Human Herpesvirus 6 Detection in Alzheimer’s Disease Cases and Controls across Multiple Cohorts

ハイライト

• 2つのアルツハイマー病（AD）コホートからのRNA-seqデータを118個のウイルスについてスクリーニングした。
•  HHV-6Aおよび/またはHHV-6Bに対するPCR反応性について711 ADおよびコントロール脳からのDNAを分析した。
• HHV-6は、いずれの方法でも対照群と比較してAD脳にはほとんど特異性を示さなかった
• これらの補完的な方法は、HHV-6とADとの間の強い関連性を支持しない

簡潔に説明すると

Allnuttらは、711のADおよび非AD対照脳からのRNA-seqおよびPCRを用いて、118のヒトウイルスを含む病原体について、3つの独立したアルツハイマー病（AD）コホートをスクリーニングする。ADと非AD対照の間のウイルス検出の差は観察されない。

要約

ウイルス感染とアルツハイマー病との相互作用は、長い間関心の対象となっているが、因果関係を証明するには至っていなかった。最近の研究では、ヘルペスウイルス、特にヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）のアルツハイマー病における役割についての議論が新たになされている。我々は、（1）RNAシーケンシング（RNA-seq）データセットと（2）アルツハイマー病および非アルツハイマー病対照脳から抽出されたDNAサンプルを使用して、3つの独立したアルツハイマー病脳のリポジトリでHHV-6の検出をスクリーニングした。RNA-seqデータは、118種のヒトウイルスを含む25,000種以上の微生物のタクソンリファレンスに基づいて病原体のスクリーニングを行い、DNAサンプルはHHV-6AおよびHHV-6Bに対するPCR反応性を調べた。HHV-6は、どちらの方法でも対照群と比較してアルツハイマー病脳に対してはほとんど特異性を示さなかったが、エプスタインバーウイルス（EBV）やサイトメガロウイルス（CMV）などの他のウイルスは同等のレベルで検出された。これらの直接的なウイルス検出法は、HHV-6とアルツハイマー病との関連性を示唆するものではない。

はじめに

アルツハイマー病は、アミロイドβ（アミロイドβ）ペプチドの広範な蓄積、脳構造の悪化、神経炎症、および多面的に劇的な認知障害を特徴とする神経学的疾患である（Holmes, 2013; Regen et al 2017）。アルツハイマー病の主要なモデルはアミロイド病理に焦点を当てているが（Brody et al 2017,Fessel et al 2018,MoirおよびTanzi et al 2019,Walsh et al 2002年)アルツハイマー病の潜在的な感染性誘因に対する関心が新たに高まっている（Eimer et al 2018,Goldschmidt-Clermont et al 2019,QinおよびLi et al 2019,Readhead et al 2018）。肺炎クラミジア（BalinおよびHudson 2014）およびスピロカエテス（Miklossy 2015）を含む多くの病原体が本疾患と関連しているが、最も頻繁には、ヒトヘルペスウイルス6A（HHV-6A)HHV-6B、および単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）のようなヒトヘルペスウイルスがアルツハイマー病の発症に関連している（Ball、1982;HaasおよびLathe 2018;Itzhaki et al 2018;Lin et al 2018;Itzhaki et al 2018）。1997;Lin et al 2002;Liu et al 2018;Rizzo et al 2019;Romeo et al 2019a 2019b;Wozniak et al 2009）。)

HSV-1およびHHV-6はともに中枢神経系内で活性であり、HSV-1はHSV脳炎を引き起こし、HHV-6,特にHHV-6Aは、多発性硬化症、てんかんおよび脳炎を含む様々な中枢神経系疾患にリンクしている(LeibovitchおよびJacobson, 2018; Pia-centini et al 2014)。アルツハイマー病と非アルツハイマー病対照を比較した研究では、アルツハイマー病脳においてHSV-6 DNAの増加（Lin et al 2002)およびHSV-1 DNAのアミロイドβプラークとの共局在化の増加（Woz-niak et al 2009）が検出されている。アルツハイマー病サンプルは、非アルツハイマー病対照者と比較して、血中のHHV-6 IgG力価が低下し（Haas and Lathe, 2018)脳内のHSV-1の存在下で（Itzhaki et al 1997）または血漿中のHSV-1の存在下でアルツハイマー病発症リスクが増加することが明らかにされている（Lovheim¨ et al 2018）。さらに、いくつかのグループは、アルツハイマー病の遺伝的危険因子とウイルス感染によって影響を受ける遺伝子との間の重複を同定しており、例えば、HSV-1の拡散に関与する受容体（Liu et al 2018）およびHHV-6A感染に対する感受性の増加に関連するヒト白血球抗原（HLA）サブタイプ（Rizzo et al 2019）などが挙げられる。

