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Mixed Herbs Drugs: Inhibitory Effect on Growth
of the Endogenous Mycoflora and Aflatoxin Production
Published online: 8 November 2008
www.thecandidadiet.com/guide-to-antifungals/
概要
市販の混合生薬20種について、真菌学的プロファイルを調べた。薬剤中にはAspergillus属が最も多く含まれていた。その他の真菌としては，Paecilomyces種，Eurotium種，Monascus種，Acremonium種，Penicillium種，Cladosporium種，Scopu-lariopsis種，Phialophora種，Fonseceae種などが検出されたが，頻度は低かった。真菌数はサンプル1gあたり1.0 log10 CFU～2.4 log10 CFUであった。薬剤を湿度85%、25LCで培養したところ、真菌のコロニーが成長したのは2つの薬剤のみであった。混合した生薬を水で抽出し，その抽出液を用いてAspergillus parasiticusを増殖させた。すべての抽出物は，アフラトキシンB1およびアフラトキシンG1の産生を62～97%減少させた。また、2つの抽出物を除くすべての抽出物が、アフラトキシンB2およびアフラトキシンG2の産生を39〜95%減少させた。このことから、市販の粉末混合生薬には内在性真菌の数が少なく、これらの薬剤はその内在性真菌の増殖やアフラトキシジェニックな真菌によるアフラトキシンの産生を抑制すると結論づけることができる。
キーワード アフラトキシン 混合ハーブ 薬剤 マイコフローラ
はじめに
薬用植物は，真菌を含む様々な微生物を宿している[1]。研究によると、倉庫から出てきた一般的な薬用植物の中には、アフラトキシジェニックな真菌を保有しているものがあった [2, 3]。また、いくつかの薬用植物のサンプルからは、さまざまなマイコトキシンが検出された[4, 5]。毒素を持つ真菌が薬用植物に存在すると、品質が低下し、消費者の健康リスクが高まる。
薬物工場から分離された様々な真菌が、マイコトキシンを生成する能力を持っていることが示されている[6, 7]。また、一部の薬用植物を倉庫で保管している間にアフラトキシンの含有量が増加したという報告は1件しかなかった [3]。
粉末状の生薬は、錠剤、カプセル化されたもの、紙製の封筒に入ったものなど、市販されている生薬の一般的な形態の1つである。粉末状の生薬は，数種の生薬から構成されているのが一般的である（ミックスハーブ）[8]。様々な植物を組み合わせることで、これらの薬に含まれる可能性のある真菌の種類が増え、これらの真菌が成長することで、生薬が消費される前に貯蔵期間を経ることで、薬のマイコトキシン含有量が増加する可能性がある。市販の混合ハーブ薬のマイコフローラに関する研究はほとんど行われていない。最近、TrackessとScott[9]は、長い歴史にもかかわらず、食品や伝統的な薬として使用されている植物のカビによる汚染やマイコトキシンの発生に関する出版物がほとんどないことを報告した。彼らは、植物とドライフルーツにおけるマイコトキシンの発生に関するレビュー記事を発表した。今回の調査では、いくつかの市販混合生薬のマイコフローラ含有量と、これらの内因性マイコフローラが生薬上で直接増殖する能力について報告している。また、これらの生薬が、その上でアフラトキシン原性真菌が増殖する際に、アフラトキシン生産を抑制する能力についても調べた。
材料と方法
生薬
マレーシアで人気のある20種類の混合ハーブ製品を、マレーシアのクアラルンプールにある小売店から購入した。これらの製品は、ボトルまたはプラスチックの封筒に包装され、適切なラベルが貼られており、使用期限まで少なくとも6ヶ月の期間があった。Jamu Sihat、Jamu Makan、Jamu Angin、Jamu Batuk、Jamu Bersalin、Jamu Kurusは、細かく粉砕されたハーブ製品で、紙製の封筒に詰められてた。Majun Ratu、Tongkat Ali、Greenleaf Energizer、Medicare 800,Medicare 700,Qu Ban Lingは、細かく砕いたハーブ製品を2部式のカプセルに詰めたものである。Pil Gatal、Pil Resdung、Pil Kenis、Pil Onapil、Pil Beling、Pil Jerawat、Pil Kuat、Ming Muh Dihは、錠剤または顆粒状であった。表1に製品の成分、組成、使用目的、用量、適用方法を示す。
