Low-dose fluvoxamine modulates endocytic trafficking of SARS-CoV-2 spike protein: a potential mechanism for anti-COVID-19 protection by antidepressants
www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.06.15.448391v1.full.pdf
概要
一般的に処方されている抗うつ薬は，重症のCOVID-19に対する防御作用を持つ可能性があり，現在，1つの薬剤（fluvoxamine）が第3相臨床試験を実施中である。しかし、その作用機序については不明な点が多い。ここでは、HEK293T細胞において、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質とその細胞宿主受容体であるACE2の膜輸送に対するフルボキサミンの効果を調べた。治療濃度以下（80nM）のフルボキサミンを投与すると、液相エンドサイトーシスが急速に亢進し、スパイクとACE2の複合体が肥大化した初期エンドソームに蓄積された。エンドソーム輸送の転換は、COVID-19に対する抗うつ剤の保護効果と一致する単純な細胞生物学的メカニズムを提供している可能性があり、抗うつ剤の治療および予防の可能性を強調している。
本文
COVID-19の大パンデミックから 1年以上が経過し、世界のほとんどの国で、日常生活の混乱、深刻な経済の悪化、未曾有の医療危機がもたらされている。比較的迅速なCOVID-19ワクチンの開発は一般的に成功したと考えられているが、ワクチンの入手可能性は、製造、保管、流通に関わる物流の難しさによって制限されているのが現状である1。そのため、安価で入手しやすく、安全なCOVID-19に対する薬剤を再利用することは、医療上の大きな課題となっている。
抗うつ薬は、いくつかの事後臨床試験で重症のCOVID-19に対する予防効果が認められており3,細胞モデルではSARS-CoV-2の感染と複製を阻害する可能性がある4-7。その中でも、ジェネリックの選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）であるフルボキサミンは、第2相試験8と実世界試験9で重症のCOVID-19に対する予防効果が示され、現在、第3相試験が行われている10。フルボキサミンの予防効果は、小胞体ストレスやシグマ受容体の活性化による免疫応答の調節11,あるいは酸性スフィンゴミエリナーゼの遮断7,12,13との関連が示唆されているが、根本的な細胞生物学的メカニズムは不明のままである。
SARS-CoV-2の膜輸送を薬理学的に調節することで、COVID-19の治療と予防の両方が可能になるのではないかと考えられており、フルボキサミンなどの候補薬が挙げられていた14。フルボキサミンのCOVID-19に対する有効性を示唆する臨床データが出てきたことから、細胞株を用いてフルボキサミン処理が膜輸送に及ぼす影響を評価した。そのために、HEK293T細胞をさまざまな濃度のフルボキサミンで処理した。フルボキサミンの標準的な投与では、脳内の薬物濃度がかなり高くなるが（10 uM）15,血漿中の濃度ははるかに低いため16,一連の濃度を用いた。1時間の処理により、膜FM色素の取り込みで測定したエンドサイトーシスが大幅に増加した（図1a,b）。驚くべきことに、この増加は、血漿濃度の約1/5に相当する80 nMのフルボキサミンで明らかになった16。
エンドサイトーシスの亢進を確認するために、液相の生物学的に不活性なエンドサイトーシスマーカーである蛍光デキストランFluoroRubyの取り込みも測定した。低濃度のフルボキサミンを投与すると、FM色素の取り込みに対する効果と同様に、FluoroRubyの取り込みが有意に増加し、膜面積とエンドサイトーシスの体積の両方が増加したことが確認された（図1c,d）。高濃度のfluvoxamineを投与すると、細胞の丸みや剥離が見られ（データは示さず)細胞毒性の可能性が示された。これらの観察結果を総合すると、治療量以下のフルボキサミンが非特異的な方法でエンドサイトーシスを急速に変化させる可能性が示唆される。
