イオタ-カラギーナンはSARS-CoV-2を中和し、試験管内試験でのウイルス複製を抑制する。

強調オフ

うがい 鼻スプ 消毒剤

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Iota-carrageenan neutralizes SARS-CoV-2 and inhibits viral replication in vitro

pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33596218/

要旨

ワクチンやその他の有効な予防・治療法がない場合、重症急性呼吸器症候群関連新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)は依然として公衆衛生上の重要な脅威である。SARS-CoV-2を含むコロナウイルスの付着・侵入は、主にスパイク糖タンパク質を介して行われている。ここでは、イオタカラギーナンがSARS-CoV-2スパイク擬型レンチウイルスの細胞侵入を用量依存的に抑制できることを示した。SARS-CoV-2スパイク疑似型レンチウイルス粒子は、IC50値2.6μg/mlのイオタ-カラギーナンで効率的に中和された。患者単離野生型SARS-CoV-2ウイルスを用いた実験では、同様の範囲で複製の阻害が認められた。イオタ-カラギーナンの様々なライノウイルスおよび風土病コロナウイルスに対する試験管内試験データは同様のIC50値を示し、イオタ-カラギーナンを含む鼻腔スプレーが様々な呼吸器ウイルスによって引き起こされる感冒の症状の重症度と持続時間を減少させることを示し、臨床的な有効性を示した。以上のことから,SARS-CoV-2スパイク偽型レンチウイルスおよび複製能を有するSARS-CoV-2の試験管内試験データは,イオタカラギーナンの投与がSARS-CoV-2感染症の有効かつ安全な予防・治療法である可能性を示唆している。

引用

Morokutti-Kurz M, Fröba M, Graf P, Große M, Grassauer A, Auth J, er al)。 (2021) イオタ-カラギーナンはSARS-CoV-2を中和し、試験管内試験でのウイルス複製を阻害する。このような研究は、日本での研究成果の一つである。

編集者

スティーブン・J・ポリアック、ワシントン大学、アメリカ合衆国

受理された

August 4, 2020; Accepted. 2020年11月24日; Published. 2021年2月17日

Copyright

© 2021 Morokutti-Kurz er al)。 この記事はクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されたオープンアクセス記事である。

データの利用可能性

すべてのは、原稿とその支援情報ファイルに含まれている。

資金提供

本研究は、オーストリア科学振興庁(FFG)プロジェクト番号 880687 (www.ffg.at) の共同資金提供を受けた。Marinomed Biotech AG (www.marinomed.com) は、Marinomed Biotech AG に雇用されているすべての著者の給与という形で支援を提供した。Marinomed Biotech AG は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成、および原稿の処理費用への資金提供の役割を果たした。この研究は、ドイツ研究評議会から米国への大学院プログラム GRK 2504 の支援を受けており、フリードリヒ・アレキサンダー大学の博士号取得のための要件の一部を満たすために実施された。この研究は、ドイツ研究評議会の大学院プログラムGRK 2504の支援を受けて行われたもので、博士号取得のための要件の一部を満たしている。

競合する利益

著者はジャーナルのポリシーを読み、Andreas Grassauer、Eva Prieschl-Grassauer、Philipp Graf、Martina Morokutti-KurzがMarinomed Biotech AGに雇用されていることを宣言する。Andreas Grassauer と Eva Prieschl-Grassauer は Marinomed Biotech AG の共同創立者である。Andreas Grassauer、Eva Prieschl-Grassauer、およびMartina Morokutti-Kurzは、原稿の内容に関連する特許出願の発明者であり、この特許出願の番号はEP20186334である。イオタカラギーナンを含有するいくつかの市販品が、異なるブランド名で40カ国で入手可能である。これらの製品については、Marinomed Biotech AGが財務的利害関係を表明している。このことは、データと資料の共有に関するPLOS ONEのすべてのポリシーを著者が遵守することを変更するものではない。

