アルツハイマー病に伴う体温調節障害

強調オフ

タウ冷え性医学研究(総合・認知症)認知症予防(総論)

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Old age potentiates cold-induced tau phosphorylation: linking thermoregulatory deficit with Alzheimer’s disease

マリーヌ・トルニサック a, b, c, ミレーヌ・ヴァンダル a, b, c, アルノー・フランソワ a, b, エマニュエル・プラネル b, d, フレデリック・キャロン a, b, c, *.

a カナダ、ケベック州、ケベック州、ラヴァル大学薬学部

b Axe Neurosciences, Centre de recherche du centre de Hospitalier de lité Laval (CHUL), Québec, Québec, Québec, Canada.

カナダ、ケベック州、ケベック州、栄養・栄養研究所

d カナダ、ケベック州、ケベック州、ラヴァル大学精神科・神経科学部門医療学部

オンラインで利用可能 2016年10月12日

www.medicalnewstoday.com/articles/325492

要約

体温調節障害は、老年期のアルツハイマー病の発症率の上昇と一致している。低体温はアルツハイマー病の神経病理学的特徴であるタウリン酸化を増加させる。

高齢になると寒冷化誘導タウリン酸化が促進されるかどうかを調べるために、6ヶ月齢と18ヶ月齢のマウスを用いて寒冷曝露(4℃、24時間)の効果を比較した。寒冷曝露による体温、褐色脂肪組織活性およびSer202におけるタウのリン酸化の変化は、6ヶ月齢マウスと18ヶ月齢マウスの間で差がなかった。

しかし、寒冷曝露後には、体温と相関のある可溶性タウのpThr181とpThr231の有意な上昇を示したのは、年齢の高いマウスのみであった。グリコーゲン合成酵素キナーゼ3bの不活性化は若いマウスでより顕著であり、寒冷化によるタウのホスホリル化に対する保護機構が示唆された。

これらの結果から、高齢になると体温変化に伴うタウの高リン酸化に対する感受性が高くなり、アルツハイマー病発症のリスクが高まることが示唆された。

1. はじめに

加齢は、アルツハイマー病の最も重要な危険因子である(Alzheimer’s Association, 2015; Querfurth and LaFerla, 2010; Rocca et al 2011; Ziegler-Graham et al 2008)。家族性の形態であっても、人生の5年目の10年目までに臨床的に発現することは稀である(Ridge et al 2013)。したがって、加齢がアルツハイマー病の発症にどのように寄与するかをよりよく理解することは、潜在的な治療法についての重要な手がかりを提供する可能性が高い。印象的なことに、体温調節障害は、アルツハイマー病の発生率が大幅に増加する人生の同じ時期に現れる(DegrootとKenney 2007; Florez-DuquetとMcDonald、1998)。実際、高齢者の平均体温は若年者よりも低く、37℃以下であることは以前から知られており(Gomolin et al 2005;Hoshino et al 2007;Howell、1975)低体温症のリスクを増加させる(Fox et al 1973;Whittington et al 2010)。さらに、体温調節に関連する他のいくつかのパラメータが高齢者において影響を受ける:エネルギー代謝(Cunnane et al 2011;Frisard et al 2007)褐色脂肪組織(BAT)の発熱活性(Cypess et al 2009)寒冷曝露後の回復能力(Florez-DuquetおよびMcDonald、1998;Sugarek、1986)および体温の概日周期(Weinert 2010)。

動物モデルにおける前臨床研究は、体温調節障害をアルツハイマー病の発症に結びつける潜在的なメカニズムをもたらした。最も顕著なのは、マウスの低体温は、アルツハイマー病の主要な神経病理学的マーカーの一つであるタウリン酸化と脳内病理を増加させることが繰り返し示されている(Planel et al 2004,2009; Vandal et al 2016)(Cowan and Mudher 2013; Frost et al 2014; Tremblay et al 2007)。低体温とタウリン酸化との関連は複数の実験で証明されているが、私たちの知る限りでは、このメカニズムにおける年齢の役割を調査した研究はなかった。

