査読論文：ナノシルバー（コロイダルシルバー） | 抗生物質耐性との闘いにおいて大きな可能性を秘めた旧来の抗菌剤（2023）
アンチバイオティクス（バーゼル）. 2023 Aug; 12(8)： 1264.

Nanosilver: An Old Antibacterial Agent with Great Promise in the Fight against Antibiotic Resistance

Published online 2023 Jul 31. doi: 10.3390/antibiotics12081264

PMCID: PMC10451389

PMID: 37627684

Kyra G. Kaiser,1,2 ；Victoire Delattre,1,2 Victoria J. フロスト,3,4 Gregory W. バック,1,2 Julianne V. Phu、3,4 Timea G. フェルナンデス、3,4,* and Ioana E. Pavel1,2,*

Ana Olívia De Souza、 アカデミック・エディター およびGabriel Padilla、 アカデミック・エディター

要旨

細菌における抗生物質耐性は世界的に大きな問題であり、米国では入院期間の延長、資源の利用、追加の治療費などで年間550億米ドルのコストがかかっている。この総説では、古代から現在に至るまでの銀の役割と形態（例えば、バルク銀、銀塩（AgNO3 ）、コロイド銀）、そして最終的に銀ナノ粒子（AgNP）として多くの抗菌消費者製品や生物医学的応用に組み込まれた銀について検証する。AgNPの製造方法、物理化学的特性、グラム陽性およびグラム陰性細菌モデルにおける抗菌メカニズムが網羅されている。特に、問題となっているESKAPE病原体や、世界保健機関（WHO）によると人体への影響が最も懸念される抗生物質耐性病原体に重点を置いている。この総説では、各細菌モデルの違い、病原体との相互作用におけるAgNPの物理化学的特性の役割、AgNPとAg+ によって放出されたAgの細胞構造成分に対するその後のダメージについて詳述している。最後に、抗生物質耐性の獲得過程と、新規AgNP-抗生物質コンジュゲートがどのように抗生物質耐性病原体の増殖を相乗的に減少させるかについて、抗生物質単独では効果が低下する有望な例を踏まえて紹介する。

キーワード： ナノ銀、抗菌アプリケーション、物理化学的特性、抗菌メカニズム、相乗効果、抗生物質耐性菌

AI解説

1. 銀(Ag)の簡単な歴史とその古い抗菌用途

銀の歴史は古く、紀元前から現代に至るまで、何千年にもわたって使用されていた（表1）[1,2,3]。この銀の長期的な使用は、その劣化防止活性に端を発し、最も重要な抗菌剤（すなわち、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗真菌剤）として認識されるようになった、5, 6, 7, 8, 9].

表1 主な歴史的時代を通しての銀（Ag）の知識と用途の概要

銀の家庭での使用は、銀を治療薬として使用する基礎に貢献したため、家庭用と医療用の両方が記載されている。

	銀 紀元前 [1,4,7].	銀 工業化以前[1,7]。	工業化期の銀と 工業化後の銀 [8]。
知識	金属として発見されたAg 食品を扱う道具として認められたAg 基礎医学としてのAg	Agが医療として認められる Agと細菌治療との初めての相関	1676年細菌の発見 1868年、細菌説 1910年、研究室で最初の抗菌化合物が合成される。 最初の抗生物質（ペニシリン）が発見される（1928年 Agが感染症治療の殺菌剤として認められる
用途	食品・飲料の保存（バルクAg） 創傷治療やその他の医療（銀塩や銀箔など）	食用・水用の銀食器（バルクAg） 創傷治療（例：Agベースの絆創膏）およびその他の医療処置（例：Ag塩およびAgバルク）	外科的処置（例：Ag縫合ワイヤー） 創傷治療（銀コロイド、銀塩など）

紀元前(B.C.E.): 紀元前文明における抗菌目的の銀の使用は、主に銀の容器に食品を保存したり、長期保存のために飲料に銀貨を加えたりしていた[1,9]。基本的な発見は、銀で作られた容器と、安全に消費できる食品との相関関係であった。様々な国の支配者たち（アレキサンダー大王やキュロス大王）は、銀の容器に入れた水しか飲まなかった[1,6,10,11]。当時は細菌が知られていなかったとはいえ、銀の容器やカトラリーによって食べ物の腐敗が遅くなるという関係は、今日見られる医学の進歩に貢献した[8]。古文書の解釈は難しいため、銀を治療薬として使用した最初の記録については、さまざまな主張がある。最も古い例としては、紀元前1500年、中国の漢の時代に、銀を治療薬として使用したという記述がある[12]。銀を使用した医療処置の他の記録には、紀元前69年のローマ薬局方がある。ローマ薬局方には硝酸銀(AgNO3)ベースの薬が記載されている、 1,4,8,13]。

産業革命以前: 紀元前から1760年の第一次産業革命まで、銀は幅広い病気（例えば、潰瘍、創傷感染症、膿瘍など）のための新しい医療療法として使用されました、(潰瘍、創傷感染、不純血液、動悸、口臭、てんかん、炎症など)[1,14]。例えば、ローマの医師であった長老プリニウスは、彼の79 C.E. (Common Era)の著書、 『博物誌 (第XXIII巻)』の中で、銀を絆創膏の中や傷口を塞ぐための効果的な治癒剤として記述している[11,15]。アンブロワーズ・パレ（Ambroise Paré）は、複数の王（アンリ2世、フランシス2世、シャルル9世、アンリ3世）に仕えたフランスの外科医で、外科手術の父の一人と考えられており、銀や他の材料を使って眼球補綴物を作った[4,16]。中世の裕福な人々は、定期的に銀の食器を使用していたため、銀を過剰に浴び、アルジニアを発症した（図1）、皮膚、目、爪、内臓の色が永久に青灰色に変わる珍しい皮膚疾患である[1,17,18]。

図1 局所チアノーゼに特徴的なアルギリア様皮膚色（右）と、健康な患者における標準的な手の着色のシミュレーション（左）の比較。

工業化時代： 1676年のアントン・レーウェンフックによる細菌の発見や、1760年の産業革命に伴う技術の進歩といった重要な出来事が、医学の変革につながった [2,19]。抗生物質がまだ医療分野に存在していなかったため、医師たちは、後に治療薬として有益、有害、あるいはまったく効果がないとみなされた他の薬剤（銀、水銀、銅、ヒ素、硫黄化合物など）を使用した［20］。また、1736年に最初の公立病院であるベルビュー病院がニューヨーク市に正式に設立されたことで、医療に対する市民の態度も劇的に変化した [21]。予防接種の概念は、1796年に医師のエドワード・ジェンナーの仕事を通じてルーツがあった。彼は、以前に牛痘にかかった患者と天然痘に対する免疫との間に関連性を見出したのである[22]。彼は8歳の少年に牛痘の病巣から採取した材料を接種し、その少年は病気から守られていると結論づけた［22］。これがワクチン接種のような感染防御の起源である[23]。最初の抗生物質が発見された19世紀までは、ワクチンは最も進んだ医療手段であった［24］。

工業化以降： 19世紀、医師ロベルト・コッホは、特定の細菌が特定の病気を引き起こすという主張を行った。これがコッホの4つの定説と、今日見られるジャーム理論につながった[25,26]。これに続き、医師のポール・エーリック夫妻は1910年に最初の抗菌化合物であるサルバルサンを合成した [24,27,28]。医師である科学者アレクサンダー・フレミングは、1928年に細菌感染を治療する最初の真の抗生物質、ペニシリンを発見した[24,27,28]。ペニシリンはその後、1945年に一般に入手可能になった[29]。この頃、コロイダルシルバーは抗菌剤として病院で採用され、銀塩はさまざまな感染症や病気（結膜炎、淋病、胃腸炎、梅毒、ニコチン依存症、精神疾患など）の治療に投与されていた[8]。ドイツの医師であるカール・ジークムント・フランツ・クレデは、1881年に新生児結膜炎のために2%のAgNO3  溶液を処方したが、これは非常に効果的で、この病気による視覚喪失をほぼ終わらせた [8,30]。1800年代における他のAgNO3 の応用には、火傷、潰瘍、複雑骨折、感染症の治療が含まれていた[1,31]。医師マリオン・シムズは、分娩後の膀胱膣瘻のジレンマ（絹の縫合に失敗した場合）を解決するために採用し、治癒期間中に銀でコーティングしたカテーテルを投与した[1,31]。コロイド銀（すなわち、液体中に懸濁された銀粒子）は、1891年に外科医B.C.クレデによって、傷の防腐対策として初めて採用された[1,12,32]。

銀（Ag）の形態： 銀の科学的な理解が歴史の過程で拡大するにつれて、利用される銀の形態も変化した（図2）。当初、Agは、家庭用品（器、宝石、硬貨など）を鋳造・鍛造する際にはマクロの形（バルクのAg金属）で、傷やその他の病気を治療する際には原子の形（Ag+ イオンの塩溶液）で利用された。これは、抗生物質がまだ利用できなかったので、水中のAgのマイクロまたはナノフォーム（コロイドAg）の開発と投与が続いた[8,28]。銀の最初のコロイドは、1889年に化学者M.C.Leaによって実験室で合成された[33,34]。この酸化還元反応では、Ag+ またはバルクのAg形態と比較した場合、その特性が変化する約1～100ナノメートル（nm）の寸法を持つクエン酸塩キャップAgNPsが意図的に作成された[35]。しかし、ナノテクノロジーという言葉は、ずっと後の1974年に日本の谷口紀夫教授によって作られたものである[36]。最初の走査型トンネル顕微鏡（STM）が発明された後、1981年に最初のマイクロ粒子とナノ粒子が可視化され、特性評価された。現在では、イオン銀（Ag+）とナノ銀（コロイドAgNPsなど）が抗菌銀の最も重要な形態であり、病原性細菌、ウイルス、真菌を含む微生物を死滅させるか増殖を抑制するが、宿主にはほとんどダメージを与えない。

図2 紀元前から現代まで利用されてきた銀（Ag）の形は、肉眼で見える大きさ（1mm以上）から約0.1 nm（原子半径以上）[35,37,38,39,40 ]。各カテゴリー内の様々な病原体（例． 各カテゴリー内の様々な病原体（例えば、Toxocara canis [通常2-10 cm]と蟯虫 Enterobius vermicularis [通常1-3 mm]のマクロ病原体 >；> 1 mm)はAg型[41,42,43,44]のサイズ比較を示す。比較尺度は近似値。

2.ナノ銀の現代的抗菌アプリケーション

コロイド状銀ナノ粒子（AgNPs）などのナノ銀の抗菌活性は、非常に大きな表面対体積比や、好ましい酸化還元条件下でのナノ表面からのAg+ イオンの潜在的放出のような、そのユニークでサイズに関連した物理化学的特性に関連している。これらの特性は、現在、日常的な消費者製品の製造やその他の抗菌用途で利用されている（図3）[4,5]。

抗菌消費者製品：2023年には、5367の消費者製品が製造者によってナノ材料を含むものとして世界中で確認されており、これらの製品のうち1000以上がナノ銀のユニークな特性（抗菌、光学、触媒など）を利用している[45,46]。銀を含む抗菌消費者製品（図3）は、健康（24.08%）、繊維（17.53%）、化粧品（13.38%）、電化製品（9.31%）、環境（8.30%）、建設（7.93%）の各分野で見られる[46]。過去数十年の間に、米国食品医薬品局（FDA）は、抗菌Ag+ やAgNPsのようなナノ銀を含むこれらの製品の多くを承認した。例えば、創傷被覆材、マスク、繊維、除菌剤、手術用具のコーティング、歯科インプラント、尿道カテーテルなどである（表2）[45,47]。

図3

ナノ銀を含む消費者製品の最も一般的なカテゴリー（米国FDA認可および非認可）は、1084の登録製品を占める[46]。上位3部門である医療、繊維、化粧品関連製品（紺色）が最も目立つカテゴリーで、ナノ銀を含む消費者製品の総数の～55％を占めている。それ以下の7つのカテゴリー（灰色）は、製品の~45%を占めている。

「銀創傷被覆材」は、最も多くウェブ検索され（n=2214-表2）、医療分野で銀を含む消費者製品の中で最も多く使用されているものの一つである。多種多様な米国FDA認可（例えば、シルバーロン、アクアセルAgアドバンテージ、アクティコート）と非認可の創傷被覆材が、処方箋や市販薬を通じて提供されている[48,49,50]。銀ベースの創傷被覆材は、急性および慢性創傷の細菌感染に対する予防的および治療的措置の両方として使用される。ナノ銀の2番目に広範な用途である繊維製品は、多くの種類の衣類（例えば、フェイスマスク、靴下、シャツ、運動着、タオル）に使用されている[45]。ナノ銀の使用に関連する例示的な例は、病原体の拡散や、皮膚の表面に生息する細菌コロニーによって引き起こされる悪臭の形成を防ぐためのフェイスマスクの殺菌剤である[51]。第3の分野である化粧品メーカーは、同じ抗菌効果を得るためにナノ銀を採用している[52]。ナノ銀はローション、フェイスマスク、石鹸、日焼け止めなどに含まれている。[45]。

Agの人体への悪影響はまだ十分に理解されていないため、ナノ銀ベースの消費者製品の製造中や長期間の使用中にナノ銀への曝露が増加する懸念が提起されている[53]。さらに、ナノ銀の特性は環境中で変化する可能性があり、毒性や安定性の変化につながるため、ナノ銀の環境健康への影響は依然として議論されている[54,55,56]。ナノシルバーベースの消費者製品の規制は、特に微量である場合、成分としてナノ材料を特定しない製品を追跡するという困難な作業と、異なるブランド名での製品流通によって複雑化している[57]。とはいえ、消費者製品へのナノ銀の統合は、垂直的な増加を続けている。世界中で推定1000トンのナノ銀が生産されている[58]。

表2 抗菌銀(Ag)の主な用途を、健康、繊維、化粧品の3つの主要カテゴリーごとに例示製品とともに示した

ベンダー、PubMedの検索結果数と選択したキーワード、Agの形状、[Agの量]、製品の目的、米国FDAの承認状況が報告されている[49,59,60]。

製品タイプ	検索結果	ベンダー	[Ag]およびAgフォーム	目的	米国FDA 承認
銀ベースの創傷被覆材	「銀創傷被覆材” n = 2214	アクアセルAgアドバンテージ-コンバテック、バークシャー、イングランド	1.2% w/w-“イオン銀”	急性創傷や治りにくい創傷の感染予防と治療	はい
シルバーのアンクルソックス	「シルバーテキスタイル” n = 1155	ナノシルバー、デンマーク、E.U.	未報告-“ナノ銀”	病原体から身を守る	NO
プラチナシルバーナノコロイドクリーム	“シルバーコスメ” n = 2292	DHCスキンケア、東京、日本	未報告-“ナノシルバー”	汗に含まれる細菌を除去する	NO