序文

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV-2)の世界的な蔓延により,公衆衛生上の重要な脅威とされるパンデミック状況が発生している[1-4].SARS-CoV-2はSARS-CoV-1と密接な関係にあるベータコロナウイルスである。SARS-CoV-2のスパイク糖タンパク質(SGP)の配列はSARS-CoV-1のSGPとは大きく異なるが、両者は同じ受容体であるヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)に結合する。hACE2に結合すると、プロテアーゼTMPRSS2がSGPを修飾し、エンベロープ融合とウイルスの侵入を可能にする [5]。このかなり特異的なメカニズムに加えて、多くのウイルス(一部のベータコロナウイルス属を含む)は細胞接着コレセプターとして細胞多糖類を使用し、ウイルスが細胞表面に接着することを可能にしている。この非特異的相互作用により、ウイルス粒子の局所濃度が上昇し、より高い感染率につながる。

すべての呼吸器ウイルスは、細胞表面に到達するために粘液と呼吸液の物理的障壁を通過しなければならないという点で共通している。ウイルスは正の電荷を利用して負に帯電した細胞表面に到達するという仮説が立てられている[6]。イオタカラギーナンのようなポリアニオン性分子は、ウイルスが細胞表面に向かって移動する際に、ウイルスを捕捉する方法を提示している可能性がある。この現在の知見は、ウイルスとカラギーナンとの間の直接的な相互作用が、細胞の感染を効率的に阻害するために必要であることを示す一連の実験によって裏付けられている(Grassauer et al 2008,Leibbrandt et al 2010,Graf et al 2017)。カラギーナンの活性は、ウイルス粒子が最初に鼻腔に入ったときに中和する能力、および新たに合成されたウイルス粒子が感染した細胞から放出されたときに中和する能力に基づいている。イオタ-カラギーナンのような大きなポリアニオン性分子には薬理学的、免疫学的、毒性学的活性がなく、また吸収や代謝がないため、安全な抗ウイルス外用剤となっている。

イオタ-カラギーナンの抗ウイルス活性は、様々な呼吸器ウイルスに対して試験管内試験で実証されている[7-9]。これらの試験管内試験データの臨床効果への移行性は、4つの臨床試験で評価されている[10-14]。

イオタカラギーナンを含む点鼻スプレーの有効性と安全性は、感冒の初期症状に苦しむ 600 人以上の小児および成人を対象に研究されていた。すべての試験において、プラセボと比較して、イオタ-カラギーナン投与群ではさまざまな呼吸器ウイルスのウイルス負荷が有意に減少していることが実証されており、試験管内試験での中和データとヒトの呼吸器感染症に対する有効性の架け橋となっている。さらに、この力価の低下は、verum投与群において症状の重症度や期間、再発の回数を減少させることで、臨床的にも明らかになった。安全性に関しては、イオタ-カラギーナン投与群とプラセボ群との間に差はなかった[6]。

SARS-CoV-2は非常に感染性が高く病原性が高いため、生きたウイルスの取り扱いにはバイオセーフティレベル3(BSL3)の封じ込めが必要である。そこで、我々は最近開発された高力価SARS-CoV-2スパイク擬型レンチウイルス(SSPL)を利用して、我々のBSL2実験室で潜在的な阻害剤をスクリーニングした。付着およびエントリは、導入の効率と直接相関するルシフェラーゼレポーター活性を介して測定することができる。このレンチウイルスシステムを用いて、様々な硫酸化多糖類がウイルスの付着と侵入を阻害する能力を試験した。さらに、最も有望な候補であるイオタ-カラギーナンの野生型(wt)SARS-SoV-2に対する抗ウイルス活性をVero細胞で調べた。

本研究で得られた知見は、SARS-CoV-2対策や臨床応用の可能性を示唆するものである。

材料と方法

SARS-CoV-2 スパイク偽型レンチウイルス(SSPL

疑似型粒子は、BPS Bioscience, San Diego CA92121 Catalog#: 79942から入手した。この疑似ウイルスは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質(Genbank Acccession #QHD431416.1)およびCMVプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。したがって、スパイクを媒介とする細胞侵入は、ルシフェラーゼレポーター活性を介して測定することができる。SARS-CoV-2スパイク疑似型レンチウイルスは、BSL2施設において、SARS-CoV-2に対する中和抗体の活性を測定するように設計されている。

