査読論文：COVID-19 mRNAワクチンComirnaty®中のDNA不純物の定量に関する方法論的考察

Methodological Considerations Regarding the Quantification of DNA Impurities in the COVID-19 mRNA Vaccine Comirnaty®

www.mdpi.com/2409-9279/7/3/41

by Brigitte König 1,2ORCID andJürgen O. Kirchner 3,*

Magdeburg Molecular Detections GmbH & Co.KG, 39104 マグデブルク, ドイツ

ライプツィヒ大学医学部医療微生物学・ウイルス学研究所、04103ライプツィヒ、ドイツ

3独立研究員、22307ハンブルク、ドイツ

投稿受理2024年3月12日／改訂：2024年5月6日／受理：2024年5月7日／発行：2024年5月8日2024年5月7日 /発行：2024年5月8日

(この記事は SectionBiomedical Sciences and Physiology に属しています)

要旨

DNA不純物は遺伝子組換え医薬品の安全性に影響を与える可能性があるため、製造販売承認時に特定の規制値を設定する必要がある。これは特にmRNAワクチンに当てはまり、その製造には大量のDNAテンプレートが使用されるからである。さらに、最終製品中の総DNA含有量を定量する場合、mRNA有効成分に加えて、DNA不純物も脂質ナノ粒子に包まれているため、定量が困難であることを考慮しなければならない。実際、mRNAワクチンComirnaty（BioNTech/Pfizer）の製造業者は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によってのみ活性物質中のDNA不純物を測定しており、そのDNA標的配列はもともと添加されていたDNAテンプレートのわずか1％未満である。つまり、DNAの直接定量は行われず、DNA混入の限界値への適合は、数学的外挿法を使ってqPCRデータから推定されるだけである。しかし、脂質ナノ粒子を洗浄剤で溶解し、蛍光分光法を用いて最終製品中のDNA汚染を直接測定することも可能である。この方法を実験的に検証した結果、この方法で信頼性の高い値が得られることが確認された。

キーワード

mRNAワクチン;コミルナティ;DNA不純物;蛍光分光法;キュービット蛍光光度法

AI要約

専門家向け

1. コミナティには許容限度を大幅に超えるDNA不純物が含まれている可能性がある。
2. 製造過程でのDNA定量にqPCR法を用いているが、この方法では大量のDNA不純物を見逃している可能性がある。qPCRは特定のDNA配列の定量には適しているが、総DNA量の定量には不向きである。
3. mRNA有効成分の定量と同様に、最終製品中の総DNAを蛍光分光法で測定することで、DNA汚染を的確に検出できると考えられる。欧州の管理機関がこれを体系的に実施していない理由を議論・再考する必要がある。
4. コミナティ中のDNA不純物は脂質ナノ粒子に組み込まれ、mRNAと共にワクチン接種者の細胞内に直接運ばれる。このDNAがヒトゲノムに組み込まれる可能性など、安全性リスクについても検討が必要である。

一般市民向け

新型コロナウイルスに対するmRNAワクチン「コミナティ」には、本来あってはならない量のDNA断片が混入している可能性があることが、この研究で指摘されています。

ワクチンの製造過程では、混入したDNAの量を測定していますが、その方法に問題があり、実際よりもずっと少なく見積もられているかもしれません。もしそうだとすると、ワクチンの安全性に関わる重大な問題です。

この研究では、最終製品のワクチンに含まれる総DNAを蛍光を使って直接測定する方法を提案しています。この方法なら、DNA混入量をより正確に把握できるはずです。にもかかわらず、欧州の管理機関がこの検査を実施していないのは疑問だと指摘しています。

さらに重要な点は、混入したDNAがmRNAと一緒に脂質の粒に包まれ、ワクチン接種によって直接細胞内に運ばれてしまうことです。このDNAが人間の遺伝情報に組み込まれるリスクなど、安全性への影響を慎重に見極める必要があります。

mRNAワクチンは新しい技術なので、私たち一般市民にも正しい情報に基づいて冷静に議論していくことが大切だと思います。ワクチン接種を検討される方は、このような研究の動向にも注意を払いつつ、医療従事者とよく相談しながら判断することをおすすめします。