体温調節障害の出現はアルツハイマー病の発症率の増加と一致しており、低体温はタウリン酸化を増加させることが繰り返し示されている(Arendt, 2003; Planel et al 2007; Whittington et al 2010)ので、我々はこの翻訳後メカニズムが若いマウスに比べて高齢のマウスで増強されるかどうかを検証することを目的とした。6ヶ月齢と18ヶ月齢のマウスを用いて、24時間4℃に曝露したところ、高齢マウスでは若年マウスに比べて可溶性リン酸化タウの増加が認められた。また、低温曝露後の大脳皮質では、若いマウスのみがグリコーゲン合成酵素キナーゼ3b(GSK3β)の不活性化型のレベルが高かった。このことから、GSK3βの不活性化が、高齢動物で失われたタウの高リン酸化に対する保護機構である可能性が示唆された。

2. 方法

2.1. 動物と寒冷曝露

すべての実験は、動物飼育に関するカナディアン評議会に準拠して行われ、Centre Hospitalier de l’Université Lavalの施設委員会によって承認された。当グループの動物施設で生産された6ヶ月および18ヶ月齢のC57BL6/129SvJマウスを、各群の雄と雌の数が等しくなるように使用した。1ケージあたり1匹を4℃または22℃で24時間飼育した。体温は、1日の同じ時間(午前8時)に曝露前後に直腸プローブと結合した電子体温計を用いて直腸で測定した。すべてのマウスは、他の場所に記載されているように心臓内灌流によって犠牲になるまで、それらのハウジング温度(4 Cまたは22 C)の下に保持された(Julien et al 2009)。麻酔はそれ自体が体温に影響を与えることが知られているが(Lenhardt, 2010)倫理的な理由から、すべてのマウスをケタミン/キシラジン注射(100mg/kgケタミン、10mg/kgキシラジン)で深部麻酔下に置いた。迅速に、肩甲骨間BATおよび脳を解剖し、ウェスタンブロットのために処理するまで80℃で凍結した。別の実験では、麻酔前24時間の4℃への曝露が室温への曝露(1.61 0.59 C、n ¼ 7)と比較して、ケタミン誘発性体温低下(3.23 0.64 C、n ¼ 7)を有意に悪化させることがわかった。

2.2. タンパク質の抽出とウェスタンイムノブロッティング

タンパク質の抽出方法により、TBSに可溶な細胞内および細胞外画分(細胞質画分)洗剤に可溶な画分(膜画分)および以前に記載されたようにギ酸に可溶化された洗剤に不溶な画分が得られる(石原 et al 1999; Lebbadi et al 2011)。ウエスタン免疫ブロッティングの詳細な方法は、別の場所に記載されている(Vandal et al 2014)。我々の実験で使用した一次抗体のリストは、補足表1に記載されている。同一実験の脳ホモジネートは全て同じゲルに載せたが、全ての代表的な写真例について連続したバンドは撮影しなかった。

2.3. 定量的リアルタイムPCR

逆転写リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて、アンカップリングプロテイン1(UCP1)メッセンジャーRNAの発現量をBATで測定した。凍結したBATを粉末化し、各サンプル10 mgを1 mLのQIAzol溶解試薬(Qiagen, Valencia, CA, USA)に200 mLのクロロホルム(J.T. Baker, Center Valley, PA, USA)を加えてホモジナイズした。RNA は RNeasy 脂質組織ミニキット(Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて抽出した。ランダムヘキサマープライマーおよびMultiScribe Reverse Transcriptase(Life Technologies, Burlington, ON, Canada)を備えたHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットを用いて、製造元の指示に従って相補的DNAを合成した。次いで、TaqMan qPCRプライマーを用いて、マウスUCP1(TaqMan Gene Expression Assays、ライフテクノロジーズ社製、Mm01244861_m1)を増幅し、ハウスキーピング遺伝子としてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH、Mm99999915_g1,ライフテクノロジーズ社製)を増幅した。反応を 3 倍に調製し、粘着性光学フィルムで覆った 96 ウェル光学プレート中でリアルタイム qPCR サイクラー(MxPro-Mx3005P、Agilent Technologies、Mississauga、ON、カナダ)を使用してサイクル閾値(Ct)値を測定した。各ランには、両遺伝子の「ノーテンプレート」コントロールが含まれていた。コントロール遺伝子としてGAPDHを用いて、グループ間の相対的な遺伝子発現の差を評価するために、デルタデルタCt(ddCT)法を用いた。結果は、対照群におけるUCP1/GAPDH補体DNAの比率として示されている。