フルボキサミンの効果が非特異的であることから、以前に仮定されたように、フルボキサミンがSARS-CoV-2のトラフィッキングにも影響を与える可能性が示唆された14。この可能性を検討するために、ヒトSARS-CoV-2受容体ACE218を発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトしたHEK293T細胞に、組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質17を内在させる様子をイメージングすることで、SARS-CoV-2の侵入の主要なステップを再現した。流体相および膜エンドサイトーシスへの影響と同様に、80nMのフルボキサミンを1時間インキュベートすると、スパイクタンパク質の内部化が有意に増加した（表面でのスパイク標識に対する内部標識の比率で測定）（図1e,f）。表面に結合したスパイクタンパク質の相対的なレベルは、1時間の処理では変化しなかった。つまり、ACE2の表面への結合と、内在化したACE2の細胞膜へのリサイクルは、薬物処理の影響を受けていないことが示唆された（図1g）。これらの結果から、フルボキサミン処理はスパイクタンパク質のエンドサイトーシスをアップレギュレートすると結論づけられる。
エンドサイトーシス後、内包されたカーゴは初期エンドソームに進み、そこで細胞表面にリサイクルされるか、後期エンドソームやリソソームに輸送されるかの選別が行われる。初期エンドソームを通過することは、コロナウイルスの感染において重要な段階であると考えられている12,19-22。フルボキサミン処理が初期エンドソームに及ぼす影響を調べるために、細胞を正規の初期エンドソームマーカーであるEEA1で免疫染色した。以前に発表されたデータ19と同様に、内部に取り込まれたスパイクタンパク質はEEA1陽性のパンクタと共局在しており、SARS-CoV-2の輸送には初期／リサイクルエンドソームが関与している可能性が高いことが示唆された（図1h）。一方、後期エンドソームマーカーLAMP1の免疫染色で示される後期エンドソームの形態には目立った影響はなかった。このように、低用量のフルボキサミンは、後期エンドソームではなく初期エンドソームでの輸送を促進する可能性がある。
SARS-CoV-2の膜輸送を調節する候補として、さらに2つの抗うつ薬が同定された14。SSRIのサートラリンと三環系薬剤のイミプラミンである。これらの抗うつ薬は、最近、上皮細胞におけるSARS-CoV-2の感染を阻止することが明らかになった7。これらの薬剤のエンドサイトーシスへの影響は，上述のようにして検証した。低治療濃度のサートラリン（80nM）およびイミプラミン（200nM）で処理すると、FM色素の取り込みで明らかなように、エンドサイトーシスが増加した（図S1b,c）。高濃度のセルトラリンでは、FM色素の取り込みは増加しなかった。これは、細胞毒性、または以前に報告されたダイナミン機能の阻害とエンドサイトーシスの遮断のいずれかと一致している23。したがって、エンドサイトーシスのグローバルなアップレギュレーションは、低用量の抗うつ薬治療の一般的な特徴を表していると考えられる。
以上のように，治療濃度以下のフルボキサミンを短期間投与すると，ヒト細胞株において膜輸送が大きく変化し，初期エンドソームを介したSARS-CoV-2スパイクタンパク質のエンドサイトーシスへの取り込みが促進されることが明らかになった。この結果は、体内に取り込まれたACE2とスパイクの複合体が、後期エンドソーム/リソソームから初期エンドソーム/リサイクルエンドソームに再ルーティングされるというメカニズムと一致する（図1i）。SARS-CoV-2の感染と放出において後期エンドソーム/リソソームが新たな役割を果たしていることを考えると12,20,24-28,初期/リサイクルエンドソームに優先的に滞留することが、フルボキサミンの臨床的有用性の根拠となる細胞生物学的な枠組みを提供しているのかもしれない。しかし、この細胞生物学的プロセスの分子メカニズムはまだ解明されていない。シグマ受容体に依存しない作用機序は、低濃度のフルボキサミン（シグマ受容体アゴニスト）とセルトラリン（シグマ受容体アンタゴニスト）の作用が類似していることからも裏付けられる。マイクロモル濃度では，フルボキサミン，セルトラリン，イミプラミン，その他の抗うつ薬や抗精神病薬は，酸性スフィンゴミエリナーゼ（FIASMA）の機能的阻害剤として作用する可能性がある29。もう一つの注目すべき可能性は，脂質二重層との親和性による細胞膜特性の直接的な制御である30。
今回の研究では、以前に発表された候補リスト14からの薬剤のみを対象とし、その中でも臨床的な可能性を秘めたフルボキサミンに焦点を当てた。しかし、実験室や臨床の現場では、他の抗うつ剤の治療効果の可能性が示唆されている3-5,7,12。SARS-CoV-2が生産的な感染経路から逸脱することは、抗うつ薬が重症化したCOVID-19を防ぐだけでなく、そもそもSARS-CoV-2の感染を防ぐ可能性があることを意味する。中等度の精神疾患の外来治療でSSRIが広く処方されていることを考えると、一般集団におけるCOVID-19発生率の事後調査を行うことで、SSRIの予防的可能性を評価することができる。