その他の抗菌アプリケーション： 最近、AgNPsとAg+ は、2つの主要な世界的な健康脅威、すなわち治療法が限られているか利用できない抗生物質耐性とウイルス感染との戦いにおける潜在的な使用により、注目度が高まっている[61]。例えば、非細胞毒性濃度のAgNPsは、向性、クレード、抗レトロウイルス薬に対する耐性に関係なく、異なるファミリーのウイルスの幅広いスペクトルに対して作用することが報告されている[61,62,63]。関連する例としては、HIV-1、B型肝炎（HBV）、タカリベウイルス、単純ヘルペスウイルス、天然痘、H1N1インフルエンザA、呼吸器合胞体ウイルス、ワクシニアウイルス、デングウイルス（DENV）などがある。これらの研究において、AgNPはビリオンのエンベロープにあるタンパク質に特異的または非特異的に結合し、それによってビリオンを不活性化することがわかった（殺ウイルス活性）。これらの標的タンパク質は、主にウイルスと宿主細胞との相互作用を担っている[13,61,62,63]。ウイルスが宿主細胞に侵入する前段階では、AgNPは競合的に細胞に付着し、ビリオンの膜を溶解する（抗ウイルス活性）。ウイルス侵入後の場合、AgNPは主にウイルスと細胞膜の融合を阻害し、いくつかのケースではウイルスRNAの合成などウイルス複製サイクルの段階を妨害した（抗ウイルス活性）。分子レベルでは、これらのメカニズムは、AgNPsまたはAg+ AgNPsによって放出されたAg+  イオンと、タンパク質や遺伝物質を含む硫黄、窒素、またはリンを含む生体分子との化学的相互作用に依存していた。したがって、AgNPsは複数の作用機序を持っており、特定の抗ウイルス療法や抗生物質療法と比較した場合、AgNPsに対する耐性が生じにくくなることを示唆している[64,65,66]。

世界保健機関（WHO）は、ヒトの健康に最大の脅威をもたらす優先度の高い（第一段階）抗生物質耐性病原体のリストを発表した。これらには、アシネトバクター属、シュードモナス属、腸内細菌科、腸内細菌科の菌株が含まれる；および様々な腸内細菌科属（クレブシエラ, エシェリヒア・コリ (E. coli）、 Serratia、 Proteus）を含む。[67]。これらの病原菌のほとんどはグラム陰性菌であり、グラム陽性菌と比較して耐性が増加している。グラム陰性菌はリポ多糖類（LPS）を含む外膜を持ち、外部からの有害な因子に対して透過性のバリアを作る[68]。例えば、緑膿菌 （P. eruginosa）は、ナノシルバーベースの製品が一般的にテストされるグラム陰性種であり、この生物は「最終ライン」または「最後の手段」の抗生物質として使用されるカルバペネム系抗生物質に対する耐性のために重要であるため、優先順位1としてリストされている［67,69 ］。入院に起因する感染症の主な原因である6つの多剤耐性（MDR）病原体のうち4つもグラム陰性菌であり、ESKAPE病原体（腸球菌（E. faecium）、黄色ブドウ球菌（S. aureus)、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニー（A. baumannii)、緑膿菌、 および 腸内細菌 種) [70]。グラム陰性菌とグラム陽性菌の例がもたらす差し迫った脅威のため、この総説では主に、これらの生物における抗生物質耐性との戦いにおけるAgNPsの潜在的な使用に焦点を当てている。

3.グラム陰性菌（GNB）対グラム陽性菌（GPB）モデル3.

抗原感受性、生化学反応、表現型特徴、および増殖パターンに基づく複数の細菌分類があるが、細菌株が分類される前に、その種が属する主要グループがまず知られなければならない [71]。細菌の主要なグループは、グラム染色結果、細胞の形（球形の球菌、棒状の桿菌、らせん状の紡錘形）、運動方法（鞭毛の有無など）、抗酸菌の結果、内胞子の発達、カプセルや封入体の有無などの形態学的特性によって分けられる[71,72]。細菌種の変異は、抗生物質や環境中で遭遇する可能性のある毒素などの細胞外物質に対する細胞の脆弱性と耐性を規定する。特に、膜の組成は細菌の生存に大きな影響を及ぼす。なぜなら、膜は敵対的な環境における防御の第一線として機能すると同時に、細胞が生き残るために必要な栄養素や代謝産物に対する選択的透過性を可能にするからである[73]。グラム染色は、細菌を2つの大きな分類グループ、グラム陽性とグラム陰性（時折グラム変種を含む）に区別するために利用される。以下に概説するように、2つのグループの主な細胞壁の違いの1つは、グラム陽性菌が細胞質膜の外側に厚いペプチドグリカン細胞壁を持つのに対し、グラム陰性菌は細胞質膜と外膜の間に薄いペプチドグリカン層を持つことである[73,74]。

グラム陽性菌（GPB） （例． E. faecium、 S. aureus、 Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae）、および Bacillus brevis (B. brevis）は、細胞膜の外側にある厚い（20-80 nm）ペプチドグリカン細胞壁に付着したクリスタルバイオレット染色液の一次塗布により、グラム染色で紫色を示す（図4）[74]、75,76]。ペプチドグリカンは、修飾された糖、N-アセチルグルコサミン（NAG）とN-アセチルムラミン酸（NAM）から構成されている。ペプチドグリカンまたはムレインは、細胞の安定性、形状、浸透圧への耐性、環境からの物理的保護、環境適応における一貫したリモデリングからのさらなる防御を提供する[77,78]。このポリマー層にはテイコ酸が含まれており、テイコ酸はホスホジエステル結合を介して共有結合でペプチドグリカンに結合し（壁テイコ酸（WTA））、ペプチドグリカンを伸長しながら細胞膜上の糖脂質を介して膜に固定されている（リポテイコ酸（LTA））[73,79]。テイコ酸は全体的な疎水性と細胞の表面電荷（例えば例えば、B.brevisでは-86 mV）、金属陽イオンを持っているためだ。brevis）は金属陽イオンを持ち、負のリン酸基への吸着を促進し、細胞の恒常性と保護を助けるからである［80,81,82,83 ］。ほとんどのMDR病原体（ESKAPE）はGPBではないにもかかわらず、GPB株による感染症が懸念されている。

図4 厚くなったペプチドグリカン層、リポテイコ酸、およびGPBにのみ特徴的なテイコ酸を有するグラム陽性菌（GPB）壁。一部のオブジェクトは説明のために縮尺を変更している場合がある。

グラム陰性菌（GNB） （例． P. aeruginosa、 K. pneumoniae、 Vibrio vulnificus (V. vulnificus）、 A. baumannii、 E. coli、およびその他の Enterobacter ；種) [83,84,85,86] は、クリスタルバイオレットがないためにピンク色または赤色を示す、グラム染色で対染色としてサフラニンを加えた場合[74,75]。ペプチドグリカンはGNB中に存在するが、薄い層（5-10 nm）（図5）で、単層であることもある（例えば、 大腸菌では最大80％のペプチドグリカンが単層として存在する）。[74,87]。低いペプチドグリカン含量を補うために、GNBはほとんどの種でリポ多糖（LPS）を保持する外膜（厚さ7.5-10 nm）を持ち、これはGNB細胞だけに存在する[74,88,89]。ペプチドグリカンと同様、LPSは主に細胞の構造的完全性を担っている[86]。細胞膜のリン脂質二重層構造とは異なり、外膜は非対称であり、LPSは外膜の外側のリーフレット上にあり、リン脂質は内側のペプチドグリカン層と細胞質に面している[90,91]。親水性多糖類コアと分岐O抗原と共に）LPSの3つの構成要素の1つである脂質Aまたはエンドトキシンは、宿主免疫反応を刺激する高い効力に寄与し、種によって構造が異なる[86,91]。外膜表面のLPSは、細胞外空間へのバリアとして機能することにより、親油性化合物（例えば、フルオロキノロン、マクロライド、チゲサイクリン、リンコサミドなどの特定の抗生物質）に対する透過性を低下させる[68,92]。LPSの構造は非常に緻密で、多糖鎖が外側に伸びており、陰イオンのリン酸基と陽イオンの間のイオン的相互作用によって密接にパックすることができる[93,94]。これらの相互作用はLPSのバリア能力を高める。

図5 グラム陰性菌（GNB）の壁： 薄いペプチドグリカン層、リポ多糖（LPS）、脂質A [82]。説明のため、縮尺が合わないものもある。

GNBの特殊な膜構造により透過性バリアが強化されているため、GNB株はGPB株よりも高い抗生物質耐性を示す。CDCの概算によると、抗生物質耐性に関連する経費は、米国だけで年間550億ドル、生産性の損失は350億ドルであり、抗生物質耐性のジレンマは極めて重要である[95,96]。このような膜の構造の違いは、抗菌AgNPsとの相互作用の可能性を変え、AgNPsの物理化学的特性によっても異なる。

4.銀ナノ粒子（AgNP）モデル

AgNPの作製： ナノ作製法には大きく分けて2つのカテゴリーがある： 「トップダウン」と「ボトムアップ」である（図6）。各製造法にはそれぞれ独自の利点と欠点があり、この2つを絡めて（ハイブリッド法）、ナノ材料に望ましいPCC特性をもたらすことができる[97]。トップダウン」法は、バルク材料を粉末または断片に分解し、物理的または化学的プロセスによってNPに還元する[97]。ボトムアップ」法はその逆で、原子や分子が化学的、生物学的、物理的条件下で反応し、NPに集合するクラスターや核を形成する[97]。例えば、”トップダウン”アプローチでは、金属ソースをホスティングする抵抗ボートのジュール加熱によって最初に溶融される固体Agソース（バルク）の蒸発は、Ag原子とAgナノクラスターを生成することができる（熱蒸発）[98,99]。しかし、「ボトムアップ」手順では、これらの蒸発したAg原子は固体基板に移動し、高真空（10-6 torr） 条件下での核形成によってAgの薄い層（膜）を形成することができる（化学気相成長）[100,101]。

図6「トップダウン」法と「ボトムアップ」法による銀ナノ粒子（AgNPs）の形成を示す概略図。いくつかの例示的なアプローチ [97,98,99,100、101, 102, 103, 104, 105、106, 107, 108, 109, 110、111,112,113]が各カテゴリーごとに掲載されている。

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化学的・生物学的プロセスは、弱い分子間相互作用を操作する必要があるため、主に「ボトムアップ」ファブリケーションで使用される[97]。これとは対照的に、強い共有結合を切断しなければならない”トップダウン”ファブリケーションでは、物理的アプローチが一般的に好まれる[97]。レーザーアブレーションと蒸発-凝縮は、AgNPsを製造するために使用される最も一般的な物理プロセスの一つである[114]。レーザーアブレーション銀ナノ粒子」と「蒸発銀ナノ粒子」という言葉を使ったPubMed検索では、それぞれn=345とn=234の論文がヒットした（表3）。物理的プロセス（表3）によって作製されたAgNPsは、化学的プロセス[115,116]に比べて、サイズ分布が狭く、溶媒や他の試薬による汚染のリスクが少ない。しかし、エネルギー消費量が高く、収率もそこそこであるため、物理的製造法の費用対効果は低い[116]。近年、高価であったり有害物質を使用したりする化学的・物理的プロセスに代わるものとして、生物学的プロセスが開発されている（表3）。生物学的アプローチでは、有害な還元剤やキャッピング剤は、植物抽出物、バクテリア、菌類、酵素などの生体適合性化合物で代用される[116,117]。例えば、Ag+ イオンに耐性があるZarshouranゴールド鉱山（イラン）のバクテリア（Bacillus ROM6）が単離され、直径25 nmの球状AgNPsの合成に利用された。9 g L-1 of AgNO3  [118]を用いた。還元剤とキャッピング剤としてガンマ線（5kGy）を照射した蜂蜜30gを用いて、直径4nmのほぼ球状のAgNPを作製した[119]。これらのハチミツでキャップされたAgNPは、GNBとGPBの両方を殺すことがわかったが（最小発育阻止濃度（MIC）は1.69～6.25μg mL-1 ）、GNBではより効率的であった[119]。これらの新しい種類のコロイドAgNPsは環境に優しく、医療や環境への応用が可能な生体適合性がある[120,121]。しかし、生物学的プロセスは、あまり均質でないAgNPsの形成につながり、大規模または高価な精製を必要とする[122]。

表3 AgNPs製造のための化学的、物理的、生物学的プロセスの概要：

製造成分、利点、欠点。プロセスの種類ごとにPubMedの検索ワードと関連論文数（n）を掲載

プロセス	コンポーネント	メリット	デメリット
Chemical [116,123,124] PubMed： “silver nanoparticles chemical fabrication” n = 1459	溶媒 金属前駆体 還元剤 キャッピング剤 官能基化剤-任意	高収率 シンプル 迅速 低コスト 官能基化が容易	毒性試薬 環境に優しくない
Biological [116,117、120,121,122] PubMed： “silver nanoparticles biological fabrication” n = 940	金属前駆体 溶媒 その他の試薬：植物抽出物、バクテリア、菌類、酵素など	環境に優しい 生体適合性	幅広い粒度分布 高コストな精製
Physical [115,116,125] PubMed： “silver nanoparticles physical fabrication” n = 290	金属源 エネルギー源 溶媒	狭い粒度分布 迅速 化学汚染なし	歩留まりが悪い 高コスト

