因するが、ドキシサイクリンとリファンピンの両方がP-gpの発現を増加させる核内受容体であるPXRを活性化することは興味深いことである[40]。残念ながら、これらの結果は、軽度から中等度のアルツハイマー病患者406人を対象に実施された12ヶ月間の大規模な無作為化比較試験では再現されなかった[103]。これは、両抗生物質の誘導効果がBBB P-gp発現よりもむしろ全身性の方が顕著であることに起因すると考えられる[104,105]。もう一つの興味深い点は、アルツハイマー病を含むいくつかの神経変性疾患で見られる酸化ストレスや神経炎症がP-gpの発現を調節する可能性があるということである。さらに、Aβオリゴマーは炎症や酸化ストレスを引き起こすだけでなく、逆に炎症や酸化ストレスはAβの蓄積を引き起こす可能性がある[92,106]。したがって、P-gp活性を促進することは、Aβクリアランスを増加させ、アルツハイマー病脳における神経炎症を減衰させるという二重の利点を有する可能性がある。多くのP-gp誘導因子が同定されている[107]が、アルツハイマー病における生体内試験研究のために利用される可能性がある。もちろん、ヒトでP-gpの発現を調節する際の重要な考慮事項は、薬物間相互作用のリスクである[108]。その広い基質特異性により、ポリファーマシーにおける薬物曝露の変化による毒性や過少治療のリスクを最小限に抑えるために注意が払われなければならない。

結論

P-gpはBBBで重要なゲートキーピングの役割を果たしており、外来物質や他の潜在的に有害な物質から脳を保護している。それは今、この役割はまた、脳の外に内因性のAβペプチドの輸出を包含することが明らかになっている。このレビューで発表されたヒト、動物および試験管内試験研究は、障害された P-gp 機能は、アルツハイマー病 の病原体のシスに貢献して、Aβ の沈着を促進するという物語をサポートする強力な証拠を提供する。さらに、AβはP-gpの発現を低下させることが明らかになっており、P-gpの発現の低下は、結果として、また疾患の推進因子となっていることを示唆している。しかし、P-gp活性のアルツハイマー病への正確な寄与については、まだ多くのことが解明されていない。P-gp発現の低下は明らかにAβ沈着と関連しており、Aβ沈着は神経変性と関連しているが、アルツハイマー病におけるP-gpと神経変性との間に直接的な関係があるかどうかを確認するためには、より多くの研究が必要である。特に、今後の動物実験では、P-gp発現の変調が、ヒトのアルツハイマー病で観察される病理学的・神経学的パターンを発現するかどうかを探ることができるだろう。さらに、P-gpがどのように正確にAβペプチドと結合し、相互作用することができるか、またはAβがモノメリックまたはオリゴメリック形態で存在するかどうかによって輸送効率がどのように影響されるかについては、まだ不明である[109]。また、Aβ42 ペプチドは環境変化やその確認の影響を受けやすく、凝集状態は調製や取り扱い技術に大きく依存する[110]。このレビューを実施する際に、我々はメタポッド間の大きな変動性と曖昧さを観察し、今後の実験で採用されるAβの形態を報告する際に、より一貫性と明確性の必要性を強調している。神経毒性の源として細胞内Aβにますます重点が置かれており、トランスジェニックマウスにおける脳内Aβオリゴマーの蓄積は、細胞外沈着がなくてもアルツハイマー病の病態の発症を誘発することが示されている[111-113]。最近、P-gpが神経細胞で同定されたことを考えると、この場所でのP-gpの重要性をアルツハイマー病病態の文脈で調べることは非常に興味深いことであろう。

まとめると、アルツハイマー病は壊滅的な神経変性疾患であり、世界中で何百万人もの人々を苦しめている。何十年もの研究の後、私たちはまだ完全にその病因と基礎となる病原性プロセスを解明したり、「治療法」を特定したりするには至っていない。それにもかかわらず、現在のエビデンスは、アルツハイマー病の病態におけるP-gpの関与を強く示唆しており、P-gpの活性を高めることが病気の進行を抑制するための実行可能な治療法である可能性を示唆している。P-gpがAβ輸送に影響を与えるメカニズムの理解を深めるとともに、脳内でのP-gpの発現と機能を調節する因子を特定することで、アルツハイマー病の理解と治療に大きく貢献できる可能性がある。

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