中和試験

疑似型ウイルスは、製造者の指示に従って使用した。約7500個のACE2-HEK293細胞/ウェルを、SARS-CoV-2 Spike疑似型レンチウイルス(Lucレポーター)の750個の感染性粒子(MOI=0.1)で感染させた。ウイルスは、感染の30分前に緩衝液(コントロール)または試験物質とインキュベートした(濃度「ウイルス接触」として指定)。感染のために、10%FCS(Merck KGA、ドイツ)4mMグルタミン(Merck KGA、ドイツ)1mMピルビン酸ナトリウム(Merck KGA、ドイツ)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Merck KGA、ドイツ)を含む細胞培養液(MEM(Merck KGA、ドイツ))を5体積添加し、その結果、被験物質の初期濃度を1:6に希釈した。(感染24時間後、培地を新鮮な細胞培養液に変更した。感染後48時間後、プレートを凍結/解凍して溶解した後、ルシフェラーゼ試薬(Bright Glow, Promega, Madison, WI)を細胞に添加し、BMG Fluostarマイクロプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。模擬感染細胞および感染した、模擬処理した(0.5% NaCl)細胞は、陽性および陰性対照として機能した。ルシフェラーゼデータは、同一のセットアップを有するパラレルプレートから誘導された代謝データ(アラマーブルー)で日常的に補正した。

ヒトコロナウイルスOC43 (hCoV-OC43)

hCoV OC43をATCCから入手し、ATCCから購入したVero(胚性アフリカ緑猿腎)細胞で増殖させた。細胞は、4mMのL-グルタミン(Merck KGA、ドイツ)を補充したOptiPro血清遊離培地(Life Technologies Thermo Scientific、Waltham、米国)中で培養した。ウイルス株を-80℃で凍結し、ウイルス力価を終点滴定アッセイにより決定した。

ウイルス還元アッセイ

アッセイは、別の場所に記載されているプロトコル[9]からhCoV OC43に適応させた。要するに、ウイルスは、感染のためにベロ細胞の単層に添加する前に、ポリマーコントロール溶液の半対数希釈シリーズで30分間プレインキュベートされた。RTで45分間の感染期間の後、接種物を除去し、細胞を被験物質を含む培地でオーバーレイし、次いで37℃で培養した。染色は、一次抗体としてhCoV-OC43核タンパク質に対する抗体(Merck #MAB9013)を用いて固定細胞上で行い、次いで馬ダイコンペルオキシダーゼ標識検出抗体(Thermo Scientific #31430)および基質としてTMBを用いた。検出には、BMG Fluostarマイクロプレートリーダーを使用した。被験物質の有効性を直接比較できるように、XLfit Excelアドインバージョン5.3.1を用いて、各サンプルのIC50値をシグモイド用量反応モデルで計算した。

SARS-CoV-2PR-1

61歳の患者から単離されたウイルス株SARS-CoV-2PR-1を、[15]に記載されているようにベロB4細胞で増幅した。ウイルス力価は、終点滴定アッセイによって決定した。新しいウイルスストックの生成のために、細胞培養上清を含むウイルスを72 hpi収穫し,0.45 μmの細孔サイズのフィルターを通過させた。ウイルスストックは、さらなる使用まで-80℃で保存した。ウェスタンブロット分析のために、Vero B4細胞をSARS-CoV-2PR-1(感染の多重度(MOI = 0.02))に1時間感染させ、洗浄し、さらに介入で処理した。72 hpi、ウイルス含有細胞培養上清を収穫し、放出されたビリオンを20%(w/v)スクロースクッション(20,000×g、4℃、90分)を介して精製した。

SARS-CoV-2PR-1ウイルスストックの力価決定のために、Vero B4細胞を72時間かけてウイルスストックの連続希釈液で感染させた。その後、細胞を固定(4%PFA)伝染(0.5%Triton/PBS)ブロック(1%BSA/PBS-T)し、最後にSARS-CoV-2 NP抗体(Biozol)で染色した。ウイルス感染の終点を蛍光顕微鏡で分析し、ウイルス力価をReed and Muench [16]の方法で計算した。

ウイルス還元アッセイ

ベロB4細胞を、10%(v/v)不活化ウシ胎児血清(FCS)2mM l-グルタミン、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中で維持した。ベロB4細胞のコンフルエントモノレイヤーを、FCSフリーDMEM中で,0.02のMOIで1時間、フィールド単離SARS-CoV-2PR1に感染させた。入力されたウイルスを除去するために、細胞を洗浄し、その後、介入で処理した。感染72時間後、細胞をラジオ免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー(150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 8.0,1% NP-40,0.5% Na-デオキシコール酸,0.5% Na-デオキシコール酸,0.5% Na-デオキシコール酸,0.5% Na-ドデシル硫酸ナトリウム)中で溶解した。 1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むプロテアーゼ阻害剤カクテルComplete(Roche, Basel, Switzerland)、5mM N-エチルマレイミド(NEM)、および1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)を含有し、ウェスタンブロット分析のためにさらに使用した。