コロイド状AgNPs [123]の製造においては、化学合成が物理的・生物学的手法よりも優勢であり続けている。ほとんどの化学試薬は有害であり、多くの化学的方法は環境に優しくないにもかかわらず、である。PubMedで「銀ナノ粒子の化学的製造」と「銀塩から銀ナノ粒子」を検索すると、それぞれn=1459とn=690の論文が見つかった。金属塩の還元は、コロイド状AgNPs[114]のための最も使用される「ボトムアップ」製造である。すなわち、Ag+ イオンを含む銀塩のような銀前駆体、Ag+ イオンのための還元剤、溶媒、キャッピング剤、およびナノ表面のためのオプションの官能化剤である[116]。酸化還元反応では、Ag+ イオンは溶液中でAg0 に還元され、原子の核生成によってクラスターを形成する（図7）。これらのクラスターは、キャッピング剤の助けを借りて安定化するAgNPへと成長を続ける。キャッピング剤は一般的に、AgNPの安定性、サイズ、形状、反応性、溶解性を制御するために使用される[124]。化学的製造法の包括的なレビュー[126]は、ほとんどのコロイドAgNPが負の表面電荷を持ち、金属前駆体としてAgNO3 ；を金属前駆体として使用し（n=690の総説の80％）、その後の官能基化の前に水素化ホウ素ナトリウム（23％、Creighton法）やクエン酸三ナトリウム（10％、Lee Meisel法）などの還元剤を使用する。これらの低コストの還元剤は、高い反応収率につながり、官能基化プロセスを容易にする[116]。水（>80%）は、環境および生物学的影響が少ないため、好ましい溶媒である。クエン酸三ナトリウムからのクエン酸塩が最も一般的に使用されるキャッピング剤（50％）であり、ポリビニルピロリドン（PVP、18％）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、アミン、アミド、脂肪酸がそれに続く[127]。さらに、AgNPは安定性を高め、凝集を防ぐために官能化することができる[128]。AgNPの機能化は、治療や医療診断の用途で特に有用である[128]。例えば、コアAgNPの抗菌特性は、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン）または非抗生物質（例えば、キトサンやポリフェノール生体分子などの他の抗菌剤）で官能化することによってさらに高めることができる[129,130]。多くの細菌感染の治療に使われる抗生物質であるストレプトマイシンを機能化したAgNPは、AgNPや抗生物質単独と比較して、黄色ブドウ球菌 (MRSA)に対する抗菌活性の増加を示した[129]。様々な細菌株に対して強い活性を持つ抗菌薬であるセファドロキシルと結合したAgNPは、セファドロキシル単独の抗菌力を2倍まで向上させた[S. aureus ]。抗菌性キトサンと海藻由来のポリフェノールで機能化したAgNPsは、GNBとGPBの両菌株（E. coli, Proteus, Salmonella, Bacillus cereus）に対して、機能化していないAgNPsと比較して優れた抗菌活性を示した[130]。代替抗菌化合物としての天然物も、既存の抗生物質の副作用を回避するために研究されてきた。例えば、研究者らは、黄色いマレーシア産ランブータン（Nephelium lappaceum）の果皮に、耐性菌の壁を破る抗菌化合物が含まれていることを突き止めた[132]。異なる溶媒を用いたカービー・バウアーディスク拡散アッセイによるこれらの粗抽出物の初期スクリーニングでは、枯草菌に対する有望な抗菌効果が示された。subtilis,  P. aeruginosa,  S. enterica, MRSA, and S. pyogenes  [132]. 酢酸エチルまたはアセトン画分を一般的な分離方法で化学的プロファイリングにかけると、阻害活性を有する可能性のある生理活性化合物のコレクションが同定された[132]。仮想スクリーニングと分子動力学シミュレーションにより、同定された3つの生物活性化合物（すなわち、カテキン、エプレレノン、オリチン-4-β-オール）は、P. aeruginosa およびS. aureusのDnaKタンパク質と結合すると予想された。 DnaKタンパク質は細菌のストレス応答を媒介する既知の熱ショックタンパク質であり、したがって、DnaKのシャペロン機能を麻痺させる生物活性化合物は有望な薬剤候補である[132]。

図7 AgNO3 ；イオンをAgNO3 with triisodium citrate [116,123,124]. いくつかのオブジェクトは、説明のために縮尺がずれている可能性がある。

AgNPsの物理化学的特性評価（PCC）：各製造プロセスは、AgNPsに固有のPCC特性（サイズ分布、凝集、形状、表面積、表面対体積比、化学組成、純度、表面官能基化、表面電荷、溶解度）を与える（表4）。これらのPCC特性を確立し、適用中の挙動を予測するために、数多くの特性評価技術を採用することができる。これらのPCC法は、エネルギー源と信号の起源の現象によって区別される[97]。例えば、分光学的特性評価法（例えば、FT-IRやラマン分光法）は、光子ベースであり、弾性および非弾性散乱現象を含むことがある[97]。電子特性評価法（SEMやTEMなど）は加速電子ビームを使用し、熱力学特性評価法（TGAなど）は温度や圧力などの熱力学パラメータをプローブとして使用する[97]。

表4 44AgNPsの物理化学的（PCC）特性および米国環境保護庁（EPA）が推奨する特性評価方法[97]

環境保護庁（EPA）[97,116,133、134,135,136,137].

PCCの特性	特性評価技術
粒度分布と凝集	紫外可視吸光光度法、動的光散乱法(DLS)、X線回折法、走査型電子顕微鏡(SEM)、透過型電子顕微鏡(TEM)
形状	SEM、TEM、STM、原子間力顕微鏡（AFM）
表面積と表面積体積比	TEMおよびブルナウアー・エメット・テラー測定
化学組成と純度	紫外可視吸光光度法、ラマン分光法、表面増強ラマン分光法（SERS）、XPS、炎原子吸光光度法（FAAS）、誘導結合プラズマ発光分光分析法（ICP-OES）、ICP-質量分析法（ICP-MS）、走査型プローブ顕微鏡（SPM）
表面機能化	フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)、ラマン分光法、X線光電子分光法(XPS)、熱重量分析(TGA)、核磁気共鳴法(NMR)、X線回折分光法(XRD)
溶解度と表面電荷	溶解度試験、ゼータ電位測定、電気泳動移動度、接触角測定、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、原子間力顕微鏡(AFM)、走査型イオン伝導度顕微鏡(SICM)

通常、UV-Vis吸収分光光度法、TEM、および/またはDLSによって分析されるAgNPsの最初の特性の2つは、サイズ分布（通常1-100 nm）と凝集状態である。これらのPCCは、AgNPがバクテリアに浸透したり相互作用したりする能力に影響を与える可能性がある[64,138]。小さいAgNPは、表面積が大きく、表面対体積比が大きい（すなわち、ナノ表面に存在する原子の数が多いため化学反応性が高い）ため、大きいAgNPよりも毒性が高くなる可能性がある[139]。これらのPCCは通常、ブルナウアー・エメット・テラー測定によって決定される（表4）。AgNPの化学組成と純度は、AgNPの品質を確認し、バッチ間の再現性を確保するために、分光学的および顕微鏡的技術（例えば、ラマン、ICP-OES、SPM）によって確立される。ひいては、AgNPの抗菌活性を高めているPCCを特定するのに役立つ。ゼータ電位によって確立された表面電荷は、静電反発によってAgNPsをコロイド中に浮遊させることで、ナノ安定性に影響を与える[136]。SEMとTEMは、AgNPが立方体、球体、小板状、リング状など多くの形状を持ち、それぞれが生物学的マトリックス内で異なる挙動を示すことを示している[140]。本総説やAgNPsに関するほとんどの抗菌研究の対象である球状AgNPsは、最も高い抗菌効果を示し、かなりの量の抗菌Ag+ イオンを放出することができる。この形状に関連した傾向では、球状のAgNPsに続いて円盤状のAgNPs、そして三角板状のAgNPsが続く[141]。AgNPへの化合物の共有結合または非共有結合は、そのPCC特性や関連する抗菌メカニズムに変化をもたらすため、表面官能基化も重要である[142,143]。抗生物質または非抗生物質（例えば、他の抗菌剤、ラマンリポーター、蛍光タグ）によるAgNPの機能化は、2つの成分間の関連性を検証するためにさらに重要である（図8）[144]。抗菌剤によるAgNPsの官能基化プロセスはまだ初期段階にあるが、AgNPsと抗菌剤の間に中間リガンドを用いた最近の研究（例． 142,143,145,146）は有望な結果を示している。ナノ表面におけるこれらの構築物の直接的または間接的結合と結合形状を確認する特性評価技術には、FT-IR、ラマン分光法、SERS、XPS、NMRが含まれるが、これらに限定されない（表4）。AgNPsを官能基化することで、ラマンリポーターや蛍光タグで検出能力を高めたり、ターゲティング能力を高めることで毒性を軽減したりすることもできる。例えば、ピリミジンベースの蛍光プローブで機能化したグルコース安定化銀ナノ粒子（Glu-AgNPs）は、水、土壌、牛乳、サトウキビ糖、オレンジジュース中の緑膿菌 を検出する優れた能力を示している[緑膿菌 > [146]。細胞表面レセプターに特異的な抗体、アプタマー、ペプチド、または多糖類がNPに結合し、特定の標的細胞にNPカーゴを送達するために使用される[132]。例えば、ゲル化コーティングを用いて抗菌ペプチドやタンパク質で機能化されたAgNPは、機能化されていないAgNPと比較して、MICが4倍以上減少した[145]。

図8 銀ナノ粒子(AgNPs)の抗菌活性、送達の特異性、イメージング能力を強化するためのナノ表面への機能性薬剤の潜在的な直接的および間接的な（リガンドを介した）結合[136、142,143,145,146,147,148].

全体として、AgNPのPCC特性は相互に関連しており、抗菌剤としての有効性を評価するには、PCCの異なる特性評価技術の使用が不可欠である。

5. AgNPsの抗菌メカニズム

ほぼ全てのタイプのAgNPsとAg+ イオンによる細胞膜とDNAの重大な損傷を、細菌モデル[149,150,151]の両方で報告している多くの研究がある。例としては、 P. aeruginosa [151], K. pneumoniae [152], V. vulnificus [86], A. baumannii [153], E. coli [151]、および Enterobacter 種などのGPB、および E. faecium [154], S. aureus [155], S. pneumoniae [156]、および B.brevis [157]が挙げられる。以下に示すように、人工AgNPsの抗菌メカニズムは多面的で複雑に絡み合っている。これは、GNBとGPBの異なる細胞構造と、AgNPのPCC特性（例えば、サイズ、凝集、表面電荷、表面積、表面対体積比）の両方に支配されているからである［155］。

5.1. 細胞膜の損傷

AgNPsとバクテリアの間の最初の、そしてしばしば最も重要視される相互作用は、細胞膜とこの特殊な構造の外側にある成分を含む（図9）。これらの相互作用は、膜の直接接触、脱分極、透過性の変化、浸透圧の崩壊、K+ ；イオンや他の細胞内内容物の漏出、細胞呼吸の停止 [151,155,158]などが起こる。その結果、膜の損傷は、AgNPや、以前は半透膜を通過できなかったか、半透膜から排出された抗生物質のような細胞毒性を持つ細胞外化合物のさらなる侵入を促進する可能性がある[64]。

図9 膜および細胞内レベルにおけるAgNPの抗菌メカニズム。いくつかのオブジェクトは、説明のためにスケールアウトしている可能性がある[159]。

GNB-AgNPs: GNB細胞の細胞壁は、外膜、薄いペプチドグリカン層、ペリプラズム空間、細胞膜の4層で構成されている[160]。

外膜 にはタンパク質、脂質、LPS（リポ多糖）があり、AgNPとAg+ イオンは最初に細菌と相互作用する[161]。例えば、GNBのLPSの負電荷は、大きな多糖成分により正電荷を持つAgNPと強く引き合う[91,150]。GNBもGPBも外表面は全体的に負電荷を帯びている。GPB細胞外皮のカルボキシル誘導体とリン酸基のペプチドグリカン成分がこの電荷を担っている[162]。プラスに帯電したAgNPs（例えば、エチレンイミンで合成された(NH2)-官能基化AgNPs）は、マイナスに帯電した対応物（例えば、クエン酸塩キャップAgNPs）よりも細菌細胞表面に対して高い吸引力を示すことが見出された[163]。一般的に、中性および負に帯電したAgNPは抗菌効果の低下を示しており、負に帯電したAgNPは最も効果が低い[162,164]。とはいえ、負に帯電したAgNPsはこの静電バリアを克服し、抗菌効果を発揮することができる。これは、AgNPの周囲にタンパク質のコロナが形成されるか、周囲の条件の変化によってAgNPの電荷が逆転することに関係している[165,166,167,168]。例えば、pHを酸性に下げるとAgNPの電荷はマイナスからプラスに変化した[165]。この現象は、一般的に酸性である創傷感染部位へのAgNP治療薬の特異的ターゲティングを可能にする可能性がある。サイズ、表面電荷、疎水性などのAgNPのPCC特性は、生物学的マトリックス内でAgNPの周囲に形成されるタンパク質コロナのタイプを決定することが報告されている[169]。一旦形成されると、タンパク質コロナはAgNPの安定性を向上させ、細胞への取り込みを促進し、一般的に凝集を防ぐ[170,171]。より大きなAgNPクラスター（≥100 nm）に凝集しやすい大きなAgNPや不安定なAgNPは、抗菌効果の低下を示すことがある[64]。このことは、5 nmと100 nmのクエン酸キャップAgNPのMIC値を対比させることで実証されている。coli 株（それぞれ20および110μg mL-1）[64,172]。電荷と同様に、AgNPsのサイズはGNBとGPBの両方における抗菌活性に大きく影響することが知られている。一般的に、より大きなAgNPsと比較して、より小さなサイズ（直径10nm以下）のAgNPsは抗菌活性が向上することが認められている[61,172]。これは、細菌細胞との直接接触に利用可能なナノ表面積がより大きいことと、より小さなAgNPsでは膜透過性が増大することに起因している[61,64]。全体として、AgNPによって引き起こされた膜の構造的な損傷や変化は、他の層がAgとのさらなる相互作用を受けるための入り口を提供する。これらの相互作用の深刻さは、膜層の深さや組成、PCC特性に依存する[159]。

ペプチドグリカン層 は細胞エンベロープの2番目の構成要素だが、GNBではわずかな割合（すなわち5-10%）しか占めていない[76,173]。In E. coli, 最も広く使われているGNBモデルでは、糖鎖はN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)と ；N-アセチルムラミン酸(MurNAc)残基はβ-1→4結合[174]によって連結されている。この構造には多くのカルボキシル基があり、ペプチドグリカンに負の電荷を与えている[159]。この電荷の対立は、AgNPs+ ；やAg+が細胞膜に付着し、重要な分子の細胞内輸送、膜電位、浸透圧平衡 [159,175]を乱す。AgNPは外膜にしか付着しない可能性もあるが、AgNPが膜を貫通すると、重要な細胞内プロセスが改変される（例えば、ATP産生、DNA複製、遺伝子発現）[159,176]。

ペリプラズム空間 は、内膜とペプチドグリカン層を隔てるものである。ペリプラスム腔の機能には、細胞分裂の制御、細胞質にある毒性を持つ酵素の隔離、シグナル伝達、タンパク質の折り畳み、タンパク質の酸化、タンパク質の輸送などがある[177]。ペリプラスムには、チオール酸化の触媒作用とジスルフィドの還元という2つのメカニズムが存在する。これらの経路は、酸化後に電子を分散させるか、細胞質から還元力を移動させる[178]。チオレドキシン系とグルタレドキシン系は、細菌において、細胞質タンパク質中のジスルフィド結合を還元状態で維持するために不可欠な役割を果たしている。AgNPs（正または負に帯電）とAg+ ；ペリプラズムを貫通するイオンは、これらの電子リッチ基（特にシス）に対して非常に高い親和性を持つため、これらの酵素や経路を妨害することができる[151,178,179]。