2.4. 統計解析

データは、対照マウスと比較して、寒冷曝露マウスで観察された相対的な変化を、平均値の標準誤差または相対的な変化として示している。統計分析および各図には、各群のマウス数を明記した。各群間の分散の不等式を除外するためにBartlettの検定を用いた。2群以上を比較する場合には、一元分析(1つの独立変数)または2元分析(ANOVA)(2つの独立変数)を使用した。ANOVAは、分散が等しい場合はTukeyのポストホック分析、分散が不均等な場合はDunnettのポストホック分析に従った。2つのグループのみが比較された場合は,不対のStudent t 検定が,分散が等しくない場合はWelch 補正を用いて実行された。変数間の相関は、線形回帰分析を用いて調査した。すべての統計解析はPrism 5 (GraphPad software, San Diego, CA, USA)またはJMP (Version 12.1.0; SAS Institute Inc, Cary, IL, USA)ソフトウェアを用いて実施し、統計的有意性はp < 0.05とした。

3. 結果

3.1. 若いマウスと比較して、老齢マウスにおける可溶性タウの寒冷誘導性リン酸化の亢進

4℃の低温曝露は、げっ歯類の非シバリング熱発育を研究するための古典的な方法である (Cannon and Nedergaard, 2010; Lim et al 2012)。そこで、我々はまず、低温曝露によって体温が低下し、BATのGAPDH発現におけるUCP1の割合が22℃維持動物と比較して増加することを確認した。しかし、6ヶ月齢マウスと18ヶ月齢マウスでは、体温やBAT活性化に有意な差は認められなかった(図1A、B)。

アルツハイマー病発症におけるタウリン酸化の重要性(Cowan and Mudher, 2013; Frost et al 2014; Querfurth and LaFerla, 2010; Tremblay et al 2007)を考えると、次に、寒冷曝露がキーエピトープのリン酸化を増強する程度を評価した。その結果、18ヶ月齢のマウスは寒冷曝露に反応してタウのリン酸化が亢進していることがわかった。より具体的には、低温曝露は若いマウスでは pSer396/404 のリン酸化を増加させ(40%)6 ヶ月齢マウスと 18 ヶ月齢マウスでは pSer202 のリン酸化を増加させたが(それぞれ 101%と 132%)高齢マウスのみが pThr181 と pThr231 の増加を示した(それぞれ 41%と 61%;図 1C と D)。双方向ANOVAは、可溶性画分中のリン酸化されたタウ種に対する低温のアップレギュレーション効果をさらに確認した(pSer202ではp¼ 0.0001,pThr231ではp¼ 0.026,pThr181ではp¼ 0.031)。

興味深いことに、寒冷曝露に応答して可溶性タウのリン酸化は体温と相関しており、両方のイベントがリンクしていることを示唆している。実際、6ヶ月齢マウスと18ヶ月齢マウスの両方において、タウのpSer202が体温と相関していることがわかった(r2 ¼ 0.16と0.43,それぞれ;図1E)。しかし、pThr231とpThr181の可溶性タウのphos-phorylationレベルは、高齢マウスでのみ体温と相関があり(それぞれr2 ¼ 0.29とr2 ¼ 0.47)若いマウスでは相関がなかった(図1FとG)。

3.2. 若いマウスではGSK3βが不活性化されたが、老齢マウスでは不活性化されなかった。

タウのリン酸化はキナーゼとホスファターゼによって制御されているので(Wang et al 2013)、次に、若いマウスと古いマウスの大脳皮質ホモジネート中のこれらの主要な酵素のいくつかを測定した。4 Cに曝露した後、主要なホスファターゼおよびキナーゼ(図1IeL)には有意な変化は見られなかったが(2-way ANOVAにより、年齢が高いほどAKT(pSer473)/AKT比が高いことが明らかになった(p ¼ 0.038)。特に、GSK3βの活性化型(pTyr216)は、若齢マウスでも老齢マウスでも寒冷曝露によって変化しなかった。しかし、不活性化型(pSer9)は、低温曝露した6ヶ月齢マウスの大脳皮質ホモジネートにおいて、室温曝露マウスと比較して49%高かったが、18ヶ月齢マウスでは観察されなかった(図1KおよびL)。