SDS-PAGEおよびウェスタンブロット

タンパク質サンプルをSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜上に転送し、3%ウシ血清アルブミンでブロックし、適切な一次抗体(Ab)でインキュベートした。ウイルスタンパク質は、回復期のSARS-CoV-2患者血清に由来する抗体によって検出された。ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合した抗ヒト二次抗体は、Dianova(ドイツ、ハンブルグ)から入手した。

細胞生存率の評価

感染した細胞および処理した細胞のバイアビリティを、製造業者の指示に従って水溶性テトラゾリウム塩(WST)-1アッセイ(ロシュ)によって評価した。

qRT-PCRによる放出されたウイルスからのウイルスRNAコピーの量の決定

ウイルスは、Ambion(Cat: 4387424)ソフトウェアv2.3(Applied Bioscience)からのリアルタイムPCR AgPath-ID One-Step RT-PCR Kitを用いて定量した。PCRプライマーは[17]に従って使用した。RdRp_fwd. 5′-TG-ARA-TGG-TCA-TGT-GTG-GCG-3′およびRdRp_rev 5′-CAR-ATG-TTA-AAS-ACA-CTA-TTA-GCA-TA-C-3′を用いた。プローブは5′-CAG-GTG-GTG-GAA-ZEN/CCT-CAT-CAG-GAG-ATG-C-3′(ラベル:FAM/IBFQアイオワブラックFQ)であった。ポジティブコントロールとして、SARS-CoV2のEおよびRdRp遺伝子に特異的なターゲットを使用し、Integrated DNA Technologies社製のものを使用した。対照として、SARS-CoV2のEおよびRdRp遺伝子を使用した。5´-TAA-TAC-GAC-TC-ACT-ATA-TGT-TAA-ACC-AGG-TGG-AAC-CTC-ATC-AGG-AGA-TGC-CAC-AAC-TGC-TTA-TGC-TAA-TAG-TGT-TT-TAA-CAT-を用いた。 TTG-GAA-GAAG-ACA-GT-ACG-TA-ATA-GTT-AAAT-AGC-GTA-CT-TC-GTG-GTA-TTC-TG-CTA-GTT-ACA-CTA-GCC-ATC-TT-ACT-CG-TT-CGA-TG-GT-GC-TGC-AT-ATT-GTT-3´。

阻害剤

イオタ-、カッパ-およびラムダ-カラギーナンは、Dupont旧FMC Biopolymers(ともにフィラデルフィア、PA)から購入した。Undaria pinnatifoliaおよびFucus vesiculosisからのフコイダンはMarinova(Marinova Pty Ltd、オーストラリア)から、カルボキシメチルセルローズ(CMC)はMare Austria GmbHから、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)はFagron(Fagron BV、オランダ)から、ガラクトース-4-硫酸塩はMerck KGA(ドイツ)から購入した。乾燥ポリマー粉末を,0.5% NaCl(Merck KGA、ドイツ)を含む最終濃度2.4mg/mlになるように細胞培養水(B Braun Melsungen AG、ドイツ)に溶解した。このストック溶液を0.22mmフィルター(SARStedt、ドイツ)で無菌濾過し、使用するまで4℃で保存した。

野生型のSARS-CoV-2ウイルスの試験のために、1.2 mg/mlイオタカラギーナンを含む市販の鼻腔スプレーを使用した。

カッパ-およびラムダ-カラギーナンのNMR分析

10 mgカッパおよびラムダカラギーナンのサンプルを、NMR測定のためにSpectral Services, Kölnに送った。簡単に言えば、10mgの物質を、3-(トリメチルシリル)プロピオン酸-d4ナトリウム塩(標準として0.01%)を含む1mlのD2Oに溶解した。1Hスペクトルの測定は、Avance III HD 500 MHz NMRスペクトロメーター(Bruker、Billarica、MA)で行った。