内膜 は、GNBにおいて細胞質と細胞内部分を環境から最終的に分離する。これはグリセロリン脂質からなる対称的な二重膜によって表される[177]。研究によると、外膜にダメージを与えることなく内膜に影響を与えることができる。内膜はイオンに富んでいるので、これらの物質の漏出は膜分解活性を追跡するために利用されてきた[180]。 大腸菌 と緑膿菌では、AgNPsとの相互作用で内膜の脱分極が見られた[41]。さらに、Na+ K+ K+ ；浸透圧平衡と膜電位の維持に役立つATPアーゼポンプは、内膜から漏れることが示されている[151,175]。

GPB-AgNPs: GNBと同様に、GPBの細胞膜も全体的に負電荷を示す[162]。GNBとは対照的に、GPBモデルは細胞壁の約90％を占める20～80nmの非常に厚いペプチドグリカン層を持っている[76,173]。したがって、AgNPやAg+ イオンを含むほとんどの物質は、GPBのペプチドグリカン層を通過するのがより困難であるか、細胞壁の表面に付着する可能性がある[159,181]。しかし、AgNPとペプチドグリカン層との接触は、活性酸素種（ROS）の放出と、それに続く糖鎖骨格や他の成分（リポテイコ酸など）の分解と関連していた[182]。さらに、正電荷を帯びたAgNPの付着は、より大きく負電荷を帯びたペプチドグリカンによって増強されることがわかった[159]。したがって、正電荷を帯びたAgNPは負電荷を帯びたAgNPよりもGPBを殺すのに効率的であると報告された[162]。これは、GNB [162]と比較してGPBの感受性が低いにもかかわらずである。

5.2. 細胞のDNA損傷

GNBとGPBモデル： DNA損傷は、その構造の完全性に影響を与える複数のメカニズムを通して起こりうる（図9）[183]。細胞膜と同様に、DNAはどちらの細菌モデルでも負に帯電している。これは各ヌクレオチドに負のリン酸基（PO43-）を含む糖-リン酸骨格によるところが大きい [184]。この結果、ペプチドグリカン層でも観察されたような静電引力[159]が生じる。これらのAgNP-DNA相互作用（図9）は、DNA変性、DNA切断、DNA修復遺伝子の突然変異（mutY、mutS、mutM、mutT）、およびnth)、細胞分裂の妨害[185]がある。Ag+ イオンは、塩基対間に介在する水素結合を歪めることによってDNAの二重らせん構造を破壊する[186]。DNA損傷のもう一つの要因は活性酸素の存在である。AgNPsとAg+ ions は細菌細胞内の異物であるため、宿主誘発性の活性酸素発生は細胞を酸化ストレス下に置き、アポトーシスに導く[187]。人工AgNPsの研究では、より小さなAgNPsはより高い抗菌効果を持ち、より速い活性酸素生成（例えば、直径1 nmのAgNPsでは5分、直径70 nmのAgNPsでは60分）が報告されている[188]。好気的条件下では、より小さなAgNPは、バルクのAgと比較して、Ag+ ion releaseの増加と相関している[162]。これはおそらく、より小さなAgNPsに特徴的な、より大きな表面対体積比によるもので、バクテリアとの相互作用とそれに続くAg+ release [140]のためのより大きな表面フットプリントを提供する。例えば、直径30 nm以上のAgNPは、直径10 nmのAgNPが表面に原子の35-40%を持つのとは対照的に、表面に原子の15-20%を持つ[189]。全体的に、AgNPsとAg+  イオンへの曝露に関連する酸素ラジカルは、アミノ酸への酸化的損傷を通じて病原体を殺し、DNAの変性をもたらす[190]。

5.3. 副次的細胞損傷

GNBおよびGPBモデル： 活性酸素は、オートファジー、好中球細胞外トラップ形成、パターン認識受容体（PRR）の誘発を含む他のメカニズム（図9）を活性化する[190]。活性酸素ラジカルによるアミノ酸の酸化は、結果としてタンパク質の構造を変化させ、その機能を危険にさらす。これらの変化は、タンパク質の構造、溶解度、コンフォメーション、タンパク質分解に対する脆弱性、酵素活性を変化させる可能性がある[191]。したがって、細菌の酵素やリボソームは、様々なタンパク質から構成されているため、変化や変性の影響を受けやすい。細菌のリボソーム（70S）はリボソームRNAとタンパク質からできており、70Sユニットは50Sユニットと30Sユニットが結合したものである[192]。Ag+ イオンは、より小さな30Sリボソームユニットに結合し、複合体を停止させることでタンパク質合成を終了させることが知られている[192]。AgNPsとAg+  リボソームや遺伝子発現との相互作用から生じる未熟な前駆体タンパク質の蓄積は、細胞死につながる可能性がある[158]。

6. バクテリアに対する抗生物質

すべての生物がそうであるように、細菌はその存在と増殖に適した空間、栄養素、環境を求めて競争する。抗生物質の生産は、細菌を含む微生物が、その環境に存在する他の微生物の競合を抑制したり殺したりするために用いる自然なメカニズムである[193]。抗生物質は一般に、細菌の細胞増殖や必須分子プロセスをどのように阻害するかによって分類される（図10）[194]。

細胞壁合成の阻害： 現在使用されている世界的に生産されている抗生物質の大部分は、細菌の細胞壁を標的として破壊するものである。GPBもGNBも、細胞壁構造の構成要素としてペプチドグリカンの層を含んでいる［195］。各ペプチドグリカン層は、トランスペプチド化と呼ばれるプロセスによって、次のエンベロープ層に架橋される[195]。細菌の増殖中、トランスペプチダーゼはこの架橋を触媒し、比較的強く安定した壁構造をもたらす [196,197]。β-ラクタムクラスの抗生物質（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、およびそれらの誘導体）は、分子構造の一部としてβ-ラクタム環という特徴を共有しているため、そのように名付けられた［196］。β-ラクタム系抗生物質は、新しい細胞壁合成の際に細菌のトランスペプチダーゼに結合して不活性化し、細胞壁全体の損失を引き起こす [198,199]。非β-ラクタム系抗生物質であるバンコマイシンも細胞壁構造を破壊する。バンコマイシンは、ペンタペプチドグリカン前駆体分子の合成を阻害することによって細菌の細胞壁を標的とする糖ペプチド抗生物質のグループに属する［200］。幅広いスペクトルのシクロペプチド抗生物質であるバシトラシンは、細胞膜を通過するペプチドグリカン前駆体のトランスロケーションを妨害するため、成長中の細胞壁の構造に到達することも、それに付加することもできない [201,202,203]。これらすべての場合において、壁が弱くなると細胞死が起こる[196]。

図10

天然由来の抗生物質の細菌増殖標的 [204]。いくつかのオブジェクトは、説明のためにスケールアウトしているかもしれない。

細胞膜の破壊：抗生物質の2つの主要なグループは細菌の細胞膜を破壊することができる。ポリミキシン（ポリミキシンBとE）はGNBの外側のLPS膜表面に結合する[205]。その結果、膜全体のイオンバランスが崩れ、膜は多孔質になり、最終的には崩壊する[205]。このため、抗生物質がさらに侵入しやすくなり、細胞質内膜にも同様の損傷が起こる［205］。ダプトマイシンなどの環状リポペプチド抗生物質は、GPBの細胞質膜を破壊する。ダプトマイシンが結合すると、膜の脱分極が起こり、多孔質の「リーキー」バリアが生じる[206]。これらのシナリオのいずれにおいても膜の損傷は修復不可能であるため、細菌細胞は死滅する。

タンパク質合成の阻害：アミノグリコシド（ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、およびそれらの誘導体）は、細菌のリボソーム機能を阻害することによってタンパク質合成を阻害する[207]。具体的には、アミノグリコシドは細菌の30S（小）リボソームサブユニットに結合し、翻訳中のブロックやミスリードを引き起こす[207]。テトラサイクリンやドキシサイクリンのようなテトラサイクリン系抗生物質群もまた、30Sサブユニットを介して作用し、tRNA転位活性、および/またはポリペプチド鎖伸長過程を阻害する[204,208]。マクロライド（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）、リンコサミド（リンコマイシン）、ストレプトガミンBは抗生物質のMLSBグループと総称される[209]。分子構造や起源は異なるが、すべてのMLSBは細菌の50S（大）リボソームサブユニットと相互作用し、特異的に、転座過程にあるtRNAをリボソームから早期に脱落させる[209]。最終的には、タンパク質合成の低下が起こり、成長中の細菌細胞にとっては致命的となりうる[204]。

核酸の合成と機能の阻害： 細菌はII型トポイソメラーゼと総称される一群の酵素を使い、DNAをスーパーコイル化し、細胞空間内で効果的にコンパクト化する[210]。これらの酵素はまた、複製装置の上流でスーパーコイルを除去することにより、DNA複製の際にも重要な役割を果たす。DNA合成が完了すると、新しい細菌染色体は元の染色体から分離され、新しい娘細胞に向けられる。スーパーコイリングプロセスの制御に不可欠なトポイソメラーゼはDNAジャイレース（トポイソメラーゼII）であり、トポイソメラーゼIVはDNA複製の最後に必要な酵素で、その役割は新しく合成されたDNAを元のDNAから連結解除することだからである［210 ］。キノロン系抗生物質（シプロフロキサシンなど）は、GNBではDNAジャイレース機能を阻害することにより、GPBではトポイソメラーゼIVを標的とすることにより、これらのプロセスを破壊する［210 ］。DNAの巻き戻し、スーパーコイル、複製に不可欠なプロセスが減衰すると、最終的に細胞は死滅する［210］。

RNA合成は抗生物質の作用によっても阻害される。リファマイシン（リファマイシンB、SV、および誘導体）はすべて、DNA依存性RNAポリメラーゼ酵素（RNAP）を標的とする特徴的な大環状環構造を持つ［211］。RNAPのβサブユニットへのリファマイシンの結合は、DNAからRNAへの転写を停止させ、その結果、タンパク質の生産が著しく減少し、細胞死に至る［211］。

代謝経路の破壊： 天然由来の抗生物質に加えて、多くの合成抗生物質が細菌の増殖を制限（静菌性）または破壊（殺菌性）するために開発されてきた。スルホンアミドやトリメトプリムのように、細菌の代謝に関わる経路を遮断する成長因子アナログもある[212,213]。スルホンアミドはパラアミノ安息香酸（PABA）の構造類似体であり、細菌細胞が葉酸を合成するのに必要な重要な基質である［214 ］。葉酸自体は、細胞が核酸を作るのに使われる重要なビタミンである。通常、PABAは酵素（ジヒドロプテロ酸合成酵素）と複合体を形成し、この酵素がPABAを葉酸の前駆体であるジヒドロプテロ酸に変換する［214,215］。スルホンアミドはPABAの類似体であるため、この重要な酵素にも結合し、PABAと効果的に競合し、ジヒドロプテリン酸の酵素産生を阻害する［214,215］。トリメトプリムは、この経路の後続酵素（ジヒドロ葉酸還元酵素）の構造類似体である。トリメトプリムは、この二次酵素へのジヒドロ葉酸の結合を凌駕するため、その活性を阻害し、葉酸合成に必要な追加代謝産物の産生を制限する［214,215］。スルホンアミドとトリメトプリムの相乗効果により葉酸レベルが低下し、核酸合成と細菌細胞の増殖が阻害される[214,215]。

7. 抗生物質耐性のメカニズム

当然のことながら、抗生物質の作用は、微生物の防御活動によって対抗される[216]。これらの防御機構は原核生物の起源と同じくらい古く、過去35億年の間、抗生物質の有効性と着実に共進化してきた。しかし、人類による抗生物質の発見と使用以来、抗菌薬耐性の急速な進化は憂慮すべき世界的な関心事となっている[217]。これは特に臨床や農業の分野で問題となっており、MDR病原微生物の出現は、それらを効果的に制御する私たちの能力を凌駕している[218,219]。

細菌が使用する耐性機構は、その遺伝物質にコードされているか（内在性耐性）、自然発生的な染色体突然変異現象や水平遺伝子転移（HGT）によって同化される（獲得耐性）[図11] [216]。競争的な環境では、これらの遺伝子の発現は細菌細胞の生存に不可欠である。遺伝子は、隣接する細胞（または自分自身）の抗生物質の修飾や化学的分解を触媒する酵素、毒性化合物を細胞外に排出する排出ポンプ、代替または改変された抗生物質標的の合成、および／または抗生物質の作用を回避する代謝経路の使用をコードしているかもしれない[216,217]。これらの遺伝子はすべて、細菌細胞が分裂し成長する際に、コミュニティの遺伝子プールに残る[220]。

図11 細菌における抗生物質耐性のメカニズム [218,220,221]. いくつかのオブジェクトは、説明のために縮尺がずれている可能性がある。

酵素による不活性化： 細菌細胞によって使用される最もよく記述された防御機構は、その分子構造の改変または破壊によって抗生物質を不活性化する酵素の産生である[216,218]。例えば、β-ラクタマーゼ酵素（細菌の遺伝子 blaによってコードされる）は、β-ラクタム抗生物質のβ-ラクタム環を加水分解（切断）する[221]。この酵素群の進化は、β-ラクタム系抗生物質とその誘導体の使用とともに急速に進み、2000種類以上のユニークなβ-ラクタマーゼが報告されている[222,223]。アミノグリコシドクラスの抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン）をアデニル化、アセチル化、および／またはリン酸化する酵素の細菌合成は、その活性が阻害されるように効果的に薬剤の分子構造を変更し、細菌は増殖を続ける［207］。特徴的なラクトン環構造を持つマクロライド（例えば、エリスロマイシンやアジスロマイシン）は、細菌が産生する加水分解酵素（エステラーゼ）によって分解されるか、リン酸化現象によって修飾される[224]。現在懸念されているのは、分子構造を分解し、最新の次世代合成テトラサイクリン、リファマイシン、およびそれらの修飾誘導体を不活性化できる破壊的酵素群の出現である[208]。

排出ポンプ： 抗生物質を含む毒素を細菌細胞の外に排出する排出ポンプのいくつかのファミリーがある。全てのポンプは細胞質膜に存在するが、エネルギー源（プロトン原動力／ATP）、基質特異性、および／または構造が異なる[225]。抗生物質耐性に関して、最も多く報告されている6種類の排出ポンプには、主要促進因子スーパーファミリー、小MDR耐性ファミリー、プロテオバクテリア抗菌性化合物排出ファミリー、多剤および毒性化合物押出ファミリー、ATP結合カセットスーパーファミリー、および耐性結節分割ファミリー（RND）が含まれる[225,226]。多くの環境細菌株は膜に複数のタイプの排出ポンプを持ち、ポンプ自体が様々な抗生物質を細胞外に輸送することができるかもしれない[225,226]。病原性細菌はまた、排出ポンプを過剰発現しているだけでなく、数種類の排出ポンプを持っていることもある[227]。この組み合わせにより、細胞内部から有毒な薬剤を効率的かつ迅速に排出することができる。重要なことは、排出ポンプ能力をアップレギュレートする細菌には、MDR ESKAPE病原体（E. faecium、 S. aureus、 K.pneumoniae、 A. baumannii、 P. aeruginosa、 Enterobacter species) [228]がある。このグループの例には、 P. aeruginosa および A. baumanniiの両者とも、キノロン、アミノグリコシド、β-ラクタム抗生物質クラスの薬剤を除去するRND型排出システムに関連する遺伝子を過剰発現している[228]。確かに、細菌群による排出ポンプの使用は、細胞質内での抗生物質の持続性に対抗する強固なメカニズムである[216,217,227]。