行政や製薬会社には、ワクチンの品質と安全性をしっかりチェックし、問題があればすぐに公表・対策する責任があります。私たち市民も、根拠のない情報に惑わされることなく、科学的な議論の行方を見守っていきたいですね。

mRNAワクチンに混入のDNAが人間の遺伝情報に組み込まれるとどのようなことが起こり得るのでしょうか？

ワクチンに混入したDNAが人間の遺伝情報に組み込まれる可能性については、次のような懸念が考えられます。

• 1. 突然変異の誘発：ワクチン由来のDNAが染色体に取り込まれると、挿入された部位の遺伝子に突然変異が起こるかもしれません。これを「挿入変異」と呼びます。運悪く腫瘍抑制遺伝子などに挿入変異が起これば、細胞のがん化につながる恐れがあります。
• 2. 遺伝子の発現異常：混入DNAが遺伝子の調節領域に入り込むと、本来そこで発現するべき遺伝子の働きが変わってしまう可能性があります。これによって、様々な健康問題が引き起こされるかもしれません。
• 3. 免疫系への影響：外来のDNAに対する免疫反応が過剰に起こると、自己免疫疾患などを招く恐れもあります。
• 4. 生殖細胞への影響：もし混入DNAが精子や卵子のゲノムに組み込まれてしまったら、次世代に予期せぬ影響が及ぶ可能性も否定できません。

ただし、これらはあくまで理論上の可能性であり、実際にどの程度のリスクがあるのかは不明です。ワクチン由来のDNAが本当にゲノムに組み込まれるのかどうかも、まだ証明されてはいません。

とはいえ、遺伝情報へのインパクトという観点からは、慎重に検証していく必要がある課題だと言えます。mRNAワクチンの安全性を継続的にモニタリングし、科学的なエビデンスを積み重ねていくことが肝要だと考えられます。

こうしたリスクの可能性についても冷静に議論しながら、ワクチンの利点とのバランスを社会全体で考えていく必要がありそうです。専門家の意見にもしっかり耳を傾けつつ、一人一人が適切な判断をしていくことが大切だと思います。

1.考察

遺伝子組換え医薬品の中でも、mRNAを有効成分とするものは特殊なケースであり、その無細胞生合成には高濃度のDNA鋳型が必要となるため、医薬品として使用する前に鋳型を除去する必要がある。BioNTech/Pfizer社（BNT162b2）（ドイツ、マインツ）が製造したCOVID-19 mRNAワクチンComirnaty®の場合、これらの鋳型は細菌培養から得られたプラスミドによって産生される[1]。したがって、Comirnaty®は特別な品質を有している：製造工程上、DNAの不純物が混入する可能性がある。これはすべての遺伝子操作医薬品に関連することかもしれないが、それ以外ではほとんど問題にならない[2]。これは、遺伝子組換え活性物質が主にタンパク質であり、その化学的差異によりDNAから容易に分離できることによる。したがって、遺伝子組み換え医薬品に含まれるDNAの不純物は、これまではわずかな問題でしかなかった。汚染DNAと有効成分mRNAはどちらも核酸であるため、化学的に類似しており、タンパク質の有効成分を精製する際にDNAを分離するよりもはるかに困難である[3]。