4. 考察

本研究では、低温暴露マウスの大脳皮質における可溶性タウのリン酸化を増加させることを示唆するこれまでの観察結果(Planel et al 2007; Vandal et al 2016)を確認しただけでなく、より重要なことは、加齢がこの現象を悪化させることを示唆していることである。

我々はまた、保護キナーゼ関連メカニズムの喪失が、高齢マウスで観察されたより高いタウリン酸化の下敷きとなりうることも明らかにした。これらの知見は、加齢による体温調節障害のアルツハイマー病様神経病理への変換を促進するメカニズムを説明する可能性を提供し、加齢がアルツハイマー病の主な危険因子である理由を明らかにするものである。

高リン酸化タウの脳内蓄積は、アルツハイマー病の主要な神経病理学的特徴の一つと考えられている(Frost et al 2014; Querfurth and LaFerla, 2010)。我々の最初の一連の研究は、可溶性タウの高リン酸化状態を指標化することに焦点を当てたもので、これは病理学的な凝集および脳内神経原線維のもつれの形成に先行すると考えられている(Avila et al 2004; Buée et al 2000)。特に、pThr231タウは、タウ過リン酸化カスケードを開始すると考えられている(Martin et al 2011)。可溶性タウのリン酸化とアルツハイマー病症状との関連性をさらに支持して、我々は以前に、pSer396/404およびpThr231タウの両方が、Rush宗教教団研究のアルツハイマー病、軽度認知障害、および非健常者対象において、前夜の認知パフォーマンスと相関することを示した(Bennett et al 2004; Calon et al 2015)。本データは、体温低下後のタウリン酸化の増加の以前の報告を裏付けるものである:pSer202,pThr231,およびpThr181におけるタウリン酸化は、すべて冬眠者で増加している(Arendt et al 2003)一方、マウス脳におけるpSer202およびpThr181のタウは、一貫して、麻酔誘発性体温低下後に増加することが示されている(Planel et al 2007; Run et al 2009)。興味深いことに、体温の低下は可溶性タウのリン酸化の増加と相関しており、体温低下と可溶性タウのリン酸化の増加との関連性は、特に高齢になるとさらに強化された。

タウのリン酸化は、生体内ではcdk5,CAMKII、JNKなどのいくつかのキナーゼによって調節されているが(Wang et al 2013)GSK3βが最も顕著である(Kremer et al 2011;Takashima 2006)。我々は、寒冷曝露後の6ヶ月齢マウスが、古い動物に比べて可溶性タウリン酸化の増加が小さいだけでなく、GSK3βの不活性化型(pSer9)の高いレベルを示したことを発見した。冬眠中のリスの前脳では、夏に活動する動物に比べてGSK3βの不活性化の兆候が見られた(Su et al 2008)。これは、若いマウスがGSK3βの活性を低下させることで、病理学的なタウのホスホリル化の増加を防いでいるという解釈が考えられる。

以上のことから、本研究の結果は、体温が2℃下がると、高齢マウスでは若いマウスに比べて大脳皮質のタウリン酸化がより重要に亢進することを示唆している。このことから、高齢者(65〜74歳と85歳以上)で報告されている0.5℃の体温低下(Gomolin et al 2005)は、時間の経過とともに脳内のタウのリン酸化を促進し、アルツハイマー病の発症に寄与している可能性が考えられる(Whittington et al 2010)。もしそうであれば、このことは、高齢になると体温の変化に対する感受性が高くなり、それによってアルツハイマー病発症のリスクが高まることを意味する。最後に、体温調節とタウのリン酸化を結びつける可能性のあるメカニズムとして、高齢になるとキナーゼの不活性化が起こるということが挙げられる。以上の結果から、高齢者の自然な体温調節機構を改善することが、アルツハイマー病の新規治療戦略になると考えられる。

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