標的の変更： 抗生物質は、成長する細菌細胞内の重要なタンパク質、酵素、代謝経路の広いスペクトルを標的とする[229]。同時に、自然突然変異の結果、これらの細胞標的が有利に改変され、抗生物質が効かなくなることもある[229]。代替あるいは改変された抗生物質標的をコードする遺伝子もまた、HGTによって獲得される。例えば、メチシリン耐性株のS. aureus (MRSA)は遺伝子 ；メチシリンに対する親和性の低いトランスペプチダーゼをコードするmecAは、近縁の祖先からHGTを介して受け継いだと推定されており[230]、一方、S. pneumoniae はトランスペプチダーゼ（細胞壁合成に関与）の構造変化をもたらし、β-ラクタム抗生物質結合に対する耐性をもたらす[231]。Emerging 結核菌 ；(結核菌)耐性株は、DNA依存性RNAポリメラーゼ酵素(RNAP)に変異があり、抗生物質であるリファンピシンによる触媒阻害に対して脆弱でなくなるように構造が変化している[232]。

抗生物質の取り込みと代謝迂回を制限する： ポリンはGNBの外側のLPS膜に埋め込まれたチャネルであり、膜の透過性に重要な役割を果たしている[233]。抗生物質のような毒素の移行は、機能しているポリンの数の変化、および／またはチャネル径が減少した代替ポリンの使用の両方によって調節することができ、細胞内への薬剤の侵入を効果的にブロックする[233]。細菌の栄養変異体（auxotrophs）は、生存に必要な特定の代謝物を合成する代謝能力を欠いている[234,235]。代謝物が周囲の微小環境に存在すれば、従属栄養生物は生き残ることができる［234,235］。このため、葉酸の合成に関与する酵素を標的とする抗生物質は、葉酸オーソトローフに対しては効果がない。なぜなら、葉酸オーソトローフは抗生物質が標的とする合成酵素を欠いているからである［234,235］。

水平遺伝子転移(HGT): 重要なことは、古典的な垂直転移は細胞の遺伝子コレクションの範囲を制限しないということである[236,237]。原核生物の世界では、細胞の抗生物質耐性遺伝子への主なインプットは、周囲の微生物から獲得することである（獲得耐性）[237]。このHGTは広く浸透しており、自然界で外因性DNAが3つの主なメカニズム、すなわち形質転換、抱合、トランスダクションを介して取り込まれるときに起こる[216,217,237]。簡単に説明すると、形質転換は、一般的に溶解した細胞によって、環境中に放出される遺伝物質の取り込みを記述する[237]。相同組換えがレシピエントのDNAとうまく起これば、この”遊離した “ドナーの遺伝物質が生細胞のゲノムに入り込み、その一部となる可能性がある[237]。抗生物質耐性を付与する遺伝子は、必ずしも染色体の一部とは限らず、原核細胞に共通する小さな染色体外遺伝物質であるプラスミド上に存在することが多い[237]。遺伝子の多くは、”R”（耐性）プラスミドにコードされている。結合の際、供与体と受容体の細菌細胞の間に物理的な結合が生じる。この接続により、抗生物質耐性や病原性などの特性を含むプラスミド（あるいは染色体全体）の同期コピーと移入が容易になる［219 ］。遺伝子エレメントはまた、バクテリオファージ（細菌ウイルス）を介して細菌の細胞質に不注意に注入されることもある-トランスダクションと呼ばれるプロセスである[216,217,237]。ウイルス粒子の複製中に、宿主のゲノムの断片が誤ってウイルスカプシドに組み入れられることがある[238]。このウイルスは宿主細胞（ドナー）を離れ、別の細菌宿主（レシピエント）を攻撃する。ウイルス自身のゲノムの代わりに、前の細菌宿主から遺伝物質を注入する[238]。入ってくる核酸は新しい宿主と相同性を共有し、相同組換えが起こるかもしれない[238]。レシピエント細胞はファージ（形質導入粒子）を介してさらに遺伝子を獲得した。抗生物質の過剰使用によって引き起こされる選択圧は、遺伝子プール内の可動要素に存在する耐性遺伝子の数の増加をもたらした。このように、HGTは抗生物質耐性菌の出現における主要なドライバーである[236]。

バイオフィルムとパーシスター細胞： バイオフィルムは自然界に普遍的に存在し、微生物によって排泄された細胞外高分子物質（EPS）のマトリックスから構成されている［239,240］。バイオフィルムは、微生物のコミュニティを包含し、ニッチを確立するために、生物的、非生物的問わず、あらゆる表面に形成される［239,240］。マトリックス自体が抗生物質の拡散を制限することが多く、バイオフィルム産生能を持つ病原体による感染症を治療する際に大きな問題となる（図12）[239]。問題をさらに複雑にしているのは、バイオフィルム内の生菌がしばしば排出ポンプの産生をアップレギュレートし、マトリックスに侵入できる抗生物質を破壊するEPS中への酵素の分泌を増やしていることである[239,240]。また、バイオフィルムにはパーシスター細胞も存在することがある。これらの細胞は休眠状態であるため、ほとんどの抗生物質に対して耐性があり、増殖も代謝もしていない [239,240]。これらの難分解性細胞は、細菌感染に対する抗生物質治療終了後の再発の原因であると提唱されている［232］。一旦停止すると、パーシスター細胞は休眠から覚め、複製する。バイオフィルムは再増殖し、感染が再発する[239,240,241]。

図12 微生物のバイオフィルム形成は抗生物質の拡散を制限する可能性がある（点線は軌道の可能な限界を示す）。いくつかのオブジェクトは、説明のためにスケールアウトしている可能性がある。

8. 抗生物質耐性菌に対するAgNP-抗生物質複合体の相乗効果8.

相乗効果とは、2つ以上の化合物を組み合わせることで、個々の化合物が単独で発揮できる以上の効力を持つ反応をもたらす現象と定義される[242]。現在、抗生物質耐性および非耐性の病原体の拡散や増殖を防ぐために、抗生物質で機能化されたコアAgNP（AgNP-抗生物質コンジュゲートと呼ばれる）の相乗効果を利用することに多大な努力が払われている[243,244,245]。このセクションでは、細菌の増殖に対するAgNP-抗生物質結合体の相乗効果の製造、特性評価、評価において遭遇した進歩や課題を要約することに焦点を当てる。この文脈の中で、使用されるAgNP-抗生物質コンジュゲートの種類とそのPCC特性に関して、抗生物質耐性菌と非耐性菌の両方について例示的な例を示す。

抗生物質をAgNPに結合させる戦略： コアAgNPは、化学試薬（例えば、クエン酸塩または水素化ホウ素ナトリウム）または生物学的試薬（例えば、細菌、真菌、または植物抽出物）による銀塩からのAg+ の還元によって化学的に製造される。(i)AgNP合成後の抗生物質のコンジュゲーション、または(ii)AgNP合成中の抗生物質のコンジュゲーション。どちらの方法も、抗生物質を還元剤、官能基化剤、あるいはその両方として用いることができる[244]。これらの戦略のそれぞれは、非耐性および抗生物質耐性の病原体[244]の両方に対して相乗効果を持つ豊富なAgNP-抗生物質結合体を生成することが報告されている。例えば、PVPでキャップされたAgNP-ゲンタマイシン結合体は、 Sに対する強力な抗菌剤であることが示された。 aureus、 大腸菌、およびゲンタマイシン耐性 大腸菌 [246]に対する強力な抗菌剤であることが示された。中性のアミノグリコシドであるゲンタマイシンは、AgNPの負電荷を低下させ、それによって膜-AgNP相互作用を促進し、膜付着部位でのAg+ イオンの放出を促進する。さらに、ゲンタマイシンと結合したシアノグラフェンAgナノハイブリッド（GCN/AG）のような複雑なナノ構造は、ゲンタマイシンの本来のMICを32倍低下させ、平均分画阻害濃度（FIC）は0.39であった[247]。セフタジジムと結合したGCN/Agは、大腸菌に対しても部分的な相乗効果を示した。いくつかの研究では、AgNPのサイズ、形状、表面電荷が相乗効果に及ぼす重要性を取り上げている。これらには、正電荷を帯びたAgNP（例えば、アミンでキャップされたAgNP）は、負電荷を帯びたAgNP（例えば、クエン酸でキャップされたAgNP）よりも細菌に対して強い抑制効果を持つという実証が含まれる、どちらのAgNPも同じナノコア（水素化ホウ素ナトリウム還元剤）を持ち、同じ抗生物質（例えば、バンコマイシン；Van-AgNP）と結合している[248,249]。報告された黄色ブドウ球菌に対するMIC値は5.7 fmol mL-1 for positively charged AgNPs (+50 mV), 4 nmol mL-1 for neutral AgNPs (0 mV), and 97 nmol mL-1 for negatively charged AgNPs (-38 mV)であった。還元剤としてアンピシリンを用いて合成されたAgNP-アンピシリン結合体は、アンピシリン（12-720 µg mL-1 ）またはAgNP単独（280-640 µg mL-1 ）と比較して、MIC値が有意に減少した（3-28 µg mL-1 ）。抗生物質耐性（大腸菌 および黄色ブドウ球菌）およびMDR（緑膿菌 およびK. pneumonia）の細菌株はアンピシリンに感受性であったが、15回の増殖サイクルの後でもAgNP-アンピシリン結合体に耐性を示さなかった［250］。

AgNP-抗生物質コンジュゲートの特性： 相乗効果を示すためには、2つの成分（AgNPと抗生物質）が化学的にコンジュゲートされていなければならない。AgNP-抗生物質相互作用（例えば、表面官能基化）および他のPCC特性は、典型的には、 表4に記載された技術と併せて、米国EPA基準に従って特性評価される。例えば、AgNP-バンコマイシン結合体のUV-Vis吸光光度分析では、抗生物質との結合時に、クエン酸塩でキャップされたAgNPの特徴的な局在表面プラズモン共鳴（SPR）ピーク（392nm）の一貫した赤色シフトが示された[251]。このAgNP-抗生物質結合体は、GPB（S. aureus) およびGNB(大腸菌) を用いて合成したクエン酸塩キャップAgNPのFT-IR測定では、Bacillus sp. SJ14 は、それぞれ1635cm-1 および3326cm-1に一級アミンの屈曲および伸縮運動に特徴的なピークを示した[252]。分光学的測定は、微生物由来のタンパク質に結合したときのAgNPの表面化学と安定性を特徴づけるのに役立った[252]。その後、これらのAgNPと抗生物質（シプロフロキサシン、メチシリン、ゲンタマイシン）の結合は、420nmの局所的なSPR吸収ピークのブロード化、マーカーアミン振動ピークの顕著なラマンシフト（例えば、1635cm252）によって確認された、1635cm-1 から1652cm-1へ）。[252]. すべてのAgNP-抗生物質結合体は相乗効果を示した。最も顕著なのは、メチシリンのMICが250μg mL-1 から7.8 μg mL<supデータ-dl-u>-1 MDRバイオフィルム形成性コアグラーゼ陰性に対してS. epidermidis. ラマン分光法は、AgNP-抗生物質のキレート化に伴うナノ表面化学の変化を特徴付けるために、IR分光法を補完するツールとして利用することができる。例えば、4種類の抗生物質のUV-Vis吸収スペクトルとラマンスペクトルである；β-ラクタム系（アンピシリンとペニシリン）、キノロン系（エノキサシン）、アミノグリコシド系（カナマイシンとネオマイシン）、ポリペプチド系（テトラサイクリン）の4種類の抗生物質のUV-Vis吸収とラマンスペクトルは、クエン酸塩でコーティングしたAgNPと複合化する前と後で、最小限のサンプル前処理で収集することができた[253]。クエン酸塩コーティングを抗生物質で置き換えた後、両方の分析法でAgNPと抗生物質の相互作用が確認された。すべてのAgNP-抗生物質結合体は、アンピシリンとペニシリン[253]を除いて、MDR サルモネラ Typhimurium DT 104に対して相乗的な増殖抑制を示した。具体的には、AgNPをアンピシリンとペニシリンとどの試験濃度でも組み合わせた場合、SERSの増強は観察されなかった（すなわち、これらの抗生物質に対するAgNP-抗生物質相互作用は最小からゼロ）[253]。対照的に、ナノ表面と複合化した他のすべての抗生物質では、明瞭なラマンマーカーバンドが観察された。例えば、カナマイシンは270cm-1 ；(Ag-O伸縮)、620 cm-1、および890 cm-1 (骨格変形とテトラヒドロピラン環の伸縮) [253]。AgNPs単独では、MDR サルモネラ菌 の細菌増殖を10％減少させた。さらに、テトラサイクリンは、AgNPs単独と比較して、AgNPsとサルモネラ菌 との結合を21%増強し、Ag+ の放出を26%増強した。このラマン研究によって、相乗的な抗菌効果と、AgNPと抗生物質との事前の結合の必要性との関係がさらに確認された。</emデータ-dl-u></supデータ-dl-u>

AgNP-抗生物質結合体の増殖阻害と相乗効果の定量化： 増殖阻害を研究するために、3つの基本的な手順が一般的に利用されている。増殖阻害を測定する最も古い方法の一つはKirby-Bauer（ディスク拡散）試験であり、少量のサンプル（10-20μL）を必要とし、特別な装置を必要とせず、迅速な対応が可能であるため、その人気を維持している[245,254]。これらのアッセイでは、6mmのフィルターディスクに抗菌剤を染み込ませ、108 CFU mL-1 の細菌をコートした寒天プレート上に置く。一晩の増殖後、ディスクの周囲に特徴的なハロー（直径mm）が生じる抗生物質濃度を阻止域とみなす（CLSIプロトコル）。これは使用する抗生物質や試験する細菌によって異なる。溶液ベースの増殖阻害アッセイでは、105 CFU mL-1 の細菌培養物を抗菌剤と混合し、20～24時間培養する[245]。その後、600nmの光学濃度（OD）をモニターすることにより、細胞増殖を評価する。未処理の細胞のOD値より～50％低いOD値に対応する抗生物質濃度がMICとみなされる。このタイプのアッセイ法も比較的短時間で終了するが、OD 600値が生存細胞数に対応することを確認するためにコロニー計数を補足する必要がある。コロニー計数に基づく増殖阻害アッセイは、おそらく3つの方法の中で最も労力がかかる。これは溶液ベースの増殖抑制で、105 CFU mL-1 の細胞を抗菌剤で2時間増殖させ、その後プレーティングする[245]。その後、24時間増殖させた後、生存可能なコロニーを数える。