結果

イオタ-カラギーナンはSARS-CoV-2スパイク疑似型レンチウイルス(SSPL)粒子を中和する
イオタ-カラギーナンがSSPLを持つ細胞の感染をブロックできるかどうかを決定するために、我々は感染前に30分間,0.5%NaCl溶液に溶解した10μg/mlのイオタ-カラギーナンでウイルス粒子をインキュベートした。感染のために、この混合物は、5ボリュームの培地の添加によってメーカーのプロトコルに従って希釈した。模擬感染細胞および感染した模擬処理(0.5% NaCl)細胞をそれぞれ陽性対照および陰性対照とした。さらに、PCRによりSARS-CoV-2陽性と判定された患者の血清を試験した。この患者の血清は、SARS-CoV-2のSGPおよび核タンパク質に特異的なIgG ELISAで血清化を示した。この血清はウイルスを効果的に中和したが 2011年の対照血清はウイルス感染に影響を与えなかった(図1)。血清は1:15希釈で使用した。82%の中和能を持つ10μg/mlのイオタカラギーナンは、1:15希釈した抗血清と同等の効果を示した(86%の中和能を持つ)。これらの結果は、低濃度のイオタ-カラギーナンがSSPL粒子を中和することができることを示している。

図1 SARS-CoV-2偽型レンチウイルスの中和。

中和血清および陰性血清と比較したイオタカラギーナンによる中和アッセイ。約7500個のACE2-HEK293細胞/ウェルを,0.1のMOI(Lucレポーター)でSARS-CoV-2 Spike偽型レンチウイルスに感染させた。モック感染細胞およびモック処理した感染細胞は、それぞれ陰性対照および陽性対照として機能した。10μg/mlイオタカラギーナンと1:15に希釈した血清を感染前にウイルスとインキュベートした。感染のために、ウイルス/ポリマーまたはウイルス/血清の接種液を5体積の培地で希釈した。感染後48時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、感染効率を測定した。ルシフェラーゼデータは、同一のセットアップを有するパラレルプレートから誘導された代謝データ(アラマーブルー)で補正した。データは陽性コントロールの%に正規化し、標準偏差を示した3倍体の平均値を示した。

イオタ-カラギーナンによるSSPL粒子の中和は用量依存性がある。

図2に示すように、イオタ-カラギーナンの中和活性は用量依存性があり、IC50は2.6μg/mlであった。10μg/ml以上のイオタ-カラギーナン濃度では、80%以上のシグナルの減少が見られ、この濃度以上のプラトーを示している。興味深いことに、わずか1μg/mlのイオタ-カラギーナンの存在は、20%以上の感染性の検出可能な減少をもたらした。

図2 IC50の決定

 

イオタカラギーナン(100μg/ml〜0.33μg/ml)の滴定およびIC50の決定。ACE2-HEK293cells/wellを,0.1のMOI(Lucレポーター)でSARS-CoV-2 Spike擬型レンチウイルスに感染させた。モック感染細胞およびモック処理された感染細胞は、それぞれ陰性対照(感染0%)および陽性対照(100%感染対照)として機能した。感染前に、ウイルスを異なる濃度のイオタカラギーナンで30分間インキュベートした。感染後48時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより感染効率を決定した。ルシフェラーゼデータは、同一のセットアップを有するパラレルプレートから得られた代謝データ(アラマーブルー)で補正した。データは、3倍体の平均値±標準偏差を示す。赤線はIC50の決定を示す。

他の硫酸化および非硫酸化ポリマー、ならびに低分子量硫酸化糖とのイオタ-カラギーナンの比較。

いくつかのポリマーを、SSPL粒子を中和する能力について試験した(図3)。イオタカラギーナンは10μg/mlでウイルスを効果的に阻害したが、カッパカラギーナンおよびラムダカラギーナンは100μg/mlでのみ活性であった。2つの異なる種、Undaria pinnatifidaおよびFucus vesiculosusからの高分子量フコイダンは、より高い濃度(100μg/ml)での感染の50%未満の減少をもたらした。硫酸基を持たないポリマー、カルボキシメチルセルロース(CMC)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は、このアッセイにおいて不活性であった。また、低分子量の硫酸化糖であるガラクトース-4-硫酸もSSPLを中和しなかった。

図3 イオタ-カラギーナンと他のポリマーおよび硫酸化糖との比較

 