特に2つの最近の出版物（Eimer et al 2018,Readhead et al 2018）は、アルツハイマー病の発症におけるHHV-6およびHSV-1の役割に新たな焦点をもたらした。いくつかの独立した脳バンクを通じて入手可能なRNAシークエンシング（RNA-seq）および全ゲノムシークエンシングデータの広範な解析は、HHV-6Aおよび/またはHHV-7とアルツハイマー病との間の関連を同定するために使用され、対照と比較してアルツハイマー病脳におけるウイルスRNAおよびDNAの両方の増加を引用した（Readhead et al 2018）。さらに、著者らは、ウイルス感染によってアップレギュレートされる宿主遺伝子が、アルツハイマー病リスク遺伝子と広範囲に重複していることを観察した（Readhead et al 2018）。HHV-6,HSV-1,およびアルツハイマー病との関連を支持する別の研究は、アミロイドβの凝集がHHV-6またはHSV-1のいずれかの存在によって刺激され得ることを示唆した（Eimer et al 2018）。アミロイド斑は、これらのウイルスの周囲に形成され、試験管内試験および5x家族性ADマウスモデルの両方で抗ウイルス保護効果を提供した(Eimer et al 2018)。まとめると、これらの研究は、アルツハイマー病におけるヘルペスウイルスの役割のための機械論的枠組みを提供する。

HHV-6に最近焦点を当てたアルツハイマー病における感染性誘因への新たな関心が、神経疾患とこのウイルスとの関連性に関する研究における我々の長年の経験と組み合わされていることを考えると、例えば、多発性硬化症（Leibovitch et al 2019; Virtanen et al 2014)てんかん（Virtanen et al 2018）てんかん（Bartolini et al 2018)膠芽腫（Lin et al 2016)および移植後脳炎（Yao et al 2009)それは、HHV-6Aおよび／またはHHV-6Bがアルツハイマー病の病因に関与し得るという観察を探ることは、我々にとって興味深いことであった。私たちはこの問題に2つの方法でアプローチした。(1) マウント・サイナイ・ブレイン・バンク（MSBB）と宗教的秩序研究/記憶と老化プロジェクト（ROSMAP）のRNA-seqデータセットを用いたバイオインフォマティクスデータの再解析と、(2) DNAが抽出され、ROSMAP（Ben-nett et al 2012a, 2012b）とROSMAP（Ben-nett et al 2012a, 2012b）からアクセス可能なアルツハイマー病患者と対照者のHHV-6AとHHV-6BのPCR反応性のための脳材料の直接の尋問である。2012a, 2012b）およびNIA Baltimore Longitudinal Study of Aging（Blauwendraat et al 2019）からの脳解剖を含むジョンズ・ホプキンス・ブレイン・リソース・センター（JHBRC）からアクセスした。118のヒトウイルスを含む25,000以上の微生物をスクリーニングするBroad Institute PathSeqツールをRNA-seq解析に使用した（Walker et al 2018）。HHV-6AおよびHHV-6BのPCR検出には、我々が広く使用している高感度かつ高精度の新規PCR法であるデジタルドロップレットPCR（ddPCR）プラットフォームを利用した（Leibovitch et al 2014）。3 つの独立したリポジトリからのサンプルについて PathSeq と ddPCR の相補的な方法を使用した本研究の結果は、アルツハイマー病 と非 アルツハイマー病 の対照者間でのウイルス検出にほとんど差がないことを示した。