相乗効果の共通基準を確立するために、FICはAgNP-抗生物質結合体のMICを抗生物質単独のMICで割ることで計算できる（式（1））。FIC値が0.5であれば相乗効果があると考えられる[243]。

FIC=MIC of ；AgNP-抗生物質 ；コンジュゲートMIC ；of ；　　(1)

耐性および非耐性細菌株に対する相乗効果の選択例： GPBとGNBの両方に対するAgNP-抗生物質コンジュゲートの効力を強調する広範な証拠がある[243,244,255,256]. 表5 は、AgNP合成に使用された方法（生物学的対化学的）、AgNPの特性（すなわち、そして相乗効果が実証された抗生物質と細菌のペアである。

MDR病原体に対する臨床応用の可能性を持つAgNP-抗生物質の相乗効果： 最近発表された画期的な研究では、A. baumannii を用いて生物起源AgNPを製造し、カルバペネマーゼ産生グラム陰性菌（CPGB）単独および様々な抗生物質と結合させた場合の抗菌効果を試験した[257]。この研究では、CPGBに対する強力な抗菌活性が認められ、MICは64～8μg mL-1の範囲であった。コンジュゲートの中で、AgNP-セフトリアキソンは、A.baumanniiに対してMICが250倍（1024μg mL-1 から4μg mL-1）低下し、最高の相乗効果を示した。カルバペネム系抗菌薬は “最後の砦 “と考えられているのに対し、β-ラクタム系抗菌薬は重症の細菌感染に対する治療の第一選択薬であることが多いため、この結果は重要である。したがって、カルバペネム耐性菌に対する新たな治療法の開発は必須である。 術後軟膏： 生物原性AgNPは、真菌の抽出物でAg+ Fusarium oxysporumを還元することにより製造された。 これらのAgNPの効力はワックスと天然オイルで強化され、カゼイリンパ節炎に感染したヤギの術後軟膏として使用された。 258]と比較して、治療を受けたヤギは早く治癒し、傷の感染も少なかった。 AgNPコーティングはバイオフィルム形成を防ぐ： 外科用インプラント上のバイオフィルム形成は、手術後の感染の主な原因である。チタンインプラント上にポリドーパミン、キトサン、ハイドロキシアパタイトでコーティングされたAgNPは、S. aureus, S.epidermidis, および大腸菌 [259]。

表5 銀ナノ粒子(AgNP)-抗生物質複合体は、報告された研究で相乗効果を示した。対応する参考文献を含む

作製方法と 還元剤	AgNPサイズと コーティング	相乗効果、細菌モデル、および評価方法
生物学的 Bacillus sp. [260]	14-42 nm 第一級および芳香族アミン	ZoI;フシジン酸、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ペニシリン、クロラムフェニコール、レボフロキサシン、ナリジクス酸、アンピシリンのすべての組み合わせに対するS. epidermidis, S. aureus, V. cholerae, S. aureus, Salmonella Typhi, および サルモネラ パラチフィ（Salmonella Paratyphi）。
化学物質 [261] Salmonella Paratyphi	10-30 nm ナノ銀コロイド	MRSAに対するアリシンのMIC
生物学的 Trichoderma viride Aspergillus flavus  [262,263].	5-40 nm	ZoI; アンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールに対する E. coli, S. Typhi, 黄色ブドウ球菌, ミクロコッカス・ルテウス, 緑膿菌, P. aeruginosa, E. faecalis, A. baumanii、 K. pneumoniae、 Bacillus spp.
生物学的 Phytophthora Infestans [264].	5-30 nm	ZoI、MIC、ムピロシン、ネオマイシン、バンコマイシンに対する S aureus; セファゾリン、ムピロシン、ゲンタマイシン、バンコマイシンに対する P. aeruginosa; and セファゾリン、ムピロシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリンに対する P. aeruginosa;  および大腸菌に対するセファゾリン、ムピロシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリン。
化学物質 マルトース [265]。	28 nmおよび8 nm	MIC；A.pleuropneumoniae、 P.multocida. A.pleuropneumoniaeに対するアモキシシリン、コリスチン、ゲンタマイシン。
biological ムキア マデラスパタナ [266].	N. A.	ZoI; biofilm microplate; cefriaxone with B. subtilis, K. pneumoniae, S. aureus、 S. Typhi、 Pseudomonas fluorescens などがある。
化学的 アスコルビン酸 [267].	20 nm	MIC; amoxicillin against E. coli.
生物学的 E. hermannii, C. sedlakii, and P. putida [268].	4-12 nm	ZoI；P. aeruginosa に対するゲンタマイシン、S. aureus およびMRSAに対するバンコマイシン。
化学的 固体銀[269].	N. A.	MIC、FIC、バイオフィルム、ヒドロキシラジカルアッセイ; E.faecium、 S.mutans、 E. coli with ampicillin; E. faecium and P. aeruginosa with chloramphenicol; S. aureus, S.mutans, 大腸菌 および緑膿菌 カナマイシンを含む。
生物学的 K. pneumoniae [270].	50 nm	ZoI; ペニシリンG、アモキシシリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、バンコマイシンに対する S. aureus およびE. coli。
生物学的 Dioscorea bulbifera [271].	8-20 nm	緑膿菌に対してはクロラムフェニコールとバンコマイシン、大腸菌に対してはストレプトマイシン。
化学薬品 クエン酸ナトリウム、ニンニク[272].	クエン酸塩コーティング	ZoI; S. Typhi, 大腸菌, 緑膿菌, M. luteus, S.aureus アモックスクラブを使用し、 S. Typhiはアンピシリンを使用する。
ケミカル [273].	3.0 nm	FI; E.faecium、アンピシリンおよびクロラムフェニコール; S.mutans、アンピシリンおよびカナマイシン; E. coli、アンピシリン、カナマイシン; 緑膿菌、クロラムフェニコール、カナマイシン
化学 NaBH4/citrate [274].	5.0-12.0 nm クエン酸塩コート	A. baumannii ポリミキシンBおよびリファンピシンを含む。
化学物質 NaBH4/maltose [265].	8.0 nm ゼラチンコート	FIC; A.pleuropneumoniae、ペニシリンG; 大腸菌、コリスチン; 黄色ブドウ球菌、ゲンタマイシン
化学物質 没食子酸 [275] (gallic acid)	8.6 nm 没食子酸コーティング	FIC;  E. faecium、 A. baumannii、 K. pneumoniae、Morganella morganii、 P. aeruginosa, ampicillin and amikacin; S. aureus, E. coli, and Enterobacter cloacae, amikacin (FIC)
化学薬品 NaBH4/citrate/hydrazine [276].	10 nm PVP-および クエン酸塩コート	ZoI; 黄色ブドウ球菌、セファレキシン
化学 NaBH4/citrate [277].	16 nm PVPコート	ZoI; 大腸菌、ストレプトマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン; 黄色ブドウ球菌、ストレプトマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン
化学物質 NaBH4/citrate [278].	19.3 nm SDSコート	ZoI; 大腸菌、ストレプトマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン; 黄色ブドウ球菌、ストレプトマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン
化学物質 アスコルビン酸 [279].	20.0 nm	MIC; 大腸菌, アモキシシリン
化学 NaBH4 [280].	20.0 nm PVPコート	ZoI；バンコマイシンとアミカシンのすべての組み合わせおよび S.aureus および 大腸菌。
化学物質 Tween 80 [281] (ツイーン80)	20.0-40.0 nm Tween 80コーティング	FIC; S.エピデルミディス およびゲンタマイシン
化学 クエン酸塩[246].	23.0 nm クエン酸塩コート	MICおよび阻害（プレートカウント）; S. Typhimurium、テトラサイクリン、ネオマイシン、ペニシリンG
化学物質 エチレングリコール [251].	25.0 nm PVPコート	FIC;  大腸菌 および 黄色ブドウ球菌、ゲンタマイシン
化学物質 マルトース [282].	26.0 nm ゼラチン	MIC;  大腸菌、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アズトレオナム、セファゾリン、セフォキシチン、セフロキシム、コトリモキサゾール、コリスチン、ゲンタマイシン、オフロキサシン、オキソリニック酸、テトラサイクリン;  緑膿菌、アミカシン、アズトレオナム、セフェピム、セフォペラゾン、P. aeruginosa, amikacin, aztreonam, cefepime, cefoperazone, ceftazidime, ciprofloxacin, colistin, gentamicin, meropenem, ofloxacin, piperacillin, and piperacillin/tazobactam; S. aureus、アンピシリン／スルバクタム、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、コトリモキサゾール、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、オキサシリン、ペニシリン、テイコプラニン、テトラサイクリン、およびバンコマイシン。
化学物質 NaBH4/maltose [265].	28.0 nm ゼラチン	アモキシシリン、ペニシリンG、ゲンタマイシン、コリスチン
化学物質 マルトース [283]。	28.0 nm マルトース	FIC; 大腸菌 およびK. pneumoniae with cefotaxime, ceftazidime, meropenem, ciprofloxacin, and gentamicin; synergism in all resistant strains except to K. pneumonia carbapenemase
化学物質 クエン酸塩[253].	29.8 nm クエン酸塩コート	アンピシリン、ペニシリン、エノキサシン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリン、および S. Typhimurium
化学物質 クエン酸塩[284]	29.8 nm クエン酸塩コート	阻害（プレートカウント）; S. Typhimurium、エノキサシン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリン
化学物質 NaBH4/citrate [271].	38.3 nm クエン酸塩コート	ZoI; 大腸菌、ストレプトマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン; 黄色ブドウ球菌、ストレプトマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン
化学物質 クエン酸塩 [251]	70.0 nm クエン酸塩コート	ZoI; vancomycinおよび S.aureus および 大腸菌。
生物学的 Streptomyces cali- diresistants IF17 strain [284].	5.0-20.0 nm 放線菌由来生体分子	FIC: 大腸菌、テトラサイクリン; 黄色ブドウ球菌、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン; 枯草菌、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン
生物学的 Klebsiella pneumoniae エキス [271].	5.0-32.0 nm バイオマスからのタンパク質	ZoI; 大腸菌、アモキシシリン、エリスロマイシン、ペニシリン、バンコマイシン; 黄色ブドウ球菌、アモキシシリン、エリスロマイシン、ペニシリン、バンコマイシン
生物学的 Streptomyces calidiresistants IF11 [284].	5.0-50.0 nm 還元株の生体分子	FIC; 枯草菌、カナマイシン
生物学的 放線菌 株 [277].	17.0 nm バイオマス由来のタンパク質	MICおよびZoI;  大腸菌、 肺炎桿菌、および 緑膿菌 アンピシリン。
生物学的 Klebsiella pneumoniae [285].	20.0 nm -（285)	E.faecalis、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン
生物学的 銀耐性河口 P. aeruginosa 株 [286].	35.0-60.0 nm 還元株の生体分子	ZoI; 耐性 S.aureus VN3株およびシプロフロキサシン耐性 V.コレラ VN1株とのアンピシリンおよびシプロフロキサシンのすべての組み合わせ。
生物学的 Trichoderma viride [287].	5.0-40.0 nm バイオマス由来タンパク質	ZoI; E.coli、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン; M.luteus、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン; S. Typhi, アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン; S.アウレウス, アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン
生物学的 Acinetobacter calcoaceticus  [288].	8.0-12.0 nm 還元株からの生体分子	ZoIまたはMIC; A. baumannii、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン；クレブシエラ (以前はエンテロバクターとして知られていた) ；aerogenes、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン; E. coli, amikacin, amoxicillin, ampicillin, ceftazidime, ceftriaxone, chloramphenicol, ciprofloxacin, doxycycline, gentamicin, kanamycin, penicillin, tetracycline, trimethoprim, and vancomycin; P. aeruginosa, amikacin, amoxicillin, ampicillin, ceftazidime, ceftriaxone, chloramphenicol, ciprofloxacin, doxycycline, gentamicin, kanamycin, penicillin, tetracycline, trimethoprim, and vancomycin; S. Typhimurium、アミカシン、アンピシリン、セフタジジム、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン; ；シゲラ・ソンネイ、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、セフタジジム、セフトリアキソン、シプロフロキサシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン; S. aureus、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、セフタジジム、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン; S. mutans、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、セフタジジム、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、カナマイシン、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム、およびバンコマイシン。
生物学的 Cryphonectria sp. [289].	30～70 nm	ZoI; S.aureus、 S. Typhi、および 大腸菌、ストレプトマイシン
生物学的 Emericella nidulans [290].	66.7 nm バイオマスからの生体分子	FIC; 大腸菌、アミカシン、ストレプトマイシン
生物学的 Aspergillus flavus [290].	81.1 nm バイオマスからの生体分子	FIC; 大腸菌、アミカシン、ストレプトマイシン; 黄色ブドウ球菌、カナマイシン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン
生物学的 Dioscorea bulbfera [272].	2.0 nm バイオマスからの生体分子	ZoI；大腸菌、 緑膿菌、 黄色ブドウ球菌におけるトレプトマイシン、リファンピシン、クロラムフェニコール、ノボビオシン、アンピシリンのすべての組み合わせ。
生物学的 Dioscorea bulbifera [291].	5.0-30.0 nm バイオマスからのタンパク質	ZoI; A.baumannii、アモキシシリン、アンピシリン、セフォタキシム、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、ペニシリン、ピペラシリン、リファンピシン、リメトプリム; B. subtilis, アンピシリン、セフォタキシム、クロラムフェニコール、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、ペニシリン、ピペラシリン、ストレプトマイシン、トリメトプリム、バンコマイシン; E. cloacae、アミカシン、アモキシシリン、エリスロマイシン、ナリジクス酸、ペニシリン; E. coli, amikacin, erythromycin, kanamycin, nalidixic acid, polymyxin, streptomycin, and trimethoprim; Haemophilus influenzae, cefotaxime, ceftriaxone, nitrofurantoin, and trimethoprim; K. pneumoniae、アモキシシリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、フェロペネム、ニトロフラントイン、ペニシリン、リファンピシン、トリメトプリム、バンコマイシン; ；ナイセリア粘膜、アミカシン、アンピシリン、エリスロマイシン、フェロペネム、ゲンタマイシン、ニトロフラントイン、ペニシリン、ポリミキシン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン； プロテウス・ミラビリス、エリスロマイシン、ナリジクス酸、バンコマイシン; P. eruginosa、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、フェロペネム、ゲンタマイシン、カナマイシン、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、ペニシリン、ストレプトマイシン、トリメトプリム、バンコマイシン; S.セラチア菌、セフタジドメ、エリスロマイシン、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、トリメトプリム、バンコマイシン; S. aureus、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、セフタジド、エリスロマイシン、カナマイシン、ナリジクス酸、ポリミキシン、ストレプトマイシン、トリメトプリム; ；腸炎ビブリオ、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、カナマイシン、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、ポリミキシン、トリメトプリム。
生物学的 Argyreia nervosa [292].	5.0-40.0 nm バイオマスからの生体分子	ZoI; S.aureus、アモキシシリン／クラビュラミン酸、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン; E. coli、アモキシシリン／クラヴラム酸、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン
生物学的 ガムコンダグ [293].	5.8 nm バイオマスからの生体分子	FIC; S.aureus、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシン; S. aureus、ストレプトマイシン; 大腸菌、ストレプトマイシン; 緑膿菌、ストレプトマイシン
生物学的 Rosa damascenes [294].	7.4-18.3 nm	ZoI; cefotaxime with 大腸菌 およびMRSA。
生物学的 Ulva fasciata [295].	15.0 nm	ZoI; E. coli, cefotaxime, cefuroxime, fosfomycin, chloramphenicol, azithromycin, and gentamicin; ；サルモネラ腸炎菌、アジスロマイシン、ゲンタマイシン、オキサシリン、セフォタキシム、ネオマイシン、アンピシリン／スルバクタム、セフロキシム、ホスホマイシン、クロラムフェニコール、オキシテトラサイクリン; S. aureus、アジスロマイシン、オキサシリン、セフォタキシム、ネオマイシン、アンピシリン／スルバクタム、セフロキシム、ホスホマイシン、クロラムフェニコール、オキシテトラサイクリン。
生物学的 Eurotium cristatum [296].	15.0-20.0 nm バイオマスからの生体分子	ZoI；バンコマイシン、オレアンドマイシン、セフタジジム、リファンピシン、ペニシリンG、ネオマイシン、セファゾリン、ノボビオシン、カルベニシリン、リンコマイシン、テトラサイクリン、およびエリスロマイシンのすべての組み合わせ、ならびに カンジダ・アルビカンス、P. aeruginosa、および大腸菌を含む。
生物学的 Urtica dioica Linn. [297].	20.0-30.0 nm バイオマスからの生体分子	ZoI; B.セレウス、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、セフェピム、アモキシシリン、セフォタキシム; S. epidermidis, ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、セフェピム、アモキシシリン; S. aureus、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、セフェピム、アモキシシリン、セフォタキシム; B. subtilis, ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、セフェピム、アモキシシリン、セフォタキシム; E. coli, ストレプトマイシン、アミカシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、セフェピム、アモキシシリン、セフォタキシム; S. Typhimurium, ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、セフェピム、アモキシシリン、セフォタキシム; K. pneumoniae, ストレプトマイシン, アミカシン, カナマイシン, バンコマイシン, テトラサイクリン, アンピシリン, セフェピム, アモキシシリン, セフォタキシム; Serratia marcescens, ストレプトマイシン, カナマイシン, テトラサイクリン, アンピシリン, アモキシシリン, セフォタキシム。
生物学的 Zea may  [298].	45.3 nm バイオマスから生体分子	ZoI; セレウス菌、大腸菌、 リステリア菌、サルモネラ菌 チフス菌、 黄色ブドウ球菌、カナマイシン、リファンピシン
市販の N． A. [299].	10.0-15.0 nm N． A.	光学濃度；アンピシリン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クリンダマイシンと A. baumannii.
商業 N． [300] A．	15.2 nm デンプン	FIC; バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei） メロペネムと硫酸ゲンタマイシンを含む。
市販品 N． A. [301] N．	35.0 nm PVP	FIC; 大腸菌、 サルモネラ菌 チフス菌、 黄色ブドウ球菌 カナマイシン