他の硫酸化および非硫酸化ポリマーおよび硫酸化糖と比較したイオタ-カラギーナンの中和アッセイ。ACE2-HEK293cells/wellを、SARS-CoV-2 Spike擬型レンチウイルス(Lucレポーター)に感染させた。モック感染細胞およびモック処理された感染細胞は、それぞれ陰性対照(0%感染)および陽性対照(100%感染対照;y軸)として機能した。100μg/mlおよび10μg/mlの硫酸化ポリマーおよび100μg/mlの非硫酸化ポリマーおよびガラクトース-4-硫酸塩を、感染前に30分間ウイルスとインキュベートした。感染効率は、感染48時間後のルシフェラーゼ活性を測定することにより決定した。ルシフェラーゼデータは、同一のセットアップのパラレルプレートから得られた代謝データ(アラマーブルー)で補正した。データは、三倍体の平均値±標準偏差を示す。Abbr. イオタ-カラギーナン(Iota-carr. (イオタ-カラギーナン)、カッパ-カラギーナン。(カッパ-カラギーナン)、ラムダ-カラギーナン、Fuc.U.p. (Undaria pinnatifida由来の高分子量フコイダン)、Fuc.F.v. (Fucus vesiculosus由来の高分子量フコイダン)、CMC (カルボキシメチルセルロース)、HPMC (ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、およびGal-4-SO4 (ガラカトース-4-硫酸塩)。

カッパおよびラムダ生成物の組成は、これらの調製物にイオタ-カラギーナンが存在するかどうかを評価するために、NMR分析によって決定された。驚くべきことに、カッパ-カラギーナンは16%、ラムダ-カラギーナンは27.3%のイオタ-カラギーナンを含んでいた(表1)。

表1 カッパおよびラムダカラギーナン調製物のNMR分析の結果

 

イオタカラギーナンは抗ウイルス活性を示す SARS-CoV-2

SSPLで得られた結果がSARS-CoV-2ウイルスにも当てはまるかどうかを調べるために、ベロB4細胞をSARS-CoV-2PR-1に感染させた。感染の1時間後に、入力ウイルスを除去し、鼻腔内スプレーの希釈液を細胞に添加した。感染3日後(dpi)細胞培養上清を収穫し、ウイルス産生をウエスタンブロット(図4A)または定量PCR(図4B)により分析した。予想通り、カラギーナンでの処理は、SARS-CoV-2複製の強力な減少をもたらした。最も低い濃度の3.75μMのイオタ-カラギーナンでは、子孫ウイルスの産生はほぼ完全にブロックされた。

図4 イオタカラギーナンはベロB4細胞におけるSARS-CoV-2の複製を制限する。

(A): カラギーナンの濃度を増加させて3日間処理した後のウイルス画分(NP = Nucleoprotein)のウエスタンブロット分析。ベロB4細胞をSARS-CoV-2にMOI 0.2で感染させた。感染およびその後の入力ウイルスの除去の1時間後に、細胞を異なる濃度のカラギーナンで処理した。3日後、細胞を収穫し、3つの独立した実験からのウイルスを精製し、SARS-CoV-2回復血清を用いたウエスタンブロットで分析した。ウェスタンブロットの密度分析は、AIDA®を用いて行った。棒グラフは、3つの独立した実験の平均値、±標準偏差を示す。(B): 精製されたビリオンのリアルタイムPCR分析。実験は図4Aに記載したように行った。精製されたビリオンをリアルタイムPCRを用いて分析した。3つの独立した実験の結果±標準偏差を示す。

カラギーナンはベロB4細胞に細胞毒性を示さない

細胞生存率に対するカラギーナン処理の潜在的な非特異的影響をコントロールするために、感染していないベロB4を用いて水溶性テトラゾリウム塩(WST)-1アッセイを、それ以外の条件で同一条件下で行った。その結果、SARS-CoV-2の複製を効果的に抑制する濃度で処理しても、細胞生存率に影響を与えないことがわかった(図5)。また、試験した最高濃度でも細胞生存率の50%低下が認められなかったため、TD50を決定することはできなかった。アポトーシス誘導剤として知られているスタウロスポリンを1μMの濃度でポジティブコントロールとして使用した。

図5 ベロB4細胞の細胞生存率に対するカラギーナンの影響

 