結果

疾患の人口統計とリポジトリ

分析されたRNA-seqデータセットは、SYNAPSE上のAMP-アルツハイマー病ナレッジポータル（MSBB syn-apse ID: syn3157743; ROSMAP: syn3388564）を使用して、MSBBとROSMAPの両方から入手可能であり（表1)病原体をスクリーニングするためにBroad InstituteのPathSeqパイプラインにフィルタリングされた（Walker et al 2018）。MSBBリポジトリでは、301人の個人からRNA-seqデータが利用可能であり、その中から各個人から最大4つの異なる脳領域をスクリーニングし、合計1,027検体を得た（表1）。4つの脳領域には、前頭前野のブロドマン領域10（BM10）;上テンポラル回のブロドマン領域22（BM22）;海馬傍回のブロドマン領域36（BM36）;下前頭前野のブロドマン領域44（BM44）が含まれた（Readhead et al 2018; Wang et al 2018）。ROSMAPリポジトリーからは、背外側前頭前野からの600個の脳サンプルからRNA-seqデータが得られた（Bennett et al 2012a 2012b）（表1）。MSBBおよびROSMAPリポジトリの両方について、脳は、「アルツハイマー病なし」、「アルツハイマー病の可能性がある」、「アルツハイマー病の可能性がある」、「アルツハイマー病の可能性がある」、「アルツハイマー病の可能性がある」、「アルツハイマー病の可能性がある」、「アルツハイマー病の可能性がある」のカテゴリーで個人をランク付けするConsortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease（CERアルツハイマー病）神経病理学的分類を用いて、アルツハイマー病疾患の状態に関して分類された（表1）（Bennett et al 2012a 2012b;Wang et al 2018）。RNA-seqデータに加えて、我々は幸運にも364の脳からddPCR解析のための抽出DNAをROSMAPの脳レポジトリから入手することができた（これらの脳からのDNAは対応するRNA-seq情報を持っていなかったが）。さらに344の脳から抽出されたDNAは、243のアルツハイマー病脳と101の非アルツハイマー病対照からなる第3の脳レポジトリであるJHBRCからも入手可能であった（Blauwen-draat et al 2019）。これらのDNAサンプルは、よく特徴づけられた臨床病理学的コホート（Blauwendraat et al 2019）における神経変性疾患の遺伝子解析のために抽出された。RNA-seqデータも、このコホートでは利用できなかった。

MSBBおよびROSMAP RNA-SeqデータセットにおけるHHV-6の検出

MSBBコホートからのRNA-seqデータは、全個体301人のマルチプル脳領域から得られた。各個人の臨床データは、5領域にわたる新皮質プラーク密度（プラーク数/mm2）と、認知症の臨床的対称性を重症度別に層別化する臨床的認知症評価（CDR）スコア（Wang et al 2018）を含んでいた。個人を複合的なPlaque * CDRスコア（疾患重症度スコア）で並べると、Path-Seq結果と臨床疾患および神経病理学的疾患との間の相関を容易に可視化することができた（図-図1A）。PathSeqスコアは、分類群参照に整列したリードの数に基づいて、ある分類群が与えられたサンプル中に存在することのエビデンスの量を示す(Walker et al 2018)。これらのスコアは、Broad Institute（https:// software.broadinstitute.org/gatk/documentation/tooldocs/current/ org_broadinstitute_hellbender_tools_spark_pathseq_PathSeq ScoreSpark.php）によって定義されており、「微生物の豊富さを検出し、定量化する」ために使用される。十分な同一性スコア（例えば、読み取り長の90%）を持つアラインメントは、読み取り数と、分類学ツリーの各レベルでサンプルに存在する微生物の相対的な豊富さを推定する。1つの有効なアラインメントを持つリードには、対応する種または株に1のスコアが追加される。N個のヒットしたリードについては、1/Nのスコアが各生物に分配される。スコアは、各分類群について、すべてのリードのスコアとその子孫分類群のスコアを合計して合計される。病原体負荷は、スコアが RNA リード数に基づいているため、スコアと相関している。

MSBBコホート内のHHV-6のPathSeqスコアはかなり低く、最高スコアは33.5で、ほとんどのスコアは0から10の間に留まっていた。HHV-6のすべての陽性反応は301人中4人のサンプルから得られたものであり、そのうち2人のサンプルでは複数の脳領域でHHV-6が検出されていた（図1B）。HHV-6AとHHV-6Bの検出頻度にはほとんど差がないようである。HHV-6シグナルが検出された4人のうち3人はHHV-6AとHHV-6Bの両方を持っており、1人（人物1）はHHV-6Bのみを持っており、PathSeqスコアが1.0と低かった（疾患重症度スコアが最も低かった）（図1Aと1B）。個人2はBM22脳領域でHHV-6BのPathSeqスコアが33.5と控えめであり、個人3はBM22脳領域でHHV-6AのPathSeqスコアが23.5と同様に控えめであった（図1Aおよび1B）。疾患の重症度とPathSeqスコアとの間には相関はなかった（図1A;R2 = 0.0016）。