略語： NA-該当なし；FIC-分画阻害濃度；MIC-最小阻害濃度；およびZoI-阻害ゾーン。

AgNP-抗生物質結合体を用いた細菌性抗生物質耐性の克服： AgNP-抗生物質結合体は、細菌を攻撃するために多面的なアプローチを用いるため、細菌性抗生物質耐性の出現を促進する可能性は低い。対照的に、化学抗生物質は、タンパク質合成やDNA複製など、細菌細胞内の特定のプロセスを標的とするため、細菌はその作用に対抗しやすくなる。

図13 AgNP-抗生物質複合体の多面的な抗菌作用メカニズムの模式図： (a)AgNPは活性酸素の産生を通して抗生物質の侵入を可能にする細胞壁を不安定にする、(b)AgNPに付着した抗生物質は抗生物質破壊酵素の作用からカモフラージュされる、(c)排出ポンプはAgNPによってダウンレギュレートされるかブロックされる。一部のオブジェクトは、説明のためにスケールアウトしている可能性がある。

AgNP固有の抗菌特性は、様々な薬剤耐性メカニズムを克服することによって抗生物質の機能を促進する。

AgNPsは、細菌膜を不安定化させる活性酸素の産生を誘発し、抗生物質の侵入を可能にする： AgNPsは単独でMDR耐性菌に対する強力な武器となる。 Areca catechu の抽出物で合成したAgNPは、バンコマイシン耐性 E. faecalis （MIC 11.25 µg mL-1) およびMDR A. baumannii (MIC of 5.6 µg mL-1) [301]。また、Convolvulus fruticosus 抽出物で作製したAgNPは、MDR E. coli に対して有効であった（17.1 µg mL-1), K. pneumoniae (4 µg mL-1), and P. aeruginosa (2 µg mL-1). 研究は、生物起源AgNPsが細菌の表面に蓄積し、Ag+ イオンの付随的な放出と活性酸素の産生につながることを示した。AgNPは、電子伝達鎖の複合体中のFe-Sクラスターを調整するアミノ酸（特にシス）と競合することによって活性酸素の放出を促進する[302]。一部の活性酸素は細菌によって除去されるかもしれないが、大量の活性酸素は脂質過酸化により細菌の細胞膜を不安定にする[303]。その結果、そうでなければ細胞内への侵入が阻止されるはずの抗生物質が、傷ついた細胞膜を透過するようになる。同様に、細胞壁の合成を阻害する抗生物質は、AgNPの侵入口を提供することができる。アンピシリンとAgNPの相乗作用はこのメカニズムに基づいていることが発見され、アンピシリンは細胞壁の合成を阻害し、AgNPの多孔性の入り口を促進した [264]。

AgNPsは排出ポンプの働きを阻害する：排出ポンプ機構は、テトラサイクリン系抗生物質に対する最も一般的な防御の一つである。ゴールドNPは、EtBr（一般的な排出ポンプ基質）を用いた排出ポンプ産生をダウンレギュレートすることが観察されただけでなく、膜の安定性に重要な役割を果たす他の膜タンパク質の産生もダウンレギュレートした[304]。

抗生物質を破壊する侵入酵素： 最もよく知られている耐性メカニズムの一つは、β-ラクタマーゼ（アンピシリンに対して）やクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼの作用による抗生物質の酵素的破壊である。このシナリオでは、抗生物質を運ぶAgNPは、その積荷をカモフラージュするトロイの木馬のようなデリバリー・ビークルとして機能する[303]。 抗生物質コンジュゲートによる細胞内細菌の治療： 細胞内細菌は、細菌病原体 結核菌に見られるように、哺乳動物細胞に常在することによって感染を生じる種である。ほとんどの抗菌薬は哺乳類細胞に容易に入ることができないため、このような状態の治療は困難である［302］。対照的に、哺乳類細胞が受容体を介したエンドサイトーシスを介してNPを内在化するメカニズムはよく確立されている[302]。抗生物質によってキレート化されたAgNPは、細胞内細菌によって引き起こされる病気を治療する道を提供するかもしれない。一例として、ポリ乳酸-コ-グリコール酸にカプセル化されたAg/ZnNPsは、結核菌に感染した哺乳類細胞にリファマイシンを送達した[結核菌 [305]。これらのAgNP-抗生物質結合体は、細菌感染と闘うために複数のメカニズムを用いることができ、細菌が効果的な耐性を発達させることを困難にする。

課題と今後の方向性：AgNP-抗生物質コンジュゲートがMDR細菌による感染症の治療において可能性を示しているにもかかわらず、AgNP-抗生物質コンジュゲートを使用する米国FDA認可の治療法はほとんどない[303]。これに対処するためには、有望な可能性と効果的な治療法としてのAgNP-抗生物質結合体の確立との間のギャップを埋めるために、合成中のAgNPのバッチ間再現性（特に生物学的）、用量反応関係の開発、および生物モデル（in vitroおよびin vivo）の使用の進展を改善する必要がある。特異的ターゲティングは投与量を減らし、毒性を制限することが期待される： AgNP-薬物複合体は、そのカーゴを特異的にターゲティングしない場合、非ターゲット細胞と相互作用する可能性がある。AgNP-抗生物質カーゴをターゲティングする2つの一般的な戦略は、抗体とアプタマーによるターゲティングである。抗体法では、AgNPを抗体（例えば、S.aureus 抗体で標識されたAuNP）で共有結合的に標識し、細菌を選択的に殺すことができる構築物を構築する[305]。アプタマー戦略では、20-80ヌクレオチドのssDNAまたはRNA（すなわちアプタマー）でできた抗体をまず、低分子、膜タンパク質、ペプチドグリカン、細胞全体などの特定のリガンドを標的とするSELEX（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）を用いてin vitroで開発する。アプタマーはその後、共有結合によって一端がAgNPsに化学的に結合される。タンパク質抗体に対するアプタマーの利点は数多くあり、AgNPへの化学結合の容易さ、標的検出のための蛍光色素による標識の可能性、高い熱安定性、免疫系のバイパスなどが挙げられる。例えば、共役ゴールドナノロッドは、MRSAの表面を標的とすることに成功している[306]。さらに、黄色ブドウ球菌に特異的なDNAアプタマーで橋渡しされた銀ナノクラスター（AgNC）は、スクランブル（非特異的）DNA配列を含むAgNCと比較して6倍効果的にそのカーゴを標的化した[306]。全体として、病原体を特異的に標的化することで、抗生物質やAgNPの治療量を減らすことができる。

9. AgNPの毒性

細菌はすべて原核生物に分類されるが、動物、植物、菌類、ヒトなどの真核生物は、遺伝物質を含む膜結合核と膜結合小器官を持つ細胞で構成されている[307]。AgNPsは効率的な抗菌剤として認識されているが、真核細胞やより大きな生物モデルに対しても毒性を示すことがある。真核生物におけるAgNPの毒性は、多細胞生物が非常に複雑であることと、AgNPのPCC特性に大きなばらつきがあることから、依然として議論の的となっている。in vitroとin vivoの真核生物モデルの両方で、かなりの量の毒性研究が完了しているが、AgNPsに対する米国EPAの国家一次飲料水ガイドラインはまだ確立されていない[308]。国家一次飲料水規制は、公衆衛生を保護するために法律で強制力のある公共水道システムのための主要な基準と処理技術である。国家二次飲料水ガイドラインは、Ag+ ionsのような潜在的な汚染物質について決定されたものであり、これらは人の健康リスクとはみなされず、美的配慮（例えば、味、におい、色）のために自主的に検査されるに過ぎない [309]。Ag+ イオンを二次最大汚染レベル（SMCL）の0.1 mg L-1 より多い量で含む水を人間が摂取すると、皮膚の変色と白目の部分の白髪化を引き起こすことが判明した[309]。WHOによれば、Ag+ イオンを含む硝酸銀（AgNO3）10gの投与はヒトに致死的だが、0.6-0.9gのAg+ は関節症を引き起こすだけかもしれない（図1）[310]。AgNPsに関する規制の程度が低いため、消費者製品、医療処置、非自発的摂取（水や食品）、または作業関連の吸入を通じてAgNP曝露の安全レベルを決定するために、さらなる研究が必要である。これに対処するため、AgNPの毒性を定義するために、in vitro、in vivo、ヒトに関連する数多くの研究が行われている。

9.1. インビトロ研究

AgNPsのin vitro毒性は、細胞の種類、AgNPsのPCC特性、暴露条件（pH、濃度、時間など）によって影響を受ける[53]。AgNPの細胞毒性に取り組むことの難しさは、真核細胞の種類の多さと、それぞれの細胞タイプがAgNPを吸収、分配、代謝、排泄するユニークな方法にある。バクテリアで見られるAgNP媒介損傷の経路（例えば、活性酸素形成やDNA損傷-図9）は真核細胞と共有されているが、オルガネラが追加され、構造組織が異なるため、さらなる理解が必要である。全体として、これらの主要な損傷機構（図14）は、真核生物において細胞周期の停止と増殖の停止をもたらした[311]。真核生物だけの付加的な損傷機構は、細胞内AgNPの小器官への取り込みに由来する。 ミトコンドリア は、細胞のエネルギー産生と様々な細胞活動において重要な役割を担っているため、AgNP-オルガネラ相互作用に関して最も研究されているオルガネラの一つである。AgNPとミトコンドリアの接触は、ATP産生、活性酸素の形成、ミトコンドリアを介したアポトーシスの調節不全を引き起こす[312,313]。例えば、げっ歯類の神経細胞の一種であるPC-12細胞を10μg mL-1 of spherical AgNPs (57.2 ± 21.6 nm)に6時間暴露すると、ミトコンドリアの構造変化が起こり、その後ミトコンドリア機能が破壊された[314]。細胞内活性酸素はその後、小胞体（ER）の機能を阻害し、AgNPの蓄積と相関した。これは、in vitroおよびin vivoのナノ毒性研究のための潜在的なバイオマーカーとして利用されている[315]。例えば、ヒト網膜色素上皮細胞を5μg mL-1 of spherical AgNPs (6.3 ± 0.62 nm)に18時間暴露した後、複数の形態のERストレスが観察された[316]。別の研究では、Wistarラットの神経細胞の分泌経路は、球状AgNPs（10±4 nm）に21日間さらされた後、ERからの追加的なタンパク質分泌で過負荷になることがわかった[317]。AgNPを排泄しようとするこの細胞の試みは、ERストレスに応答して、 ゴルジ体 の肥大につながった[317]。 リソソーム は、細胞侵入時のAgNPの別の潜在的な目的地として機能する。AgNP-リソソーム相互作用は、リソソーム内pHやリソソーム膜の構造的完全性を含むリソソームの構造を変化させた[318,319]。リソソームの酸性環境内でのAgNPの生化学的分解は、真核細胞内でAg+ の著しい放出を誘導し、高い酸化ストレスを引き起こす可能性がある[53,319]。このような変化は、10μg mL-1 of spherical AgNPs (57 ± 21 nm) [314]と1時間接触した後の神経PC-12細胞のエンドリソソーム環境について報告された。別の研究では、球状AgNP（50±20 nm、PVPコート）の最も高い蓄積は、ヒト間葉系細胞の核、ゴルジ複合体、ERよりもむしろリソソーム構造内に観察された。しかしながら、AgNPは20μg mL-1 以上の濃度で真核の周りに凝集した[320]。これらのin vitro研究を総合すると、特定の細胞株や制御された物理的・化学的環境におけるAgNPの毒性をよりよく理解することができる。in vitroの結果は、より高い関連性と信頼性を持つin vivoモデルに外挿することができ、生体内部のより複雑な環境を扱うことができる。