異なる濃度のカラギーナン(イオタ-カラギーナン濃度をx軸に示す)で3日間処理した後、細胞生存率への影響を水溶性テトラゾリウム塩(WST)-1アッセイで測定した。棒グラフは3つの独立した実験の平均値±SDを示す。スタウロスポリンをポジティブコントロールとして使用した。

SARS-CoV-2およびhCoV OC43のιおよびカッパカラギーナンに対する感受性の比較

SARS-CoV-2とhCoV OC43はともにβ-コロナウイルス科の属に属する。SARS-CoV-2が2019年後半に新たに出現したのに対し、hCoV OC43は1967年に同定された[18]。hCoV OC43への感染は通常、一般的な風邪症状を引き起こし、重症化するとまれにウイルス性肺炎を引き起こす。コロナウイルスは感冒患者から一般的に検出され、通常、症例の10~15%を占める。イオタカラギーナンを含む点鼻スプレーを用いた臨床試験では、ウイルス陽性の被験者の30%以上がhCoV OC43または229E(α-コロナウイルス)のいずれかに感染しており、これら、2つのウイルス亜型は50:50の割合で均等に分かれてた。これらの臨床試験では、コロナウイルスに対する有効性が明確に示された。そこで、臨床的に感受性の高いhCoV OC43に対するイオタ-カラギーナンおよびカッパ-カラギーナンの試験管内試験中和能とSSPLに対する中和能を比較したいと考えた。hCoV OC43を用いた細胞培養アッセイを確立し、ウイルス複製に対するイオタ-カラギーナン、カッパ-カラギーナンおよびカルボキシメチルセルロース(CMC)の効果を試験した。ポリマーは100μg/mlから0.007μg/mlまで滴定した。100μg/mlのカッパ-カラギーナンは50%未満の阻害をもたらしたが、イオタ-カラギーナンは用量依存的に0.33μg/mlのIC50値を持つhCoV OC43複製を阻害した。同様に、SARS-CoV-2複製の90%以上の減少は、対照ポリマーCMCがいかなる阻害も示さなかったのに対し、3.5μg/mlのイオタ-カラギーナン濃度で達成された。これらのデータは、SSPLおよびwt SARS-CoV-2がhCoV OC43と同様にイオタ-カラギーナンに対して感受性が高いことを示している(表2)。

表2 イオタカラギーナンのSSPLとCoV OC43のIC50値の比較

 

議論

本研究では、異なる硫酸化ポリマーの中和効果を試験するために、SARS-CoV-2 スパイク疑似型レンチウイルスを利用した。同様のアッセイは最近、COVID-19の活動期および回復期における血清IgGの中和能をテストするために使用された。症状のない患者と症状のある患者の両方で血清IgG抗体が中和されていたが,両群とも感染後2~3ヵ月以内に抗体レベルと中和能の低下が観察された。著者らは、観察された抗体の減少と中和能の低下は、「免疫パスポート」を使用するリスクをもたらす可能性があり、公衆衛生上の介入の延長が必要ではないかと推測している[19]。この知見は、SARS-CoV-2に対するワクチン接種の開発に関しても重要である。したがって、長期的な中和抗体の形成とその保護能力が成功の鍵となる。これらの知見を考慮すると、イオタ-カラギーナンの中和能は、COVID-19患者の陽性血清と同じ範囲であり、可溶性ACE2受容体タンパク質と同じ範囲(IC50〜0.5〜2μg/ml; [20])であったため、予防的および治療的介入のための重要な追加の選択肢となる可能性がある。

イオタ-カラギーナンと他の硫酸化ポリマーであるカッパ-カラギーナンやラムダ-カラギーナン、フコイダンとの比較から、イオタ-カラギーナンが優れた効果を有することが示された。100μg/mlのカッパカラギーナンとラムダカラギーナンはSARS-CoV-2を効果的に中和したが,フコイダンは実質的に効果がなかった。カッパおよびラムダ-カラギーナンのNMR分析は、驚くほど高い量のイオタ-カラギーナンを明らかにした。10μg/mlでイオタ-カラギーナンは79%の中和能力を示した。100μg / mlのカッパとラムダ調製物と約80%の同様の中和に達した。これらの調製物中のイオタ-カラギーナン濃度はそれぞれ16と27μg/mlであるので、我々は、カッパ-およびラムダ-カラギーナンで観察される阻害は、主にイオタ-カラギーナンの存在によるものであるという仮説を立てた。カラギーナンの不可避的な不均一性は、構造と活性の関係についてのより深い理解を妨げるものである。個々のウイルスブロック効果について結論を出すためには、イオタ-カラギーナンを含まない、より洗練されたカッパポリマーおよびラムダポリマーを用いたさらなる研究が必要である。このデータは、天然バイオポリマーを研究する際のNMRによる品質管理の必要性をさらに強調している。