ハーバルプランツ
いくつかの漢方薬に使用されている4種類の漢方植物は、マレーシア森林研究所（FRIM）から入手した。FRIMの研究所でHelminthostacys zeylanica、Tacca integrifolia、Zingiber officinaleの根茎とEurycoma longifoliaの根を乾燥させ、粉末にした。
漢方薬のマイコフローラの推定
培地は、オキシテトラサイクリン-グルコース-酵母エキス寒天（OGYE、Oxoid CM545）とポテトデキストロース寒天（PDA、Merck 1.10130）の2種類を使用した。ポテトデキストロース寒天には、細菌汚染を抑制するためにクロラムフェニコール（Oxoid SR078E）を添加した[10]。直接めっきは、[11]に記載されている方法に若干の変更を加えて実施した。試料（0.1 g）を、滅菌したスパチュラを用いて、寒天の表面全体に振りかけた。プレートを25LCで2週間培養し、培養中に真菌のコロニーを数えた。検出限界は1.0 log10 CFU/gであった。形態的に異なるコロニーを採取し、PDAスラントおよびモルトエキス寒天培地（MEA, Oxoid）上で継代培養し、同定作業を行った。菌体の詳細な細胞形態は、スライド培養法を用いて研究した[12]。Aspergillus nigerは、細胞形態と文化的特性に基づき、真菌同定のためのキーを用いて種レベルまで同定した[10, 13]。
生薬中の内在性真菌の増殖
生薬の粉末5gを6枚の滅菌ペトリ皿に入れた。3枚のプレートは湿度85%のキャビネット（Cryotechnics Series 2000, Edinburgh, UK）で培養し、温度は25±1LCに維持し、他の3枚のプレートは2-4LCに維持した。毎週、真菌のコロニーが確認できるまでプレートを観察し、その後さらに1週間培養した。培養42日目（6週間）に真菌の成長が見られないプレートの培養を終了した。
漢方薬および漢方植物の水抽出
試料量が不足していたため、14種類の生薬のみを抽出した。生薬の粉末（10g）を50mlの蒸留水を入れた瓶に入れ、マグネチックスターラーを用いて室温（22±2LC）で5時間攪拌した。生薬については，生薬粉末10g，またはH. zeylanicaとT. integrifolia，E. longifolia，Z. officinaleのいずれかとの各5gを，50mlの蒸留水が入ったボトルに入れ，マグネチックスターラーを用いて室温（22±2LC）で5時間撹拌した。すべての抽出物を4,000gで10分間遠心分離し、上澄み液を使用するまで-20LCで保存した。
Aspergillus parasiticusの増殖とアフラトキシンの生産
基礎培地としてグルコース-ソルト培地を用いた[14]。培地の含有量（g/l）：グルコース、50;NH4SO4,6;KH2PO4,5;K2HPO4,6.4;MgSO4 7H2O,0.5;FeSO4 7H2O,0.01;ZnSO4 7H2O,0.005;MnSO4,0.001および酵母エキス、2。ハーブ水抽出物を含む生育培地（試験培地）は、基底培地の成分をハーブ水抽出物に溶解し,0.22lmのメンブランフィルターに通して調製した。対照用の生育培地は、基本培地の成分を脱イオン水に溶解して調製し,0.22 lmのメンブランフィルターを通過させたものである。試験培地と対照培地（20ml）を無菌的にユニバーサルボトルに分注した。
アフラトキシンB1，B2，G1，G2を産生するAspergillus parasiticus（120920株）をUnited Kingdom National Culture Collection（UKNCC），Surrey，UKから購入した。この培養液をモルトエキス寒天培地に接種し、25LCで1週間培養した。1週間後、真菌スラントを1mlの滅菌生理食塩水で覆い、滅菌ループで穏やかにプローブした。重い粒子を沈殿させ、上部の均質な懸濁液を取り除き、分光光度計を用いて530nmで75-80%の伝染率になるように濁度を調整した。約0.5 9 106個の真菌コロニー形成単位（CFU）[15]を含むこの懸濁液の1ミリリットルを試験培地と対照培地に接種し，25LCで8日間培養した。
培養後、[16]に記載されている方法で真菌の菌糸重量を測定した。濾紙（Whatman no.1）の重さを測り（W1)全培養物を濾紙に通した。ろ紙を蒸留水で2回洗浄した後、80℃のオーブンで24時間、または重量が一定になるまで乾燥させた（W2）。菌糸および胞子の重量は、W2 – W1 として算出した。