したがって、mRNAワクチンの製造に使用される反応混合物に高濃度のDNAテンプレート（実際には直鎖化プラスミド）を添加することは、汚染DNAに関する品質保証という点で、COVID-19 mRNAワクチンにとって特別な課題となる。さらに、mRNAの形をした活性物質は、汚染DNAに比べて安定性が低い。室温にさらすだけでもRNAは崩壊してしまうのに対し、DNAは分解酵素がない場合、同じ条件下で何十年も安定したままである[4]。薬剤製剤に使用される脂質ナノ粒子は、mRNAをワクチン接種者の細胞内に輸送する機能を持つが、その感度はさらに高いようだ。その崩壊は室温ですでに起こっているため、コミルナティ®を極低温で保存する必要がある。したがって、実用的な要件を満たす保存期間を達成するためには、-60～-90℃での保管が規定されている。2～8 °Cでの保管も許容されるが、製品の貯蔵寿命はかなり短くなる[5]。

mRNA活性成分の生産後に、生産プロセス中に添加されたDNAテンプレートと、それに付随する宿主細菌のゲノムDNAの残留物を除去するために、無細胞mRNA合成終了後の反応混合物中で、まず酵素DNase IによるDNA消化が行われる。その後、濾過を行うことで、得られたDNA断片を除去し、mRNAは保持する[6]。

これは簡単なことのように聞こえるかもしれないが、使用するmRNAがかなり化学的に不安定であることが問題となる可能性があることを覚えておかなければならない。特に、DNase消化は35℃以上の温度と攪拌下で行われるため、つまり、暴露が長く続くとmRNAの活性成分が著しく失われる可能性がある条件下で行われるためである。つまり、mRNAの収量が経済的であり、同時にDNA含量がその都度設定される限界値以下に保たれるように、DNA消化はあらゆる点で制限されなければならない。この限界値は、コミルナティ®の認可の一環として設定されたもので、1用量あたり10 ng DNAが限界値であり[6,7]、遺伝子組み換え医薬品に関するWHOの勧告[2]に正確に対応している。

コミルナティ®の製造において、この制限値を満たすことに成功したという事実は、その認可後、一般的に当然のこととして受け入れられていた。しかし、米国の科学者ケビン・マッカーナン（Kevin McKernan）らの研究チームが、コミルナティ®に大量のDNA不純物が含まれていることを公表し[8]、そのほとんどが1回投与量あたり10 ng DNAという適用限界値の数百倍の量で含まれていたため、このドグマは再考を余儀なくされた。デイビッド・シュパイヒャー率いるカナダのグループ［9］や、サウスカロライナ州上院で研究結果を発表した米国の癌研究者フィリップ・バックホーツ［10］など、他の科学者たちも独自の結果を発表した。

したがって、バッチ試験の一環として実施されたコミルナティ®のDNA定量に誤りがあった可能性はないだろうか。これを検証するためには、まず採用された方法手順を調べる必要がある。この疑問は主に、承認手続きの一環として作成された2020年11月19日付けの欧州医薬品庁（EMA）の文書に由来する[6]。この資料では、DNAの定量はDNase消化と濾過を行った後、活性物質中で行われると記載されている。この文書には、このDNA分析のために選択された方法は、qPCRと略される定量的ポリメラーゼ連鎖反応であり、標的配列は、全長7824塩基対のDNA鋳型のうち69塩基対のみであり、これにより、mRNA活性物質を産生するための転写プロセスにとって重要なステップであるT7プロモーターの配列が組み込まれると記載されている。したがって、この配列の存在のみがチェックされ、残りの7755塩基対、したがって鋳型の99％、および宿主細菌の残りのゲノムDNAは未判定のままである。

ドイツ政府の公式情報[11]によれば、理論的DNA含有量は、このqPCR測定によって得られた測定値から外挿され、1用量あたり10 ng DNAという限界値と比較される。これが何を意味するかは、すでに上記で引用した2020年11月19日付けのEMA文書[6]に詳しく説明されている。この文書によると、直鎖化プラスミドで希釈系列が作成され、これがin vitro転写のDNA鋳型となり、qPCRを用いて測定される。希釈系列を測定する際に得られたデータから標準曲線を作成する。最後に、活性物質サンプルの測定結果は、外挿によってこの標準曲線と数学的に比較される。しかし、上記のEMA文書の記述からは、DNA鋳型、すなわち直鎖化プラスミドが製造工程で受けるプロセスが何らかの形で考慮されていることは明らかではない。これは特に、DNaseやプロテイナーゼによる消化や濾過に加え、in vitroでの転写、DNA鋳型や添加された酵素が分解された小さなDNAやタンパク質の断片を除去する工程に適用される。製造過程で直鎖化プラスミドに影響を与えるものは、標準曲線を作成する際には考慮されないようである。しかし、これは標準曲線がqPCRの測定値を実際に反映するために必要なことである。これは特にDNase消化中に実際に起こることに当てはまる。このことを念頭に置いて、以下の質問が最も重要である：