約1μg/mlのIC50で、wt SARS-CoV-2は、細胞培養で抗ウイルス効果が確立されている他の呼吸器ウイルスと同様にイオタ-カラギーナンに感受性があった。ヒトライノウイルスの力価は,感染前および感染中に5μg/mlのイオタカラギーナンを添加すると1 log以上減少した[7]。インフルエンザAウイルス、H1N1/PR8/34,H3N2愛知/2/68,nH1N1/09の阻害のIC50値は0.2~0.9μg/mlの範囲であり、CoV OC43は0.33μg/mlのIC50で阻害された。インフルエンザウイルスに関する試験管内試験データは、インフルエンザA H1N1/PR8/34感染マウスを用いた一連の生体内試験データによって支持されている。プラセボ群では10%の動物しか致死感染を免れなかったのに対し、1.2mg/mlのイオタカラギーナンを経鼻投与した群では、感染日に治療を開始した時点で70%が生存していた。感染後48時間後に投与を開始しても50%の動物が生存していた。この結果は、オセルタミビルで処理した動物と同様に、感染から 120時間後に鼻汁力価および肺力価が強く低下したという観察によっても強化された[8]。

1.2 mg/ml のイオタ-カラギーナンを含む鼻腔スプレーが、感冒の初期症状に苦しむ小児および成人を対象に臨床試験を実施した。このスプレーは、1 日 3 回、4 日間または 7 日間連続して塗布された。患者は、ヒトライノウイルス、ヒトコロナウイルス(OC43および229E)呼吸器同期ウイルス、メタニューモウイルス、ヒトインフルエンザAおよびB株、ならびにパラインフルエンザウイルス1〜3株を含むウイルス病原体の存在について、治療前および治療中(1日目および3〜5日目)に検査された。成人を対象とした1件の臨床研究では、10~11日目にウイルスの追加検査が行われた[13]。両試験で最も多かったウイルス病原体はヒトライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザAウイルスで、それぞれ59%、34.6%、18.5%であった。ウイルス陽性者の割合は、1~18歳の小児では89%であったが、成人では58%であった。成人では2種類以上のウイルス病原体が検出されたのは15%にとどまっていたが、小児では41%に増加した。1人の小児からはhCoV OC43,ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス、インフルエンザB、パラインフルエンザウイルス3の5種類のウイルスが検出された。すべての臨床試験でイオタ-カラギーナンを投与した結果、プラセボと比較してウイルス力価が強く低下した[6]。このウイルス力価の低下は、最大21日間の観察期間中に風邪症状の重症度と期間が減少し、再発が減少したことを意味している。また、患者が複数のウイルス感染症に罹患している可能性があることから、汎抗ウイルス療法がウイルス特異的治療に比べて優れている可能性が示唆された。

SARS-CoV-2は、臨床的有用性が証明されている他の呼吸器ウイルスと同じ程度に、イオタ-カラギーナンによって試験管内試験で阻害される。さらに、イオタ-カラギーナンはSARS-CoV-2に対する中和抗血清および可溶性ACE2受容体[20]と同等の効果を示している。したがって、我々のデータは、予防的または治療的にイオタ-カラギーナンを投与することで、COVID-19に苦しむヒトにおいても同様の効果が得られる可能性を示唆している。臨床データおよび市販後調査データから、イオタカラギーナンは忍容性が高く、報告された有害事象の数は非常に少ないことが示された(2013年以降、販売された10万個あたり1.07件の有害事象報告、800万個以上の販売実績)。また、万が一、新たな呼吸器ウイルスが出現してパンデミックを引き起こす可能性がある場合にも、イオタ-カラギーナンは、ウイルスの同定とワクチンや特定の抗ウイルス薬の開発の成功との間のギャップを埋めるための、最初の広く有効な治療薬としての役割を果たす可能性がある。

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