培養液中のアフラトキシンは，[14]に記載の方法で抽出した。培養液（10ml）にクロロホルム（10ml）を加え，ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。クロロホルム層を清潔な瓶に移し、窒素ガスを流しながら蒸発乾固させ,0.5mlのメタノールに再溶解した。TLCプレートに抽出液10mlをスポットし、トルエンエチルアセテート-クロロホルム-ギ酸（7:5:5:2）で展開した。TLCプレートを360nmの紫外線で観察し，アフラトキシンB1，B2，G1，G2のスポットに印を付けた（丸印）。様々な濃度の標準的なアフラトキシン（B1,B2,G1およびG2）もTLCプレート上にスポットし、上記のように処理した。シリカゲルをスポットからメタノール溶液中に掻き出した。このメタノール溶液を13,000gで10分間遠心分離した。Nabney and Nesbitt [17]の方法により，アフラトキシンB1およびアフラトキシンG1については360 nm，アフラトキシンB2およびアフラトキシンG2については362 nmの分光光度計で，メタノール溶液の紫外線吸着スペクトル（OD）を測定した。OD対アフラトキシン標準物質濃度の標準曲線を作成し、ハーブ抽出物を含む培養ブロスのメタノール抽出物に含まれるアフラトキシン類の未知濃度の測定に使用した[18]。
結果
表2より、20剤中16剤から真菌が検出された。真菌数はサンプル1gあたり1.0 log10 CFU～2.4 log10 CFUであった。すべての陽性サンプルからAspergilliが分離された。その他、頻度は低かったが、Paecilomyces種、Eurotium種、Monascus種、Acremonium種、Penicillium種、Cladosporium種、Scopulariopsis種、Phialophora種、Fonseceae種などの真菌が分離された。ハーブ薬の内包性真菌の生育を調べたところ、25LCで85%の湿度で42日間培養したところ、Jamu SihatとJamu Anginのみが真菌を生育した。Pil JerawatとJamu Sihatを除くすべてのハーブ薬の抽出物は、A. parasiticusの成長を阻害しなかった（図1）。図2は、アフラトキシン標準物質の標準曲線である。基底培地で8日間培養したところ，A. parasiticusは，それぞれ0.37，0.32，0.29，0.18 lg/mlのアフラトキシンB1，アフラトキシンG1，アフラトキシンB2，アフラトキシンG2を生成した。表3によると、すべての生薬抽出物がアフラトキシンB1およびアフラトキシンG1の生成を62〜97%減少させた。また、Pil KuatおよびJamu Sihatを除くすべての抽出物は、アフラトキシンB2およびアフラトキシンG2の生成を40-95%減少させた。H. zeylanicaとE. longifolia、T. integrifolia、Z. officinaleのいずれかとの複合抽出物の効果を図3,4,5に示す。図3,4,5に示した結果に基づき、ハーブ抽出物を添加したブロスで培養したA. parasiticusが産生するアフラトキシンをコントロールと比較して減少させる割合を算出した。抽出物 H. zeylanica，T. integrifolia，E. longifoliaおよびZ. officinaleの抽出物は，アフラトキシンB1の産生をそれぞれ2%，25%，1.7%および5.7%減少させ，H. zeylanicaとT. integrifolia，E. longifoliaおよびZ. officinaleのいずれかとの組み合わせは，アフラトキシンB2の産生をそれぞれ89%，85%および96%減少させた。H. zeylanica、T. integrifolia、E. longifolia、Z. offi-cinaleの抽出物は、アフラトキシンG1の生成をそれぞれ16%、41%、3%、47%減少させた。
H. zeylanicaとT. integrifolia、E. longifolia、Z. officinaleの組み合わせでは、それぞれ71%、62%、61%のアフラトキシンG1生成量の減少が認められた。H. zeylanicaの抽出物。
H. zeylanica、T. integrifolia、E longifoliaおよびZ. officinaleの抽出物は、アフラトキシンG2の生成をそれぞれ17%、60%、61%および50%減少させたが、H. zeylanicaとT. integrifolia、E longifoliaおよびZ. officinaleのいずれかとの組み合わせは