• どのDNA断片がDNase消化中に特異的に形成され、qPCR標的配列は直鎖化プラスミドの残りの断片全体に比例して実際に分解されるのか？直鎖化プラスミドの異なる配列は、他の配列よりもDNaseによって分解される頻度が高いか、あるいは有意に低いか？
• in vitro転写条件は、qPCR標的配列の一部であるT7プロモーターの配列にどのような影響を与えるか？T7プロモーターは使用するポリメラーゼに対して特別な親和性を持つので、標的配列はポリメラーゼやプロテイナーゼ消化の結果生じたその断片によって少なくとも部分的にマスクされる可能性があり、したがってqPCRを使用して測定できない可能性があることを考慮すべきである。
• たった69塩基対の長さしかない標的配列は、DNase消化とそれに続く濾過工程の後に残る他の配列に比例した量で実際に残るのだろうか？もし比例関係が与えられなければ、どのような外挿も間違いになるに違いない。

これらの質問は、qPCRによるDNA定量を使用する場合、与えられた質問に対する実際の比率に対応する再現性のある値を得ることが難しいこと、すなわち、最終製品の用量あたり10ng DNAという限界値が守られているかどうかを示している。

このような背景から、欧州薬局方2.6.35.Quantification And Characterization of Residual Host-Cell DNA[12]には、qPCRは特定のDNA配列の定量に選択される方法であり、全DNAの測定はqPCRではなく他の方法に割り当てられると記載されている。

ドイツ連邦政府からのさらなる連絡[7]によると、欧州におけるバッチ試験は、欧州医療品質総局（EDQM）が公表したプロトコル[13]に従って実施されている。この文書では以下のことが確認されている：製造業者によって行われる活性物質レベルでの単発的な測定は別として、ワクチンについて、特に最終製品について、公式のバッチ試験においてさえも、それ以上の実験的なDNA定量は行われない。

このアプローチは、どのように正当化されるのかという問題を提起する。その答えは、ドイツ政府による公式声明にもある[11]。この声明によると、DNA不純物の定量は活性物質中で行うべきであり、即使用可能なワクチンでの測定は含まれる脂質ナノ粒子によって妨害される可能性があり、誤った値につながる可能性があるからである。一見したところ、これは容認できるように聞こえる。しかし、EDQMプロトコルをさらに検討すると、最終製品に含まれる脂質ナノ粒子にもかかわらず、mRNA活性成分（DNAのような核酸）が定量されることがわかる。しかし、mRNAの定量が脂質ナノ粒子によって妨げられないのであれば、核酸の共通の性質から、原理的にはDNAの定量にも当てはまるはずである。それゆえ、最終製品中のRNAの定量が国家機関によって実行可能であると認められている一方で、同じ製造レベル、すなわち使用済みワクチン中のDNAの定量が認められていないのはなぜなのだろうか？

オーストラリア医薬品局（Australian Therapeutic Goods Administration）（オーストラリア政府、保健省）が公表した文書には、この疑問に答えるための重要な事実が記載されている。まず、ベルギー国立研究所のSciensanoが発行したComirnaty®のバッチリリース文書がある[14]。この文書によると、最終ワクチン中のRNAは蛍光分光法を用いて測定されている。Australian Therapeutic Goods Administrationが発行した別の文書[15]では、この方法に関するバリデーションデータが示されており、この方法がどのようなものであるかが明らかにされている。この文書によると、RNA 特異的蛍光色素RiboGreen®は、Comirnaty® 中の mRNA を最終製品レベルで定量するために使用される。この色素は RNA に高度に特異的に結合し、その結果、存在し測定可能な RNA 量に比例した蛍光を発します。RiboGreen®は、ThermoFisher Scientific社（ドイツ、Dreieich）が製造する蛍光Quant-iT®システムの一部である蛍光色素の一つである[16]。