強調しておきたいのは、査読のないCOVID-19の発表が現在も続いていることを考えると31,今回報告された知見は慎重に解釈すべきであり、主にさらなる調査のための基礎として考えるべきだということである。重要なことは、抗うつ剤によるSARS-CoV-2の膜輸送をより詳細に追跡し、生きたSARS-CoV-2粒子の感染を特徴とする生理学的に適切なシステムで検証する必要があることである32。最後に、膜輸送メカニズムへの影響が報告されていることは、抗うつ剤に関連する複数の副作用との関連性が考えられ、中枢神経系以外の精神科治療薬の細胞生物学的な検討が必要であることを示唆している33。
材料と方法
材料
細胞培養材料はGibco社製を使用した。薬剤はSigma-Aldrich社のものを使用した。FM DyesとFluoroRubyはThermo Fisher社から入手した。組換えSARS-CoV-2スパイクタンパクおよび抗スパイクマウスポリクローナル抗体は，COVID-19 Crowdfightイニシアチブを通じてPaul F. McKay博士（Department of Infectious Disease, Faculty of Medicine, Imperial College London）から提供された。次のウサギ抗体を使用した：抗EEA1，抗ACE2（GeneTex社），抗LAMP1 FITC結合（Sino Biological社），抗6xHis HRP結合（Abcam社）．二次抗体はJackson Immunoresearch社のものを使用した。
細胞培養と取り込みアッセイ
HEK293T細胞は、10%ウシ血清を添加したDMEMで培養した。実験のために、細胞はポリ-L-リジンでコーティングされた13mm丸い厚さの1.5カバースリップ上で成長させた。細胞はLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、その24〜48時間後に使用した。取り込み実験はすべて37℃で行った。取り込み実験では，プローブを培養液で希釈し，指示濃度の薬剤またはビヒクル（DMSO）の存在下でカバースリップに加え，指示時間経過後に使用した。FM色素（FM4-64fxおよびFM1-43fx）は最終濃度20ug/ml、FluoroRubyは最終濃度0.1% w/v、スパイクタンパク質は最終濃度0.14ug/mlで使用した。FM色素とFluoroRubyの取り込みを測定するために、細胞を固定し、マウントし、さらに処理をせずに画像化した。
免疫細胞化学と顕微鏡検査
すべての手順を室温で行った。細胞をPBS中の4% w/vパラホルムアルデヒドで10分間固定し、ICCバッファー（PBS中の0.1% w/v Triton X-100,5% w/v horse serum）で浸透させ、一次抗体で1時間染色した。以下の抗体希釈液（v/v）を使用した。1/1000 (抗スパイク), 1/1000 (抗6xHis), 1/500 (抗ACE2), 1/400 (抗EEA1), 1/400 (抗LAMP1). スパイクタンパク質の取り込みを測定するために、細胞を固定し、表面プールを標識するために抗6xHis抗体で30分間免疫染色し、伝染させ、抗スパイク抗体で30分間免疫染色し、全スパイクプールを標識した。表面および全体のACE2を測定するために、カバースリップを固定する前に30分間スパイクタンパクでライブラベルし、ACE2の表面プールを標識した。固定と伝染処理の後、カバースリップを抗ACE2抗体で標識し、ACE2の総プールを可視化した。最後に、カバースリップを抗ウサギ-Alexa Fluor 488および抗マウスAlexa Fluor 594の二次抗体と30分間インキュベートした。カバースリップをFluoromount-G培地（Southern）にマウントし、EVOS M7000 Wideefield Imaging System（Thermo Fisher）で100倍の対物レンズを用いて画像を撮影した。画像の定量化はImageJで行った。スパイクの内部化を測定するために、スパイクの全標識の強度を、表面のスパイク標識の強度で割った。すべてのデータは、ビヒクル処理したサンプルの中央値で正規化した。
統計解析
データセットは、少なくとも3回の独立した実験の結果を示す。統計解析は、Prism 6.0cソフトウェアパッケージ（GraphPad Software）を用いて行った。データの分布は、正規性を評価した。正規分布しているデータセットについては，Student’s t-test，1-way ANOVA，Holm-Šidák’s post-testを，そうでない場合は，Mann-Whitney rank test，Kruskal-Wallis test，Dunn’s post-testを用いた。データセットは，中央値に線を引いた散布図，あるいは累積確率図として表示した。