H. zeylanicaとT. integrifolia、E. longifolia、Z. officinaleの組み合わせでは、それぞれ87%、94%、81%のアフラトキシンG2生成量の減少が認められた。
考察
結果は、80%のハーブ製品が真菌に汚染されていたことを示している。薬用植物を対象とした他の研究では、マイコフローラの有病率は79%から 100%であった[19, 20]。また、ハーブ製品の真菌数が少ない（1.0 log10 CFU～2.4 log10 CFU）ことも他で報告されている[21, 22]。真菌が検出されたすべてのサンプルにAspergillus種が含まれていたことから、Aspergillus種がハーブ製品に最も多く見られる真菌であることが示唆された。これは他の研究者によっても同様に観察された[5, 22, 23]。しかし、A. flavusのような一般的なマイコトキシジェニックな真菌は分離されなかった。ある研究では、分析した130種類の薬用植物のうち4種類のみがアフラトキシジェニックな真菌を有していたが[20]、他の研究では、調査した130種類のハーブとスパイスにはアフラトキシジェニックな真菌は含まれなかった[23]。報告によると、薬用植物サンプル中のアスペルギルスはA.nigerが最も優勢であり、Aspergillus flavusは低い頻度で検出され、A.parasiticusは検出されなかった[22, 24]。
Aspergillus spp.はいずれもA. parasiticusまたはA. flavusと同定されなかった。しかし，薬剤サンプルから分離されたA. nigerおよびいくつかのPenicillium種は，重要な毒性代謝物を産生することが知られている。Eurotium種、Paecilomyces種、Monascus種、Cladosporium種、Scopulariopsis種、Phi-alophora種、Acremonium種、Fonseceae種、Trichoderma種、Mucor種、Rhizopus種などの他の真菌は、マイコトキシジェニックであるとは考えられていない[10]。
Jamu Makan, Jamu Bersalin, Jamu Kurus, Pil Gatal, Pil Kenis, Pil Beling, Pil Kuat, Majun Ratu, Tongkat Ali, Greenleaf Energizer, Medicare 700, Medicare 800, Qu Ban Ling, Ming Muh Dihからは真菌が分離されたが、これらのハーブ製品を湿度85%の25LCで培養したサンプルでは、Jamu SihatとJamu Anginを除き、真菌が繁殖しなかった。これらの結果は、生薬が保管中に真菌に汚染される可能性が低いことを示唆している。また、サンプルを実験用の培地に振りかけても、製品に直接振りかけなくても、サンプルから真菌が繁殖したことから、ハーブの水分活性が低いことが示唆された。ほとんどのハーブは10%以下の含水率になるまで乾燥されており[25]、これは真菌の成長には低すぎるものであった[26]。ハーブ製品のサンプルは85%の湿度で培養されたが、乾燥した植物組織は吸水能力にばらつきがあることが報告されている[27]。これらの製品にカビが生育しないのは，ハーブに阻害物質が含まれているからだとも考えられている。しかし，A. parasiticusの生育は，ほとんどの製品の抽出物によって阻害されなかった（図1）。これらの結果は，生薬の水分活性が十分に高ければ，一部のカビが生薬上で生育し，その生育によってマイコトキシンが生成される可能性を示唆している。
Jamu SihatとJamu Anginでのカビの生育は、生薬が空気と高湿度にさらされている場合、内因性のカビが生育する能力を示している。これらの薬剤上でアフラトキシジェニックな真菌が増殖すると、アフラトキシンが生成されることが懸念されている。A. parasiticusはこれらの生薬からは検出されなかったが、A. parasiticus（最も重要なアフラトキシン生産カビの1つ）が生薬上で成長する際にアフラトキシンを生産する能力を調べる実験を行った。その結果、生薬の20%水抽出物は、アフラトキシンの生産を効果的に抑制した。個々の生薬植物抽出物のA. parasiticusのアフラトキシン産生を阻害する能力は、植物によって異なり、阻害効果は4%未満と低くなることが報告されていた[28-30]。従って、今回の研究で見出された混合生薬抽出物の阻害効果は、他で報告されているいくつかの個別の植物抽出物の効果よりも一般的に高かった。Pil Belingはほぼ100%のアフラトキシンB1生成を抑制し、他の6製品の抽出物（43%）は80%以上のアフラトキシンB1生成を抑制した。これらの結果は、20%の混合ハーブの抽出物に基づくものであるため、全体の抽出物でより高い割合のアフラトキシン抑制効果が期待できる。これらの結果から、混合生薬の抽出物は、アフラトキシンB1の生成を良好に抑制することが示された。アフラトキシンB1およびアフラトキシンG1は，アフラトキシンB2およびアフラトキシンG2よりも毒性が強く，アフラトキシンB1およびアフラトキシンG1がヒトのDNA損傷を引き起こすことが明らかにされていた[31]。