Quant-iT®測定は、品質管理試験所で常備されている分析装置を用いて実施されるため、使用される装置に特化した方法のバリデーションが必要である。このようなバリデーションは、オーストラリア政府が発行した前述の文書に記録されている[15]。これらのバリデーションデータから、RNA 定量のためには、脂質ナノ粒 子に結合した mRNA を遊離させ、測定に利用できるようにするために、脂質ナノ粒 子を崩壊させる必要があることも明らかになった。

RNA特異的なRiboGreen®に加え、代替品としてDNA特異的な蛍光色素PicoGreen®も用意されており、Triton-X-100を用いて脂質ナノ粒子を崩壊させた後、最終ワクチン中のDNA定量をRNA定量と同様に確実に行うことができる[15]。Quant-iT®システムに加え、サーモフィッシャーサイエンティフィック社は、蛍光色素を用いた特異的定量用のQubit® システムも提供している。Quant-iT®は標準的な検査機器（マイクロタイタープレートリーダー）で高いサンプルスループットを可能にする一方、Qubit®は広範なルーチン検査用の機器がなく、比較的低いサンプルスループットが予想される検査室で選択される方法である[17]。Qubit®は、標準化されたQubit®検査キットと組み合わせることができる自動蛍光スペクトロメーターを使用します。これらのQubit®キットは、RNAまたはDNA定量用に最適化されており、タンパク質定量用の標準化キットも利用できる[18]。このような汎用性により、Qubit®は多くの分子生物学研究室で標準的な装置となっている。Qubit®の優れた選択性は、サンプルに含まれる不純物の影響が少ないことと同様に、メーカーにより広範に検証され、文書化されている。特に、Nanodrop®分光光度計がこの点で失敗したのに対し、多量のRNAがQubit DNA定量を変化させないことが証明されている[19]。そのため、Qubit®はQuant-iT®よりも有利である。使用する標準装置でQuant-iT®を使用する際に必要とされる特定のテストバリデーションは、メーカーのキャリブレーションにより省略することができる[18]。そのため、Quant-iT®とQubit®という2つのシステムは、機能性の点で互いに対応している。このことは、Quant-iT®とQubit®の両方が、特異性の高い結合蛍光色素を用いて、最も高い信頼性でDNAとRNAを区別できることを意味する。

そのため、コミルナティにおける全DNAの定量にQubitが実用的に適しているかどうかを調べる必要があった。この目的のために、RNAとDNAの定量の両方を含む一連の実験が行われた（可能性のある交絡因子のデータを含め、詳細は補足資料に記載）。

図 1は、Triton-X-100 未処理のComirnaty®と Triton-X-100 処理後の Comirnaty® の 7 バッチについて、Qubit® を用いて mRNA を測定した結果を示しています。4つのバッチはすでに賞味期限切れであったが、3つのバッチの残存賞味期限は11～13カ月であった。この結果は、Comirnaty®をTriton-X-100で処理することにより、RNA値が有意に増加することを明確に示している。実施された特定の一連の試験において、この効果は、測定時にバッチがすでに期限切れであったか、あるいはまだ長い保存可能期間を有していたかに一部依存しているようである。つまり、賞味期限切れの4つのバッチのうち2つでは、Triton-X-100なしでも全RNAの50％以上が測定可能であった。このことは、期限切れバッチでは、Triton-X-100 なしでも脂質ナノ粒子が崩壊していることを示唆している。一方、保存期間の長いワクチンでは、総 RNA の 97～99%が、脂質ナノ粒子を Triton-X-100 で溶解した後でのみ測定可能であった（詳細は補足資料に記載）。