図14 真核細胞におけるAgNPの損傷メカニズム。青緑色のテキストは真核生物だけの損傷を表し、黒色のテキストは細菌（原核生物）と真核生物の両方に特徴的な損傷を指す。図とコンセプトは[162,281,312] から得た。いくつかのオブジェクトは、説明のために縮尺がずれている可能性がある。

9.2. インビボ研究

AgNPsのほとんどのin vivo毒性研究は、生理学的条件下での生体の様々な構造との相互作用を扱っている。AgNPsは動物被験者の皮膚、肝臓、肺、脳、血管系、生殖構造に対して毒性があることがわかった[321,322]。他の重要な生物学的障壁の破壊もまた、長年の懸念であり、AgNPsを用いた動物実験の対象であった。例えば、AgNPは血液-精巣関門（10 nm、クエン酸塩コーティング）[323]、胎盤関門（18-20 nm、球状）[324]、血液-脳関門（49.7±10.5nm、球形、クエン酸塩コート）であった［325］。無毒性のAgNP濃度と、曝露後に最もAgNPが蓄積する臓器を特定するために、多大な努力が続けられている。これらの研究では、動物被験者へのAgNP投与の最も一般的な手法（すなわち、吸入、経口投与、経皮吸収）は、ヒトで見られるものと類似している。

注射と吸入： ；雌雄Wistarラットを用いたそのような研究の1つは、静脈内注射された球状AgNPs（13-35nm、エチレングリコールに分散）は、用量≧10μg mL-1で、後に回復を伴う細胞ストレス応答を誘導し、用量≧20μg mL-1 で臓器組織への蓄積を示すことを立証した；のAgNPs [326]。90日間の吸入（低用量：49μg m-3、中用量：133μg m-3、高用量）の別の研究のデータ： 515 µg m-3）を雌雄のSprague Dawleyラットに投与したところ、肺と肝臓に球状のAgNP（18～19 nm）が最も多く蓄積された。同試験では、AgNPsの経口摂取による呼吸器への影響は少なかった。AgNPsは脳でも検出されたが、最も蓄積した部位は嗅球に記録された[327]。3.3mg・m-3 of AgNPs（5±2nm、PVPコート）を10日間吸入（1日4時間）した別の報告では、雄のC57BL/6マウスで肺の炎症が少なく、肺の蓄積量が経時的に3倍減少した。この減少は、最終曝露直後の乾燥重量あたり31μg g-1 of AgNPsから、最終曝露後3週間で10μg g-1 of AgNPsまで減少した[328]。

経口摂取: AgNPsの経口摂取は、動物のAgNP暴露試験に広く用いられているもう一つの手法である[329,330,331]。例えば、12.6 mgのAgNPs kg-1 of body weight (14 ± 4 nm, spherical, PVP-coated) は、雌のWistar Hannover Galasラットに以下の蓄積レベルをもたらした： 小腸で27μg g-1 、胃で5μg g-1 、2.5μgg-1 、腎臓では1μgg-1 、肝臓では1μgg-1 であった[329]。対照的に、雄性CD-1(ICR)マウス（10 nm、球形、クエン酸塩コート）は、4週間の経口投与後、脳で最も高いAgNP蓄積を示し、続いて精巣、肝臓、脾臓であった[331]。

経皮吸収： 経皮浸透は動物およびヒトの両方で観察されており、かなりの影響も無視できる影響もさまざまな結果が得られている[332]。例えば、ブタの皮膚はヒトの死体皮膚よりも球状AgNPs（20nm、PEG、クエン酸塩、分岐ポリエチレンイミン（bPEI）コーティング）に対する透過性が高いことが報告されている[333]。クエン酸塩でコーティングされたAgNPsの場合、これらのレベルはブタの皮膚の14.02±8.01μgのAgNPs g-1 に対し、ヒトの皮膚の3.14±1.97μgのAgNPs g-1 であった[333]。しかし、AgNPsの大部分は、ヒトとブタの両方の皮膚に吸収されないままであり、AgNPsの表面電荷（正と負）は、ヒトの皮膚への浸透を高めるようには見えなかった。対照的に、負に帯電したクエン酸もしくはPEGでキャップされたAgNPは、正に帯電したbPEIでキャップされたAgNPよりもブタの皮膚でわずかに高い透過性を示した[333]。ゼブラフィッシュ（Danio rerio）のオスとメスの成魚を用いた別の経皮研究では、30mgと120mg L-1 ；の球状AgNPs（5-20 nm）は、肝細胞の活性酸素形成とDNA損傷に寄与し、アポトーシスとそれに続く壊死部位につながるDNA損傷への応答としてp53の発現を高めた[334]。肝臓は、その重要な解毒の役割から、もう一つの主要な検査臓器となっている。同じゼブラフィッシュの研究では、肝臓内のメタロチオネイン-重金属錯体タンパク質-も、120μg mL-1 のAgNPsにさらされた後、用量依存的に発現が増強された。24時間の致死濃度の中央値（LC50）は、ゼブラフィッシュでは250 mg Ag L-1 に設定され、採取した肝臓組織内の銀蓄積量は0.29 ng mg-1 for 30 mg L-1 of AgNP exposure and 2.4 nm mg-1 for 120 mg L-1 of AgNP exposure [334]. 全体として、動物モデルでのこれらのin vivo研究は、ヒトでの研究の参考となる。

9.3. ヒトでの研究

ヒトを対象としたAgNP暴露の短期および長期の影響に関する報告は非常に少ない。これらの研究は、ほとんどがAgNPの抗菌用途に関するものである[335]。

AgNPsの排泄： 人体内に存在するAgは、複数の排泄経路（例えば、胆汁便、泌尿器、毛髪、爪の成長）[336]があるため、時間の経過とともに部分的に排出される可能性がある。AgNPsは排泄される前にも、人体内の細胞との化学的相互作用や変換を経験する可能性がある。Agの代謝は、重金属による毒性から細胞や組織を保護するメタロチオネイン・タンパク質の誘導と結合によって制御されている[336]。Agを摂取した場合、タンパク質複合体として血液循環系に入り、後に肝臓や腎臓から排泄される[337]。AgNPの排泄は、ナノ銀ベースのドレッシング材が慢性炎症性創傷を持つn=40人の患者（3人が退学）に適用された臨床研究によって実証された。被験者の半数は、治療1ヶ月後に血清中のAg濃度が上昇し、体内からの銀の除去が遅いことに伴い、毒性は検出されなかった[338]。

ヒト血液中のAgNPs： ；AgNPsと赤血球（RBC）、リンパ球、白血球などのヒト血液成分との相互作用は多くの研究で確認されている[339、340,341,342,343,344]. しかし、AgNPと赤血球の相互作用メカニズム（溶血、凝固、血小板活性など）についてはほとんど知られていない[339]。多くの細胞成分によって媒介される血流内の炎症反応もまた、これらの相互作用の複雑さに寄与している[340]。サイズなどのAgNPのPCC特性も、ヒト赤血球に対する毒性に影響を与える。例えば、直径15 nmの球状AgNPs（クエン酸塩コーティング）を20 µg mL-1 に暴露すると、直径50 nmと100 nmの大きなAgNPs（12％以下）と比較して、より高いレベルの溶血（60％溶血）と膜損傷が引き起こされた[341]。特定のサイズの球状AgNPs（43.9 nm、PVPコート）では、赤血球の構造的損傷は、100 µg mL-1 から500 µg mL-1  (major membrane damage)まで濃度の増加とともに増加することが観察された[342]。血流内の他の細胞もAgNPによって損傷を受ける可能性がある。例えば、病気や感染と闘うリンパ球（白血球）の増殖と生存率は、球状のAgNPs（20nm、PVPとクエン酸塩でコーティングされたもの）への暴露によって悪影響を受け、この毒性は濃度依存的であった（10、20、30、40μg mL-1）[339]。好中球は血流の中で最も人口の多い細胞であり、炎症部位に移動する病原体に対する第一線のひとつである[343]。2、5、20μg mL-1 of spherical AgNPs (20 nm)に4-20時間さらされると、循環中の免疫抑制性好中球の集団が活性化され、増加した[344]。したがって、AgNPは好中球のアポトーシス死を増加させることによって抗炎症反応を刺激することが提唱された[344]。

AgNPsへの経皮曝露： AgNPベースの経皮製品が広く使用されているため、ヒトの皮膚は最近多くの毒性研究の対象となっている。AgNPの経皮適用（例えば、創傷被覆材、創傷ゲル、織物、化粧品-表2）は、一般市民や医療提供者によって広く使用されている。多くの創傷被覆材（例えば、アクティコート）は、線維芽細胞とケラチノサイトの両方にとって有毒な閾値レベルを超える、～50～100 mg mL-1 > [345]の濃度のナノ銀を含んでいる。局所創傷に存在する皮膚細胞や免疫細胞は、AgNPsと異なる相互作用を経験し、AgNPsに対して異なる耐性閾値を持つ[346]。例えば、ヒトのケラチノサイトは、25および50μg mL-1 of AgNPs (30 nm, citrate-coated) [347]に24および48時間暴露した後、著しく低い生存率を示した。クエン酸コートAgNPs（30 nm）を用いた同一の実験条件下では、50 μg mL-1 より高い濃度で、24時間後の生存率は有意に低かった（≤20%）[347]。健康な組織サンプルと損傷した組織サンプルでは、異なる反応も観察された。例えば、損傷した皮膚は、健康な無傷の皮膚（～0.46 ng cm-2 ）よりも、AgNPs（25±7.1 nm、PVPコート）に対して5倍高い浸透性（2.32 ng cm-2 ）を示した[348]。

抗生物質耐性という差し迫ったジレンマがあるため、AgNPは抗生物質の補足や代替品として研究されている[150]。米国FDAによって承認された銀ベースの製品（例えば、Silverlon、Aquacel、Acticoat創傷被覆材-表2）があるにもかかわらず、これらの製品の長期的な安全性に関する科学的データの欠如に対処するための運動が以前に提唱されている[349]。1996年に発案され、2022年に更新されたそのような提案の一つは、病気を治すと主張するコロイダルシルバーや銀塩を含む市販製品の有効性と安全性に関する科学的データの欠如を認めるものである。そのため、新製品は誤った表示がされる可能性があり、販売承認前にさらなる毒性調査が必要である[349]。消費者製品に組み込まれたAgNPsの観察された毒性に対する潜在的な解決策には、グリーン合成試薬や高い抗菌活性を持つより生体適合性の高いキャッピング剤が含まれる。

10. 結論と展望

銀の使用は、歴史的記録が始まって以来、社会に遍在してきた。抗生物質が商業的に生産される以前は、銀化合物は感染症の治療薬として、また感染症を予防するための手術中に日常的に使用されていた。20世紀以降、化学的・生物学的に生産されたナノ銀は、医療用治療薬だけでなく、衣料品、フェイスマスク、化粧品など、市販の米国FDA認可済みまたは未認可の製品にも採用されている。しかし、ナノ銀の抗菌メカニズムの詳細や、ナノ銀の物理化学的特性への依存性については、さらなる特性解明が必要である。本総説は、このギャップを埋めることを目的とし、関連するグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する、抗生物質機能化なしの銀ナノ粒子（AgNPs）および抗生物質機能化ありの銀ナノ粒子（AgNP-抗生物質結合体）の抗菌効果に焦点を当てた。これには、ESKAPE病原体や世界保健機関（WHO）がリストアップした優先度の高い抗生物質耐性菌が含まれる。

ナノ銀の製造には100年以上の歴史があり、化学還元剤と細菌、真菌、植物抽出物を用いてAgNPを製造する戦略はよく理解されている。AgNPの抗菌効果と、それに続く抗生物質との相乗効果も同様に確立されている。相乗効果により、より低濃度の抗生物質の使用が可能になり、抗生物質耐性微生物の増加を緩和できる可能性があることは明らかだ。加えて、AgNP-薬剤コンストラクトは微生物の防御をより容易に回避できるため、古い薬剤をAgNPに結合させることで再利用できるかもしれない。

AgNPコンジュゲートがより一般的な抗菌剤となる前に、Agへの長期曝露による環境・健康への影響や、AgNPからAg+ イオン型への化学変換の可能性についても調査する必要がある。皮膚、肝臓、腎臓、角膜、脾臓などの臓器におけるAgの蓄積をモニタリングするためには、過剰暴露による悪影響（例えばアルジニア）を避けるために、適切な銀の使用ガイドラインを確立するための動物モデルの開発が必要である。確かに、感染症の治療に使われる抗生物質や銀の量を制限することは、患者にとっても環境にとっても有益である。AgNP-抗生物質結合体の投与量をさらに減らし、環境への害を制限するためには、AgNPの標的送達が次の論理的ステップとなる。細胞表面のレセプターに特異的な抗体、アプタマー、ペプチド、多糖類をAgNPに結合させ、標的細胞だけにNPカーゴを送達する。こうして、宿主や有益な細菌への害を制限することができる。

AgNPおよびAgNP-抗生物質結合体は、ポスト抗生物質領域における次世代の抗菌剤として大きな可能性を秘めている。AgNPとそのコンジュゲートの抗菌効果に関する確かな研究にもかかわらず、この戦略を用いた米国FDA承認の治療薬は比較的少ない。その真の可能性を実現するためには、さらなる研究が必要である。AgNP合成と機能化プロセスのバッチ間再現性の向上、AgNPとAgNP-抗生物質結合体のPCC特性の特性化、Agとどのような形態のAgが重要な臓器にどのように影響するかについての理解を深めることが重要である。AgNPとAgNP-抗生物質結合体の大量生産と展開が、将来の抗菌治療薬となる前に、知識に基づいた規制ガイドラインが必要な前提条件である。

資金調達の声明

Texas A&M University Corpus Christi（テキサス州）およびWinthrop University（サウスカロライナ州）の支援に深く感謝したい。SC INBRE #5P20GM103499、SC EPSCoR、NSF #1655740の各賞に深く感謝したい。

利益相反について

著者は利益相反がないことを宣言している。