H. zeylanica, T. integrifolia, Z. officinale, E. longifoliaの4種類の個別ハーブを用いた研究でも，単一ハーブの抽出物よりも混合ハーブの抽出物の方がアフラトキシン原性真菌によるアフラトキシン産生を抑制する効果が高いことが示された。
また、個々の植物エキスのアフラトキシン産生抑制能力は植物によって異なり、アフラトキシンB1が最も抑制されないことがわかった。H. zeylanicaとT. integrifolia，E. longifolia，Z. officinaleの組み合わせによるアフラトキシン生成抑制効果は，組み合わせによる抑制効果が個々の植物による抑制効果よりも高かったことから，アフラトキシン生成を抑制する多くの種類の植物化学物質がハーブ抽出物に含まれていることを示している。
特にH. zeylanicaとE. longifoliaの組み合わせは、H. zeylanicaによるアフラトキシンB1生成抑制が2.3%、E. longi-foliaによるアフラトキシンB1生成抑制が1.7%であったにもかかわらず、H. zeylanicaとE. longifoliaの組み合わせ抽出物は、アフラトキシンB1生成を53%抑制したことから、注目されている。これらの結果から，ハーブ植物にはアフラトキシンの生成を抑制する多様なフィトケミカルが存在するだけでなく，それらのフィトケミカルが相乗的に作用して，A. parasiticusによるアフラトキシンの生成をより多く抑制することができることが示唆された。この結果は、生薬に含まれるいくつかの生理活性化合物の単離と特性化、およびマイコトキシジェニックなカビによるアフラトキシンの生産に対するそれらの潜在的な効果について、さらなる研究が必要であることを示唆している。
6種類以上の植物からなる生薬（Jamu Angin、Jamu Batuk、Pil Onapil、Pil Beling、Ming Muh Dih、Jamu Kurus、Pil Gatalなど）の抽出物は、6種類以下の植物からなる生薬の抽出物に比べて、一般的にアフラトキシンの生成を抑制する効果が高いことがわかった。10種類のハーブからなるMing Muh Dihは、アフラトキシンB2およびアフラトキシンG1の合成を最も抑制し、アフラトキシンB1の生成を2番目に抑制する抽出物であった。しかし、アフラトキシン産生抑制の程度は、混合生薬を構成する植物の数に必ずしも依存しない。Jamu SihatとPil Jerawatの場合、前者は11種類のハーブで構成されているにもかかわらず、後者は4種類のハーブのみで構成されているにもかかわらず、アフラトキシン産生抑制効果がはるかに低いことが明らかになった。個々の植物を用いた研究では、混合ハーブ製剤は、製剤中の複数の植物がアフラトキシン生成を抑制する能力を持ち、混合植物中の植物化学物質が相乗的にアフラトキシン合成を抑制することができれば、より多くのアフラトキシン生成を抑制する可能性がある。Pil KuatとJamu Sihatの抽出物の場合、アフラトキシンB1の合成を阻害した植物化学物質は、アフラトキシンG1の合成も阻害する可能性があるが、アフラトキシンB2やアフラトキシンG2の合成は阻害しないという結果が得られた。
おわりに
市販のミックスハーブ製品の真菌数は、おそらく適正製造基準（GMP）に基づいて低く抑えられていた。それらにはAspergilliのような潜在的にマイコトキシジェニックな真菌が含まれていたが、これらの内在性マイコフローラ集団は、医薬品が購入され、消費される前に、医薬品の中で増殖することはないと思われる。仮にこれらのマイコフローラが薬剤中で増殖したとしても、マイコトキシン、特にアフラトキシンの生成は抑制されると考えられる。生薬に含まれるマイコトキシンは、おそらく薬が製造される前に形成されていると考えられる。したがって，生薬の製造に使用される薬用植物の品質が，生薬の微生物学的およびマイコトキシンの含有量を決定する。