MSBBコホートに加えて、RNA-seqデータはROSMAPから入手可能であった。このデータセットには、様々なアルツハイマー病分類の600人の個人が含まれていた（表1）。MSBBと同様に、PathSeq解析では、ROSMAPではHHV-6の検出頻度が低く（PathSeqスコアが低い)このコホートではHHV-6Aが2つの脳からしか検出されなかった（図1C）。HHV-6Bは検出されなかった。ROSMAPおよびMSBBの両方とも、CE-Rアルツハイマー病神経病理学ガイドライン（Bennett et al 2012a 2012b;Wang et al 2018）に従ってサンプルを分類した。図1Dに示すように、HHV-6Aは、ROSMAPデータセット（図1D）では、確定的なアルツハイマー病の脳173例中1例、非アルツハイマー病の高齢対照群158例中1例のみで検出された。MSBBコホートでは、HHV-6AとHHV-6Bはアルツハイマー病が確定的な135脳のうち3脳で検出され、HHV-6Bはアルツハイマー病の可能性が高い42脳のうち1脳で検出された（図1D）。

MSBBおよびROSMAP RNA-Seqデータセットにおけるウイルス検出の特異性

HHV-6AおよびHHV-6Bに加えて、いくつかの他の中枢神経系関連ウイルスも、MSBBおよびROSMAPの両方でPathSeqによって検出された（図2）。これらには、ジョンカニンガムウイルス（JCV）（Bartsch et al 2019)ヒト免疫不全ウイルス1（HIV）（Nath 2015)エプスタインバーウイルス（EBV）（LeibovitchおよびJa-cobson 2018)およびサイトメガロウイルス（CMV）（Bookstaver et al 2017）が含まれたが、それぞれについてのPathSeqスコアはすべて7未満であった（図S1）。

任意のウイルスの検出頻度は極めて低く、アルツハイマー病（またはアルツハイマー病のサブ分類間）と非アルツハイマー病脳との間で有意な差はなかった（図2;表S1）。例えば、MSBBおよびROSMAP脳コホートでは、アルツハイマー病の確定的、可能性のある、または可能性のあるEBVを検出した脳標本のうち、それぞれ6.0%および0.9%であったのに対し、非アルツハイマー病対照の脳標本では5.8%および1.3%であった（図2）。特にMSBB群とROSMAP群では、HHV-6（HHV-6AとHHV-6Bの両方を含む）に注目したところ、アルツハイマー病が確定的、可能性が高い、またはアルツハイマー病の可能性がある脳標本のうち、HHV-6を検出したのはそれぞれ3.3%と0.2%であったのに対し、アルツハイマー病を発症していない高齢の対照群では0%と0.6%であった（図2）。ここでも、罹患脳と対照脳の間では、いずれのウイルスの頻度にも統計的な差は認められず、ウイルス特異性についても差は認められなかった。

ddPCRを用いたHHV-6スクリーニング

HHV-6とアルツハイマー病との関連をさらに調べるために、入手可能な脳切片からDNAを採取し、HHV-6AおよびHHV-6B特異的領域のPCR増幅を行った（Leibovitch et al 2014）。JHBRCコレクションからの344脳と、アルツハイマー病および非アルツハイマー病対照からなるROSMAPブレインバンクからの364脳を含む、合計708脳切片を2つの脳リポジトリから使用した（表1）。HHV-6の検出頻度は両コホートで低かった（図3）。ROSMAP非アルツハイマー病対照群では、HHV-6Aを陽性としたのは1名のみであった（図3）。また、HHV-6Bの検出頻度は、ROSMAP（c2 p = 0.55）とJHBRC（c2 p = 0.76）のコホートのいずれにおいても、アルツハイマー病と非アルツハイマー病の間で有意な差は認められなかった（図3）。HHV-6 PCR反応性の大きさもまた低く、ROSMAP（p = 0.39）またはJHBRC（p = 0.40）のいずれにおいても、アルツハイマー病と非アルツハイマー病の対照群間で差はなく、陽性脳の大部分はHHV-6/106細胞のウイルス負荷量が600コピー未満であった（図3）。興味深いのは、HHV-6のPCR反応性を検査した708個の脳サンプルの中で、5個の脳が細胞あたり約1コピーのPCR反応性を示したことである（図S2A)これらの個体はクロモソーマリー統合型HHV-6（ciHHV-6）を有していることを示唆する観察であった（Flamand, 2018）。ciHHV-6Aは、ROSMAPコホートからの3つの脳（アルツハイマー病患者1人とアルツハイマー病非対照2人）で検出されたのに対し、ciHHV-6BはJHBRCからのアルツハイマー病患者2人の脳で検出された（図S2B）。708例中5例（0.71%）の脳でciHHV-6が検出されたというこの観察は、健康なヒト集団の1%未満に存在するという既知の有病率と一致している（Flamand, 2018）。

考察

多くの研究がHHV-6,HSV-1,およびアルツハイマー病との間の関連の証拠を報告しているが（Eimer et al 2018;Haas and Lathe 2018;Itzhaki et al 1997;Lin et al 2002;Liu et al 2018;Lo¨vheim et al 2018;Readhead et al 2018;Rizzo et al 2019;Romeo et al 2019b;Wozniak et al 2019b;Agostini et al 2019b;Wozniak et al 2019)これらの結果は緩和されている。2019; Romeo et al 2019b; Wozniak et al 2009)これらの結果は、わずかな、または全く関連性を見いだした同時代の研究（Agostini et al 2016; Hemling et al 2003)および同定されたウイルスにおける特異性の明らかな欠如によって緩和されている。EBV、CMV、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）などの他のウイルスもまた、脳または血漿のPCR分析（Carbone et al 2014,Lo¨vheim et al 2018,QinおよびLi 2019,Talwar et al 2019）およびバイオインフォマティック分析（Talwar et al 2019）のような技術を介して、アルツハイマー病の発症および進行と関連している（Carbone et al 2014,Lovheim et al 2018,QinおよびLi 2019,Talwar et al 2019）。

アルツハイマー病と関連しているウイルス種の幅広さは、MSBBおよびROSMAP RNA-seqデータセットの我々の分析にも反映されている。EBVおよびCMVなどのウイルスからの転写物は、HHV-6に匹敵する頻度およびPathSeqスコアで検出され、我々の研究は、アルツハイマー病と非アルツハイマー病対照脳との間のHHV-6発現における大きな違いを示唆していなかった。さらに、MSBBコホートでは、HHV-6が検出された脳は、301人中4人、ROSMAPコホートでは605人中2人のみであった。HHV-6 RNAが検出された脳でも、PathSeqのスコアは低かった。ここではPathSeqのスコアが0.5または1の場合はポジティブとしてスコア付けされているが、スコアが高いほど、分類群の参照先にアラインメントしたリードの数に基づいて、その分類群が存在することのより強固な証拠を示していることになる。ゲノム解析ツールキット（GATK）のPathSeqツールを開発したBroad Instituteは、数千のポジティブリードを報告している（Walker er al)。 実際、PathSeqは最近、PathSeqスコアが5,000以上であった致死的脳症の2例（1例はJCV、もう1例はデングウイルス）から得られた脳からウイルスを同定するために使用された（Johnson et al 2019,Reoma et al 2019）。しかしながら、従来の遺伝子発現プロファイリングを目的とし、プロジェクトの目的として病原体の検出およびスクリーニングを含まないバルクRNA-seqプロジェクトデータの分析は、誤解を招く偽陰性の結果をもたらす可能性がある。RNAが収集された場所と時間、および偏ったトランスクリプトームの背景と組み合わせたシークエンスの深さは、それぞれウイルス検出の減少につながる可能性がある。

これらの結果を裏付けるため、解析時にはMSBBとROSMAPのDNA配列データはできなかったが、ROSMAPとJHBRCの両方のコホートからのDNAのddPCRでは、アルツハイマー病群と非アルツハイマー病群の間でHHV-6検出頻度に差は見られなかった。各脳バンクにおけるHHV-6B検出頻度は、病状にかかわらず非常に低いままであった。また、708人のうちHHV-6AのDNAが陽性であったのは1人だけであり、このサンプルは非アルツハイマー病対照群に属しており、HHV-6Aとアルツハイマー病との間に有意な関連性は認められなかった。これまでの研究では、脳内のHHV-6 DNAの検出頻度が高いことが明らかになっているが、この検出頻度は文献によって大きく異なり、検出率は2%から70%の間である（Cermelli et al 2003;Chan et al 2001;Chapenko et al 2016;Hemling et al 2003;Lin et al 2002;Wipfler et al 2018）。このような不一致は、PCR法の違い、異なるPCRプライマーおよびペア配列の違い、および分析された脳領域の違いに関連している可能性がある。これらの研究の大部分は複数の脳領域から採取されたDNAを使用していたが、本研究では背外側前頭前野から採取されたDNAを使用している。

これらの結果は、HHV-6とアルツハイマー病との関連性を示す証拠の論争の的になっている性質に加えている。しかし、我々の結果は、先行研究で発見された関連性の妥当性を否定するものではない。本研究では、対照脳と比較してアルツハイマー病におけるウイルスの頻度をPCRによって直接分析したのに対し、他の著者は、血清中の抗HHV-6 IgGレベル（Agostini et al 2016;Haas and Lathe 2018)またはHHV-6をアルツハイマー病リスク遺伝子座に関連付ける遺伝子のより大きなネットワーク（Readhead et al 2018;Rizzo et al 2019）など、より間接的な測定法を用いた。さらに、RNA-seq解析方法は、品質検査、アダプタークリッピング、品質トリミング、rRNAリードフィルタリング、参照マッピング、および特徴の列挙を含む生のリードファイルの処理のどの段階でも異なることがある。ソースデータは全く同じであるにもかかわらず、1つのステップで異なる方法やルールを使用すると、最終的に異なる結果が得られることがある。同じMSBBやROSMAP RNA-seqデータの解析でも、使用する塩基配列（kmer）の長さ、ホスト参照配列と非ホスト参照配列を区別するkmerの辞書を導出する方法、そして最終的にそれらの辞書が方法間でどのように比較されるかが異なる場合がある。現在のところ、この目的のために著者間で使用されている標準的な一般化されたkmerライブラリは存在しない。むしろ、著者が選択した方法やルールによって作成されたものであり、同じデータセットの解析間での病原体検出のばらつきに貢献している。

我々の結果は、もしウイルス（および特にHHV-6）がアルツハイマー病の発症に役割を果たしているのであれば、その病原体はもはやPCR増幅または十分に発現させることができる形では存在しないかもしれないことを示唆している。むしろ、これらのウイルスは、早期の「引き金となる」イベントに関連しているか、または実験室での検出限界以下のコピー数で存在しているかもしれない。早期の誘発事象は、最近、HHV-6を含む細菌、真菌、およびウイルスに対して抗菌活性を有することが再報告されているアミロイドβ（アミロイドβ）の核生成を含み得る（Bourgade et al 2015,2016;Eimer et al 2018;Kumar et al 2016;Soscia et al 2010;Spitzer et al 2016;White et al 2014）。アミロイドβ包接の核化、例えばヘルペスウイルスウイルスウイルス（Eimer et al 2018）の核化は、アルツハイマー病発症に重要であるかもしれないが、必ずしも完全なウイルスの検出には至らないであろう、したがって、アルツハイマー病患者の脳内で容易に識別可能な病原体の欠如のための潜在的な説明を提供する。

3 つの独立した再ポジトリーからのサンプルを用いた PathSeq と ddPCR という相補的な方法を用いた本研究の結果は、HHV-6 と アルツハイマー病 との関連性を支持するものではないが、それを排除するものでもない。明らかに、本報告書の観察結果は、複数のバイオインフォマティクス解析パイプラインや実験室ベースのツールを用いたより大規模な共同研究に拡大する必要がある。アルツハイマー病の進行と発症におけるHHV-6ウイルスの役割に関する今後の研究では、脳材料の大規模解析ではほとんど検出されないままでありながら、このウイルスが重要な役割を果たすメカニズムに焦点を当てるべきである。